Способ оценки экспрессии phosphatase and tensin homolog (pten) в железах и строме эндометрия

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки экспрессии Phosphatase and Tensin Homolog (PTEN) в железах и строме эндометрия, где определение экспрессии рецепторов PTEN отдельно в железах и строме после постановки реакции с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода и демаскировки антигена проводят с использованием программного обеспечения для виртуального микроскопа с последующим вычислением балла H-Score; изображения анализируют с использованием программного обеспечения; на фото образцов выделяют области, отдельно для стромы и железистой ткани, и пиксельное измерение иммунореактивности проводят с использованием цветового пространства Lab × (яркость [L] и двух цветовых каналов желто-синий и красно-зеленый), затем с помощью команды Analyze → Measure анализируют площадь выделенных пикселей и рассчитывают их процент от общей площади биопрепарата. Способ не требует дорогостоящего оборудования или специальной подготовки врача, а используется программное обеспечение, находящееся в свободном доступе. Изобретение обеспечивает улучшение воспроизводимости и однородности результатов в многоцентровых исследованиях. 3 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии и может быть использовано для оценки экспрессии PTEN в образцах тканей. Изобретение обеспечивает возможность объективной оценки образцов эндометрия с использованием микрофотографий и специального программного обеспечения.

Анализ изображений с помощью компьютерной программы ImageJ 1.50d (Java-based, США) позволяет объективно и оперативно оценить количественные параметры структурных компонентов ткани в гистологических срезах для оценки патологического процесса.

Аналогом изобретения является метод определения H-score (или «гистологического» балла) в образцах опухоли, который заключается в подсчете процента клеток по интенсивности их окрашивания, выраженной в баллах (0, 1+, 2+ или 3+) для каждой клетки в поле зрения при увеличении ×400 или суммы индивидуальных клеток для каждого наблюдаемого уровня интенсивности.

H-score определяется по следующей формуле:

[1 × (% клеток 1+) + 2 × (% клеток 2+) + 3 × (% клеток 3+)]

Окончательная оценка в диапазоне от 0 до 300 дает больший относительный вес более интенсивному окрашиванию данном образце опухоли. Затем выборка может считаться положительной или отрицательной на основе определенного дискриминационного порога (Hirsch FR, Varella-Garcia M, Bunn PA Jr, et al: Epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung carcinomas: Correlation between gene copy number and protein expression and impact on prognosis. J Clin Oncol 21:3798-3807, 2003;

John T, Liu G, Tsao M-S: Overview of molecular testing in non-small-cell lung cancer: Mutational analysis, gene copy number, protein expression and other biomarkers of EGFR for the prediction of response to tyrosine kinase inhibitors. Oncogene 28:S14-S23, 2009.).

Прототипом заявляемого изобретения является способ, предложенный U. Rulle, et al. (2018) для оценки экспрессии PTEN у пациентов с опухолями грудной клетки (Rulle U. Computer-Based Intensity Measurement Assists Pathologists in Scoring Phosphatase and Tensin Homolog Immunohistochemistry - Clinical Associations in NSCLC Patients of the European Thoracic Oncology Platform Lungscape Cohort/ U. Rulle, et al. //. J Thorac Oncol. - 2018. - Vol. 13(12). - P. 1851-1863.). Окрашенные срезы оцифровывали с помощью сканера NanoZoomer Digital Pathology (Hamamatsu, Япония) при максимальном встроенном увеличении ×400. Анализ изображений выполняли при 200-кратном увеличении в программном обеспечении виртуального микроскопа Leica SlidePath. Изображения опухоли анализировали с помощью программного обеспечения Image-J2.28 Пиксельное измерение иммунореактивности проводили с использованием цветового пространства Lab * (яркость [L] и двух цветовых каналов [a, b]). Порог между фоновым коричневым сигналом и оценкой интенсивности окраски 1 был усреднен по 110 репрезентативным кадрам изображения, границы интенсивности определяли по слабо окрашенным срезам (10 кадров), неокрашенным участкам ткани (50 кадров) и окрашиванию без первичного окрашивания. антитела (50 кадров). Этот режим сохранялся для всех дальнейших тестов.

Баллы H-score рассчитывались путем умножения процента площади положительных пикселей на соответствующую интенсивность. В общей сложности 50 границ были нанесены на эпителий опухоли полуавтоматическим способом, в среднем использовались 4 кадра на случай, охватывающие максимально возможные области только опухоли, без вторичных изменений. Для компьютерного анализа всей когорты настройки оставались одинаковыми. Размеры кадра находились в диапазоне 100-500 × 100-500 пикселей (1 мкм = 2,17 пикселей). Данный метод позволяет с высокой точностью оценить солидные опухоли, не включающие железистые или стромальные структуры.

Задачей изобретения является разработка способа оценки экспрессии PTEN в железах и строме эндометрия с последующим вычислением балла H-Score по формуле 1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.

Технический результат: заявляемый способ обеспечивает объективную оценку экспрессии рецепторов PTEN в железах и строме эндометрия.

Указанный технический результат достигается тем, что заявляемый способ оценки, не требует дорогостоящего оборудования или специальной подготовки врача, а использует программное обеспечение, находящееся в свободном доступе. Оценка интенсивности экспрессии в образцах по точной калибровке сигнала позволяет улучшить воспроизводимость и однородность результатов в многоцентровых исследованиях.

Способ поясняется фигурами иллюстраций.

