Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои



Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои
Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои
Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои
Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои
Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои

Владельцы патента RU 2748688:

ПЕРДЬЮ РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН (US)
ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи (US)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации растения сои, которое проявляет повышенную устойчивость к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR). Также раскрыт способ селекции с помощью маркера. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать растение сои, которое проявляет повышенную устойчивость к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR). 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 табл., 7 пр., 3 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка претендует на приоритет на основании предварительной заявки США № 62/170441, поданной 3 июня 2015 года, которая включена в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Официальная копия перечня последовательностей подана в электронном виде через программу EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с именем файла «77970-WO-PCT_ST25_SEQUENCE_LISTING.txt», созданного 06/01/2016 и имеющего размер 15,7 килобайт, одновременно с описанием изобретения. Перечень последовательностей, содержащийся в этом документе формата ASCII, является частью описания изобретения и включен в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Рассматриваемый в данном документе объект настоящего изобретения относится к способам, пригодным для повышения устойчивости к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora, у растений сои.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] О гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR), вызванной передающимся через почву патогеном Phytophthora sojae, сообщалось в большинстве районов выращивания сои в мире, с момента первого фиксирования случая встречаемости данной гнили в штате Индиана в 1948 г. и затем в Огайо в 1951 г. (Dorrance et al. 2007; Erwin and Ribeiro 1996, Kaufmann and Gerdemann, 1958; Schmitthenner, 1985). PRSR была классифицирована как второе наиболее разрушительное заболевание сои после соевой цистообразующей нематоды (SCN), которая снижала урожай сои в Соединенных Штатах с 1996 по 2009 гг., что приводило к ежегодным потерям урожая в 44,7 млн бушлей (Koenning and Wrather 2010; Wrather and Koenning 2009).

[0005] Разработка расоспецифически устойчивых сортов сои является основной стратегией управления PRSR, поскольку данная стратегия высокоэффективна и экономически и экологически безопасна для снижения потерь урожая сои вследствие болезни, обусловленной Phytophthora (Dorrance et al., 2007; Dorrance and Schmitthenner 2000; Schmitthenner 1999). В настоящее время идентифицировано приблизительно 25 генов/аллелей Rps, распределенных по 19 локусам в восьми различных хромосомах. На хромосоме 3 (Chr. 3) (MLG N) картировано наибольшее количество генов/аллелей Rps, включая Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps7, Rps9, RpsUN1, RpsYu25, RpsYD29 и ген Rps без названия, описанный в японском сорте Waseshiroge (Demirbas et al., 2001; Fan et al., 2009; Gao et al., 2005; Lin et al., 2013; Sugimoto et al., 2011; Sun et al., 2011; Weng et al., 2001; Wu et al. 2011a; Yao et al., 2010; Zhang et al., 2013). Два гена Rps, а именно Rps2 и RpsUN2, картированы на конце Chr. 16 (MLG J), что является хорошо известным кластерным участком генов устойчивости (Kanazin et al., 1996;Lin et al., 2013;Polzin et al.,1994). Интересно отметить, что Rps3 (содержащий три аллели 3-a, 3-b, 3-c) и Rps 8 картированы на Сhr. 13 (MLG F) в другом богатом на гены устойчивости участке (Demirbasetal.2001;Gordonetal.2006). RpsJS, недавно идентифицированный ген Rps, сцеплен с Rps4, Rps5 и Rps6, и все они расположены на коротком плече Chr. 18 (MLG G) (Demirbas et al., 2001; Sandhu et al., 2004;Sun et al., 2014). Кроме того, RpsYB30, Rps ZS18, RpsSu и Rps10 картированы, соответственно, на Chr. 19 (MLG L),Chr. 2 (MLG D1b),Chr. 10 (MLG O) и Chr. 17 (MLG D2) (Wuetal.2011b;Yaoetal.2010; Zhangetal.2013;Zhuetal.2007).

[0006] Многие из этих генов Rps уже успешно внедрены в программы разведения растений сои для контроля PRSR. Тем не менее эти гены могут быть эффективными только в течение 8-15 лет из-за быстрого и непрерывного эволюционирования патогена под давлением отбора (Schmitthenner 1985). Кроме того, пирамидирование известных генов Rps в одном сорте не может быть эффективной долгосрочной стратегией разведения растений, поскольку рекомбинирующая популяция патогенов может создавать новые комбинации вирулентных аллелей так же быстро, как селекционеры комплектуют гены устойчивости (McDonaldandLinde 2002). Поэтому по-прежнему необходима идентификация новых генов Rps для эффективного лечения болезни, обусловленной Phytophthora.

[0007] В данном раскрытии идентифицирован новый локус устойчивости к Phytophthora. Также идентифицированы маркеры, сцепленные с раскрытым новым локусом устойчивости к Phytophthora. Маркеры, сцепленные с новым локусом устойчивости к Phytophthora, включают SSR, InDel и SNP. Маркеры, идентифицированные в данном раскрытии, могут использоваться для генотипирования устойчивости к Phytophthora для поддержки программы разведения растений. Использование описанных в данном документе маркеров для выполнения генотипирования устойчивости к Phytophthora в поддержку программы разведения растений обеспечивает, помимо других преимуществ, экономию затрат и времени; ранний отбор желаемого потомства и более точную и быструю коммерциализацию устойчивых к Phytophthora разновидностей сои. В данном документе также описаны кандидатные гены, лежащие в основе фенотипа нового локуса устойчивости к Phytophthora.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] В одном варианте осуществления представлены способы идентификации растения сои, проявляющего повышенную устойчивость к PRSR, которые включают обнаружение в зародышевой плазме растения сои по меньшей мере одного аллеля маркерного локуса. Маркерный локус находится на хромосоме 7 и расположен в пределах хромосомного интервала, содержащего BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и фланкированного ними, при этом по меньшей мере один аллель ассоциирован с повышенной устойчивостью к PRSR. В некоторых конкретных вариантах осуществления маркерный локус может быть выбран из любого из следующих маркерных локусов: BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, а также любого другого маркера, сцепленного с данными маркерами. В некоторых вариантах осуществления маркерный локус находится на хромосоме 7, и расположен в пределах интервала, содержащего BARCSOYSSR_07_0295 и InDel_1 и фланкированного ними, и содержит по меньшей мере один аллель, ассоциированный с повышенной устойчивостью к PRSR. В некоторых конкретных вариантах осуществления маркерный локус может быть выбран из любого из следующих маркерных локусов: BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel2 и InDel_1, а также любого другого маркера, сцепленного с данными маркерами. В некоторых вариантах осуществления маркерный локус содержит ген, выбранный из группы, состоящей из Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 и Glyma.07G62900. Также представляют интерес растения сои, идентифицированные с помощью данного способа.

[0009] В другом варианте осуществления представлены способы идентификации растений сои с повышенной устойчивостью к PRSR путем обнаружения гаплотипа в зародышевой плазме растения сои. Гаплотип включает аллели в одном или более маркерных локусах, где один или более маркерных локусов располагаются на хромосоме 7 в пределах интервала, содержащего BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и фланкированного ними. В некоторых конкретных вариантах осуществления маркерный локус может быть выбран из любого из следующих маркерных локусов: BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, а также любого другого маркера, сцепленного с данными маркерами. В некоторых вариантах осуществления гаплотип включает аллели в одном или более маркерных локусах, при этом один или более маркерных локусов располагаются на хромосоме 7 в пределах интервала, содержащего BARCSOYSSR_07_0295 и InDel_1 и фланкированного ними. В некоторых конкретных вариантах осуществления маркерный локус может быть выбран из любого из следующих маркерных локусов: BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_1 и InDel_1, а также любого другого маркера, сцепленного с данными маркерами. Гаплотип ассоциирован с повышенной устойчивостью к PRSR. В некоторых вариантах осуществления маркерный локус содержит ген, выбранный из группы, состоящей из Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 и Glyma.07G62900. Также представляют интерес растения сои, идентифицированные с помощью данного способа.

[0010] В дополнительном варианте осуществления представлены способы отбора растений с повышенной устойчивостью к PRSR. В одном аспекте получают первое растение сои, которое содержит по меньшей мере один аллель маркерного локуса, при этом аллель ассоциирован с повышенной устойчивостью к PRSR. Маркерный локус может быть расположен на хромосоме 7 в пределах интервала, содержащего BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и фланкированного ними, и в некоторых конкретных вариантах осуществления маркерный локус может быть расположен в пределах интервала, содержащего BARCSOSSR_07_0295 и InDel_1 и фланкированного ними. Первое растение сои можно скрестить со вторым растением сои, а потомство, полученное посредством скрещивания, можно оценить по аллели первого растения сои. Растения потомства, которые содержат аллель из первого растения сои, могут быть отобраны как растения, характеризующиеся повышенной устойчивостью к PRSR. В некоторых вариантах осуществления маркерный локус содержит ген, выбранный из группы, состоящей из Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 и Glyma.07G62900. Также интерес представляют растения сои, выбранные с помощью данного метода.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ И ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0011] Объект настоящего изобретения быть более полно понят из нижеследующего подробного описания изобретения и прилагаемых графических материалов, а также списка последовательностей, которые составляют часть этой заявки. Перечень последовательностей предусматривает однобуквенный код для символов нуклеотидной последовательности и трехбуквенный код для аминокислот, как указано в соответствии со стандартами IUPAC-IUBMB, описанными в Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) и в Biochemical Journal 219 (No. 2): 345-373 (1984), которые включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. Символы и формат, используемые для данных нуклеотидной и аминокислотной последовательности, соответствуют правилам, изложенным в 1.822 раздела 37 C.F.R. (Свода нормативных актов федеральных органов исполнительной власти США).