На Фиг. 1 представлена микрофотография эндометрия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision. Окраска - иммуногистохимический метод, полимерная тест-система, увеличение ×200.

В диалоговом окне программы выделена «зона интереса» в строме площадью 2500 пикселей, при увеличении ×200, обработанная в программе ImageJ, где: 1 - железы эндометрия, 2 - строма, 3 - выделяемая зона интереса в строме.

На Фиг. 2 представлено диалоговое окно с калибровкой сигнала для анализа умеренной иммунореактивности в программе ImageJ, где: 4 - канал яркости, 5 - красно-зеленый цветовой канал, 6 - желто-синий цветовой канал, 7 - диапазон, соответствующий умеренной яркости цвета.

На Фиг. 3 представлено диалоговое окно с калибровкой сигнала для анализа слабой иммунореактивности в программе ImageJ, где: 4 - канал яркости, 5 - красно-зеленый цветовой канал, 6 - желто-синий цветовой канал, 7 - диапазон, соответствующий умеренной яркости цвета.

Способ осуществляют следующим образом:

Для иммуногистохимического исследования экспресии PTEN используются серийные парафиновые срезы биоптатов эндометрия (взятых методом пайпель-биопсии на 20-22 день 28-дневного менструального цикла в период предполагаемого «окна имплантации») толщиной 3 мкм. Определение проводится PTEN по стандартной методике с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов фирм «Bond RTU Primary» и «DAКO», США. Проявление реакции осуществляется системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител применяют безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex).

Результаты реакции рецепторов к PTEN (фосфатаза с двойной субстратной специфичностью, продукт гена PTEN) идентифицируются по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Баллы H-score рассчитываются путем умножения процента площади положительных пикселей на соответствующую интенсивность цвета. Анализ изображений проводят при увеличении ×200 на программном обеспечении виртуального микроскопа Axio Zeiss ZEN Blue (Германия). Изображения анализируют с использованием программного обеспечения ImageJ 1.50d (Java-based, США). На фото образцов выделяют области, отдельно для стромы и железистой ткани площадью 2500 пикселей (Фигура 1).

Пиксельное измерение иммунореактивности проводят с использованием цветового пространства Lab × (яркость [L] и двух цветовых каналов желто-синий и красно-зеленый). Белые области, лишенные ткани исключают в канале яркости, синие области - с помощью канала цветового регулирования. Результирующий коричневый сигнал затем располагают между красным и желтым, после этого выделяют порог между фоновым коричневым сигналом и показателем интенсивности специфической иммунореактивности. Текущий фоновый режим сохраняется для всех дальнейших анализов (Фигура 2, Фигура 3).

Затем с помощью команды Analyze → Measure анализируют площадь выделенных пикселей, и рассчитывают их процент от общей площади препарата.

Для проверки предложенного способа оценки экспрессии PTEN в эндометрии было использовано 158 образцов с проведением обычного подсчета балла по шкале H-score и вычислением с помощью компьютерных измерений интенсивности, откалиброванного сигнала.

Проверку корреляционных взаимодействий проводили с помощью программы IBM SPSS Statistics 26 попарно для желез и для стромы с использованием корреляции Пирсона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты сравнения представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Анализ средних значений, полученных методом рутинного подсчета и с помощью метода компьютерной морфометрии
Показатель	Ручной метод	Анализ изображений с помощью программы ImageJ
Среднее (M)	Стандартное отклонение (SD)	Среднее (M)	Стандартное отклонение (SD)
Экспрессия PTEN в железах	100,14	67,6	75,3	62,0
Экспрессия PTEN в строме	155,8	61,6	113,8	59,3

Примечание: уровень статистической значимости (р) > 0,05 во всех случаях.

Таблица 2. Анализ корреляции результатов, полученных методом рутинного подсчета и методом компьютерной морфометрии
Показатели	Железы	Строма
Корреляция Пирсона	Коэффициент корреляции	0,719**	0,571**
Знач. (двухсторонняя)	2,0E-26	4,9E-15
Ро Спирмена	Коэффициент корреляции	0,704**	0,562**
Знач. (двухсторонняя)	5,7E-25	1,6E-14

**. Корреляция значима на уровне 0,01 (двухсторонняя).

Способ оценки экспрессии Phosphatase and Tensin Homolog (PTEN) в железах и строме эндометрия, отличающийся тем, что определение экспрессии рецепторов PTEN отдельно в железах и строме после постановки реакции с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода и демаскировки антигена проводят с использованием программного обеспечения для виртуального микроскопа с последующим вычислением балла H-Score по формуле 1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах, где процент представляет процент площади положительных пикселей; изображения анализируют при увеличении ×200 с использованием программного обеспечения ImageJ 1.50d; на фото образцов выделяют области, отдельно для стромы и железистой ткани площадью 2500 пикселей, и пиксельное измерение иммунореактивности проводят с использованием цветового пространства Lab × (яркость [L] и двух цветовых каналов желто-синий и красно-зеленый), а белые области, лишенные ткани исключают в канале яркости, синие области - с помощью канала цветового регулирования, затем результирующий коричневый сигнал располагают между красным и желтым, с последующим выделением порога между фоновым коричневым сигналом и показателем интенсивности специфической иммунореактивности, затем с помощью команды Analyze → Measure анализируют площадь выделенных пикселей и рассчитывают их процент от общей площади биопрепарата.