[0012] На Фигуре 1 показано местоположение Rps11, основанное на неоднородном распределении SNP между устойчивыми и восприимчивыми группами. Ось y обозначает три разных типа SNP на Chr. 07. T1 представляет собой SNP, являющиеся гомозиготными, в качестве восприимчивых аллелей Williams. T3 представляет собой SNP, являющиеся гомозиготными, в качестве устойчивых аллелей PI 594527. Т2 представляет собой SNP, являющиеся гетерозиготными, с аллелями от двоих родителей. Ось x показывает физическое положение SNP. Интервал между а и b обозначает потенциальный участок Rps11.

[0013] На Фигуре 2 показаны генетические и физические карты Rps11 на Chr. 7. На Фигуре 2(а) показана генетическая карта сцепления для Rps11. Названия маркеров указаны по левую сторону, а генетическое расстояние (cM) - по правую. *Сокращение для «BARCSOYSSR_07_0241». На Фигуре 2(b) показано физическое расположение SSR-маркеров, определенное с помощью программы BLAST посредством поиска последовательностей их праймеров по отношению к эталонному геному сои (Glyma1.1) на веб-сайте SoyBase. Цифры в скобках указывают на стартовое положение маркера в парах оснований (п.о.). Интервал Rps11 выделен черным цветом. На Фигуре 2(с) показано физическое расположение интервала Rps11 в эталонном геноме Williams 82. Столбики обозначают два плеча Chr. 07, а круг указывает приблизительное положение центромерного участка.

[0014] На Фигуре 3 показаны участок размером 61 т.о. на хромосоме 7, содержащей локус Rps11, ассоциированные маркеры и пять моделей генов, предполагаемых в участке. Показаны карты 10 рекомбинантов F3.

[0015] SEQ ID NO: 1-33 и 54 представляют собой последовательности, фланкирующие и содержащие SNP, используемые для разработки анализов на SoySNP8K BeadChip и/или для генотипирования KASP™.

[0016] SEQ ID NO: 34-53 и 55-60 являются прямыми и обратными праймерами для SSR-маркеров, картированных на хромосоме 7.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0017] Объект настоящего изобретения относится к способам идентификации и отбора растений сои с повышенной устойчивостью к PRSR. Следующие определения предоставлены в качестве вспомогательных для понимания объекта настоящего изобретения, раскрытого в данном документе.

Определения

[0018] Термин «аллель» относится к одной из двух или более различных нуклеотидных последовательностей, которые встречаются в определенном локусе. Аллель «ассоциирован с» признаком, когда он сцеплен с ним и когда наличие аллеля является индикатором того, что желаемый признак или форма признака встретятся в растении, содержащем аллель.

[0019] «Обратное скрещивание» относится к способу, используемому для внедрения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Методика обратного скрещивания широко использовалась на протяжении десятилетий для внедрения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В стандартном протоколе обратного скрещивания интересующий изначальный сорт (рекуррентный родитель) скрещивают со вторым сортом (нерекуррентный родитель), который несет подлежащий передаче ген, представляющий интерес. Потомство, полученное от этого скрещивания, затем снова скрещивают с рекуррентным родителем, и способ повторяют до получения растения, в котором фактически все желаемые морфологические и физиологические характеристики рекуррентного растения собраны в преобразованном растении, в дополнение к перенесенному гену от нерекуррентного родителя.

[0020] Сантиморган («cM») - это единица измерения частоты рекомбинации. Один cM равен 1% вероятности того, что маркер в одном генетическом локусе будет отделен от маркера во втором локусе из-за кроссинговера в одном поколении.

[0021] «Хромосомный интервал» обозначает непрерывный линейный отрезок геномной ДНК, которая находится в одной хромосоме растения. Генетические элементы или гены, расположенные в одном хромосомном интервале, физически сцеплены. Размер хромосомного интервала, в частности, не ограничен. В некоторых аспектах изобретения генетические элементы, расположенные в пределах одного хромосомного интервала, генетически сцеплены, как правило, с расстоянием генетической рекомбинации, например, равным 20 сМ или меньше, или альтернативно равным 10 сМ или меньше. То есть два генетических элемента в пределах одного хромосомного интервала подвергаются рекомбинации с частотой, равной 20% или 10% или меньше.

[0022] Термин «хромосомный интервал» обозначает любые возможные интервалы, определенные любым из маркеров, указанных в содержании настоящего изобретения. Представлен хромосомный интервал, который коррелирует с повышенной устойчивостью к PRSR. Этот интервал, расположенный на хромосоме 7, содержит BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и фланкирован ними. Подынтервалом хромосомного интервала от BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T до BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C является интервал от BARCSOYSSR_07_0295 до InDel_1.

[0023] Термин «комплемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая комплементарна данной нуклеотидной последовательности, то есть последовательности связаны правилами спаривания оснований.

[0024] Термин «непрерывная ДНК» относится к перекрывающимся непрерывным генетическим фрагментам.

[0025] Термин «скрещенный» или «скрестить» означает слияние гамет посредством опыления с получением потомства (например, клеток, семян или растений). Этот термин охватывает как половое скрещивание (опыление одного растения другим), так и самооплодотворение (самоопыление, например, когда пыльца и яйцеклетка находятся в одном и том же растении). Термин «скрещивание» относится к процессу объединения гамет посредством опыления с получением потомства.

[0026] «Благоприятный аллель» представляет собой аллель в определенном локусе, который обеспечивает или способствует желаемому фенотипу, например, повышенной устойчивости к PRSR, или альтернативно аллель, который позволяет идентифицировать растения со сниженной устойчивостью к PRSR, который может быть изъят из программы разведения растений или посадки («контрселекция»). Благоприятным аллеллем маркера является маркерный аллель, который сегрегирует с благоприятным фенотипом или альтернативно неблагоприятным фенотипом растения, поэтому обеспечивает преимущество идентификации растений.

[0027] «Генетическая карта» представляет собой описание связей, обусловленных генетическими сцеплениями между локусами на одной или более хромосомах (или хромосомах) в пределах данного вида, как правило, в виде диаграммы или табличной формы. Для каждой генетической карты расстояния между локусами измеряются по частотам рекомбинации между ними, а рекомбинации между локусами могут быть обнаружены с использованием множества молекулярно-генетических маркеров (также называемых «молекулярными маркерами», «генетическими маркерами» или просто «маркерами»). Генетическая карта является продуктом популяции для картирования, используемых типов маркеров и полиморфного потенциала каждого маркера между различными популяциями. Порядок и генетическое расстояние между локусами изменяется от одной генетической карты к другой. Однако информация, такая как положение и порядок маркера, может быть скоррелирована между картами при определении физического местоположения маркеров на интересующей хромосоме с использованием эталонного генома сои, такого как, например, Glyma1.1, который является общедоступным на сайте SoyBase. Специалист в данной области техники может использовать общедоступный геномный браузер для определения физического местоположения маркеров на хромосоме.

[0028] Термин «генетический маркер» относится к любому типу маркера на основе нуклеиновой кислоты, включая без ограничения полиморфизм длин фрагментов рестрикции (RFLP), простые повторяющиеся последовательности (SSR), произвольно амплифицированную полиморфную ДНК (RAPD), расщепленную амплифицированную полиморфную последовательность (CAPS) (Rafalski and Tingey, 1993, Trends of Genetics, 9:275-280), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP) (Vos et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:4407-4414), однонуклеотидный полиморфизм (SNP) (Brooke, 1999, Gene 234:177-186), амплифицированные области, охарактеризованные секвенированием (SCAR) (Pecan and Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet, 85:985-993), ДНК-маркирующий сайт (STS) (Onozaki et al.. 2004, Euphytica 138:255-262), конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК (SSCP) (Orita et al., 1989, Proc Natl Aced Sci USA, 86:2766-2770). Внутренние простые повторяющиеся последовательности (ISR) (Blair et al., 1999, Theor. Appl. Gen., 98:780-792), полиморфизм амплифицированных последовательностей между транспозонами (IRAP), полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозоном и микросателлитом (REMAP) (Kalendar et al., 1999, Theor. Appl. Genet 98:704-711), продукт расщепления РНК (такой как Lynx-маркер) и тому подобное.

[0029] «Частота генетической рекомбинации» представляет собой частоту событий кроссинговера (рекомбинации) между двумя генетическими локусами. Частоту рекомбинации можно наблюдать по последующей сегрегации маркеров и/или признаков после мейоза.

[0030] «Геном» относится к общей ДНК или всему набору генов, переносимых хромосомой или набором хромосом.

[0031] Термин «генотип» представляет собой генетическую конституцию индивидуума (или группы индивидуумов) в одном или более генетических локусах по сравнению с наблюдаемым признаком (фенотип). Генотип определяется аллелем (аллелями) одного или более известных локусов, которые индивидуум унаследовал от своих родителей. Термин «генотип» может использоваться для обозначения генетической конституции индивидуума в одном локусе, или, в более общем плане, термин генотип может использоваться для обозначения организации генетического материала индивидуума для всех генов в его геноме.

[0032] «Зародышевая плазма» относится к генетическому материалу индивидуума (например, растения), группы индивидуумов (например, линий растений, сортов или семейств) или клона, полученного из линии, разновидности, вида или культуры. Зародышевая плазма может быть частью организма или клетки или может быть отделена от организма или клетки. В общем, зародышевая плазма обеспечивает генетический материал с определенным молекулярным составом, который обеспечивает физическую основу для некоторых или всех наследственных качеств организма или клеточной культуры. Используемый в данном документе термин «зародышевая плазма» включает клетки, семена или ткани, из которых могут быть выращены новые растения или части растений, такие как листья, стебли, пыльца или клетки, которые можно культивировать в целое растение.

[0033] «Гаплотип» представляет собой генотип индивидуума во множестве генетических локусов, т.е. комбинацию аллелей. Как правило, генетические локусы, описанные гаплотипом, физически и генетически сцеплены, то есть располагаются на одном и том же сегменте хромосомы. Термин «гаплотип» может относиться к полиморфизмам последовательности в конкретном локусе, таком как одиночный маркерный локус, или полиморфизмам последовательности в нескольких локусах вдоль хромосомного сегмента в данном геноме. Первые можно также обозначить как «маркерные гаплотипы» или «маркерные аллели», в то время как последние можно обозначить как «гаплотипы большой протяженности».

[0034] Термин «гетерозиготный» означает генетическое состояние, при котором различные аллели находятся в соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

[0035] Термин «гомозиготный» означает генетическое состояние, при котором идентичные аллели находятся в соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

[0036] «Гибридизация» или «гибридизация нуклеиновых кислот» относятся к спариванию комплементарных цепей РНК и ДНК, а также к спариванию комплементарных одноцепочечных ДНК.

[0037] Термин «гибридизация» означает образование пар оснований между комплементарными участками цепей нуклеиновых кислот.

[0038] Термин «интрогрессия» или «интрогрессирование» относится к передаче желаемого аллеля генетического локуса из одного фонового генотипа в другой. Например, интрогрессия желаемого аллеля в конкретном локусе может быть передана по меньшей мере одному потомству через половое скрещивание между двумя родителями того же вида, где по крайней мере один из родителей имеет желаемый аллель в своем геноме. Альтернативно, например, передача аллеля может происходить путем рекомбинации между двумя донорными геномами, например, в конденсированном протопласте, где по меньшей мере один из протопластов-доноров имеет желаемый аллель в своем геноме. Желаемый аллель может представлять собой, например, выбранный аллель маркера, локусы количественных признаков (QTL), трансген и т.п. В любом случае потомство, содержащее желаемый аллель, может быть подвергнуто обратному скрещиванию с линией, имеющей желаемый фоновый генотип и выбранной относительно желаемого аллеля, чтобы аллель закрепился в выбранном фоновом генотипе. Например, описанный в данном документе локус хромосомы 7 может быть интрогрессирован в рекурретного родителя, который восприимчив к PRSR. Рекуррентная родительская линия с интрогрессированным геном или локусом затем имеет повышенную устойчивость к PRSR.

[0039] Используемые в данном документе термины «сцепление» или «сцепленный» используются для описания степени, в которой один маркерный локус ассоциирован с другим маркерным локусом или некоторым другим локусом (например, локусом PRSR). Характеристика сцепления между молекулярным маркером и фенотипом указана как «вероятность» или «скорректированная вероятность». Сцепление может быть выражено как желаемый предел или диапазон. Например, в некоторых вариантах осуществления любой маркер сцеплен (генетически и физически) с любым другим маркером, когда маркеры разделены менее чем на 50, 40, 30, 25, 20 или 15 единиц картирования, cM). В некоторых аспектах изобретения преимущественным является определение ограниченного диапазона сцепления, например, от 10 до 20 сМ, от 10 до 30 сМ или от 10 до 40 сМ. Чем ближе маркер сцеплен со вторым локусом, тем лучшим является индикатор второго локуса, которым становится маркер. Таким образом, «тесно сцепленные локусы», такие как маркерный локус и второй локус, отображают частоту рекомбинации между локусами, составляющую 10% или менее, предпочтительно приблизительно 9% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 8% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 7% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 6% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 5% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 4% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 3% или менее и еще более предпочтительно приблизительно 2% или менее. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления соответствующие локусы отображают частоту рекомбинации приблизительно 1% или менее, например, приблизительно 0,75% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,5% или менее или еще более предпочтительно приблизительно 0,25% или менее. Два локуса, локализованные в одной и той же хромосоме и на таком расстоянии, что рекомбинация между двумя локусами происходит с частотой менее 10 (например, приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или менее), также называются «близкими» друг к другу. Поскольку один cM представляет собой расстояние между двумя маркерами, которое показывает частоту рекомбинации в 1%, любой маркер тесно сцеплен (генетически и физически) с любым другим маркером, который находится в непосредственной близости, например, на расстоянии менее 10 cM. Два тесно сцепленных маркера на одной и той же хромосоме могут быть расположены на расстоянии 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 или 0,25 сМ или менее друг от друга.

[0040] Термин «неравновесное сцепление» относится к неслучайной сегрегации генетических локусов или признаков или обоих. В любом случае неравновесное сцепление подразумевает, что соответствующие локусы находятся в пределах достаточной физической близости вдоль длины хромосомы, так что они совместно сегрегируют с большей, чем случайная (то есть неслучайной), частотой (в случае совместно сегрегирующих признаков локусы, которые лежат в основе признаков, находятся в достаточной близости друг к другу). Маркеры, которые показывают неравновесное сцепление, считаются сцепленными. Сцепленные локусы совместно сегрегируют более чем в 50% случаев, например, от примерно 51% до примерно 100% случаев. Другими словами, два маркера, которые совместно сегрегируют, имеют частоту рекомбинации менее 50% (и по определению разделены расстоянием менее чем 50 сМ на одной и той же хромосоме). В контексте данного документа сцепление может быть между двумя маркерами или альтернативно между маркером и фенотипом. Маркерный локус может быть «ассоциирован с» (сцеплен с) признаком, например, повышенной устойчивостью к PRSR. Измеряется степень сцепления молекулярного маркера с фенотипическим признаком, например, как статистическая вероятность совместной сегрегации этого молекулярного маркера с фенотипом.

[0041] Неравновесное сцепление наиболее часто оценивается с измерением параметра r2, который рассчитывается по формуле, описанной Hill, W.G. and Robertson, A, Theor Appl. Genet 38:226-231 (1988). Когда r2=1, имеет место полное LD между двумя маркерными локусами, что означает, что маркеры не разделены рекомбинацией и имеют одинаковую частоту аллеля. Значения r2 выше 1/3 указывают на достаточно сильное LD, чтобы быть пригодным для картирования (Ardlie at al., Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). Следовательно, аллели находятся в неравновесном сцеплении, если значения r2 между парными маркерными локусами больше или равны 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0.

[0042] Используемый в данном документе термин «равновесное сцепление» описывает ситуацию, когда два маркера независимо сегрегируют, то есть распределяются среди потомства случайным образом. Маркеры, которые показывают равновесность сцепления, считаются несцепленными (не имеет значение, расположены на одной хромосоме или разных).

[0043] «Логарифм значения шансов» (LOD) или «LOD-показатель» (Risch, Science 255:803-804 (1992)) используется для интервального картирования с целью описания степени сцепления между двумя маркерными локусами. LOD-показатель со значением «три» между двумя маркерами указывает на то, что наличие сцепления в 1000 раз более вероятно, чем отсутствие сцепления, в то время как LOD-показатель со значением «два» указывает на то, что сцепление в 100 раз более вероятно, чем его отсутствие. LOD-показатель со значением более чем два или равным двум может быть использован для определения сцепления.

[0044] «Локус» и «маркерный локус» используются в данном документе взаимозаменяемо и означают положение на хромосоме, где расположен ген и/или маркер.

[0045] Используемый в данном документе термин «популяция для картирования» может относиться к популяции растений, используемой для картирования генов. Популяции для картирования обычно получают из контролируемого скрещивания родительских генотипов. Решения об отборе родителей и схеме спаривания для разработки популяции для картирования, а также тип используемых маркеров зависят от гена, который нужно картировать, доступности маркеров и молекулярной карты. В популяции для картирования родители растений должны характеризоваться достаточным изменением признака (признаков), представляющего (представляющих) интерес, как для последовательности нуклеиновой кислоты, так и для уровня фенотипа. Изменение последовательности нуклеиновых кислот у родителей используется для отслеживания событий рекомбинации в растениях популяции для картирования. Доступность информативных полиморфных маркеров зависит от количественного значения изменений в последовательности нуклеиновых кислот.

[0046] «Маркер» представляет собой нуклеотидную последовательность или ее кодированный продукт (например, белок), используемые в качестве исходной точки. Для того, чтобы маркеры были пригодны для обнаружения рекомбинаций, они должны обнаруживать различия или полиморфизмы в пределах контролируемой популяции. Для молекулярных маркеров это означает различия на уровне ДНК, связанные с различиями в последовательности полинуклеотидов (например, SSR, RFLP, FLP, SNP). Геномная изменчивость может иметь любое происхождение, например, вставки, делеции, дупликации, повторяющиеся элементы, точечные мутации, события рекомбинации или наличие и последовательность транспозируемых элементов. Молекулярные маркеры могут быть получены из геномных или экспрессированных нуклеиновых кислот (например, EST) и могут также относиться к нуклеиновым кислотам, используемым в качестве зондов или праймерных пар, способных амплифицировать фрагменты последовательности с использованием методов на основе ПЦР. Из уровня техники известно большое количество молекулярных маркеров сои, и они опубликованы или доступны из различных источников, таких как интернет-ресурс SoyBase.

[0047] Маркеры, соответствующие генетическим полиморфизмам между представителями популяции, могут быть обнаружены способами, хорошо известными из уровня техники. К ним относятся, например, секвенирование ДНК, методы амплификации специфической последовательности, основанные на ПЦР, обнаружение полиморфизмов длин фрагментов рестрикции (RFLP), обнаружение изоферментных маркеров, обнаружение полинуклеотидных полиморфизмов с помощью аллель-специфической гибридизации (ASH), обнаружение амплифицированных вариабельных последовательностей генома растений, обнаружение самоподдерживающейся репликации последовательностей, обнаружение простых повторяющихся последовательностей (SSR), обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или обнаружение полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (AFLP). Также хорошо известны методы для обнаружения маркеров экспрессируемых последовательностей (EST) и SSR-маркеров, полученных из EST-последовательностей и произвольно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD).

[0048] «Маркерный аллель», альтернативно «аллель маркерного локуса», может относиться к одной из множества полиморфных нуклеотидных последовательностей, обнаруженных в маркерном локусе в популяции, которая является полиморфной для маркерного локуса.

[0049] «Селекция с помощью маркера» (или MAS) - это способ, посредством которого фенотипы отбирают на основе маркерных генотипов.

[0050] «Контрселекция с помощью маркера» - это способ, посредством которого маркерные генотипы используют для идентификации растений, которые не будут отобраны, обеспечивая возможность изъятия их из программы разведения или посадки.

[0051] «Маркерный локус» представляет собой специфическое хромосомное расположение в геноме вида, по которому можно найти конкретный маркер. Маркерный локус может использоваться для отслеживания наличия второго сцепленного локуса, например, сцепленного локуса, который кодирует или способствует экспрессии фенотипического признака. Например, маркерный локус может использоваться для контроля сегрегации аллелей в локусе, таком как QTL или единичный ген, которые генетически или физически сцеплены с маркерным локусом.

[0052] «Маркерный зонд» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или молекулу, которые могут использоваться для идентификации наличия маркерного локуса, например, зонда нуклеиновой кислоты, который является комплементарным последовательности маркерного локуса, посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой. Маркерные зонды, содержащие 30 или более смежных нуклеотидов маркерного локуса («все или часть» последовательности маркерного локуса), могут использоваться для гибридизации нуклеиновых кислот. В альтернативном варианте некоторых аспектов изобретения маркерный зонд относится к зонду любого типа, который способен различать (т.е. генотипировать) конкретный аллель, который находится в маркерном локусе.

[0053] Термин «молекулярный маркер» может использоваться для обозначения генетического маркера, как определено выше, или его кодированного продукта (например, белка), используемых в качестве исходной точки при идентификации сцепленного локуса. Маркер может быть получен из геномных нуклеотидных последовательностей, или из экспрессированных нуклеотидных последовательностей (например, из сплайсированной РНК, кДНК и т.д.), или из кодированного полипептида. Термин также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, комплементарным маркерным последовательностям или фланкирующим их, таким как нуклеиновые кислоты, используемые в качестве зондов или пар праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность. «Молекулярный маркерный зонд» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или молекулу, которые могут использоваться для идентификации наличия маркерного локуса, например, зонда нуклеиновой кислоты, комплементарного последовательности маркерного локуса. Альтернативно в некоторых аспектах маркерный зонд относится к зонду любого типа, который способен различать (т.е. генотипировать) конкретный аллель, который находится в маркерном локусе. Нуклеиновые кислоты являются «комплементарными», если они специфически гибридизируются в растворе, например, согласно правилам спаривания оснований по Уотсону-Крику. Некоторые из описанных в данном документе маркеров также обозначаются как маркеры гибридизации, если они расположены в участке вставки/делеции, таком как неколлинеарный участок, описанный в данном документе. Это связано с тем, что участок вставки является, по определению, полиморфизмом в отношении растения без вставки. Таким образом, маркер должен указывать только на наличие или отсутствие участка вставки/делеции. Любая подходящая технология обнаружения маркеров может использоваться для идентификации такого маркера гибридизации, например, в приведенных в данном документе примерах использована SNP-технология.

[0054] «Нуклеотидная последовательность», «полинуклеотид», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «фрагмент нуклеиновой кислоты» используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухцепочечным, необязательно содержащим синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. «Нуклеотид» представляет собой мономерную единицу, из которой построены ДНК или РНК-полимеры, и состоит из пуринового или пиримидинового основания, пентозы и группы фосфорной кислоты. Нуклеотиды (обычно встречающиеся в их 5'-монофосфатной форме) обозначаются однобуквенным кодом следующим образом: «А» - аденилат или дезоксиаденилат (для РНК или ДНК, соответственно), «С» - цитидилат или дезоксицитидилат. «G» - гуанилат или дезоксигуанилат. «U» - уридилат, «T» - дезокситимидилат, «R» - пурины (A или G), «Y» - пиримидины (C или T), «K»- G или T, «H» - A, или C, или T, I - инозин и N - любой нуклеотид.

[0055] Термины «фенотип» и «фенотипический признак» или «признак» относятся к одному или нескольким признакам организма. Фенотип поддается наблюдению невооруженным глазом или с помощью любого другого способа оценки, известного из уровня техники, например, посредством микроскопа, биохимического анализа или электромеханического анализа. В некоторых случаях фенотип непосредственно контролируется одним геном или генетическим локусом, т.е. является «признаком единичного гена». В других случаях фенотип является результатом нескольких генов.

[0056] «Физическая карта» генома представляет собой карту, показывающую линейный порядок идентифицируемых меток (включая гены, маркеры и т.д.) на хромосомной ДНК. Однако в отличие от генетических карт, расстояния между метками являются абсолютными (например, измеренные в парах оснований или выделенные и перекрывающиеся смежные генетические фрагменты), а не основанными на генетической рекомбинации.

[0057] «Растение» может быть целым растением, любой его частью или культурой клеток или ткани, полученной из растения. Таким образом, термин «растение» может относиться к любому из целого растения, компонентов или органов растения (например, листьев, стеблей, корней и т.д.), тканей, семян растения, растительных клеток и/или их потомству. Растительная клетка представляет собой клетку растения, взятую из растения или полученную из культуры от клетки, взятой из растения.

[0058] «Полиморфизм» представляет собой изменение в ДНК, которое слишком распространено, чтобы быть обусловленным только новой мутацией. Полиморфизм должен иметь частоту не менее 1% в популяции. Полиморфизм может представлять собой однонуклеотидный полиморфизм или SNP или полиморфизм по типу вставки/делеции, также упоминаемый в данном документе как «вставка/делеция».

[0059] «Значение вероятности» или «p-значение» представляет собой статистическую возможность того, что конкретная комбинация фенотипа и наличие или отсутствие конкретного маркерного аллеля являются случайными. Таким образом, чем ниже показатель вероятности, тем больше возможность того, что фенотип и конкретный маркер будут совместно сегрегировать. В некоторых аспектах данного изобретения показатель вероятности рассматривается как «значимый» или «незначимый». В некоторых вариантах осуществления данного изобретения показатель вероятности 0,05 (p=0,05 или 5% вероятности) случайного распределения считается значимым показателем совместной сегрегации. Однако приемлемой вероятностью может быть любая вероятность менее 50% (p=0,5). Например, значимая вероятность может составлять менее 0,25, менее 0,20, менее 0,15, менее 0,1, менее 0,05, менее 0,01 или менее 0,001.

[0060] Термин «потомство» относится к потомству, полученному при скрещивании.

[0061] «Растение потомства» образовано в результате скрещивания между двумя растениями.

[0062] «Контрольная последовательность» представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. «Контрольную последовательность» получают путем генотипирования ряда линий в локусе, выравнивания нуклеотидных последовательностей в программе выравнивания последовательностей (например, Sequencher), а затем получения консенсусной последовательности выравнивания.

[0063] «Однонуклеотидный полиморфизм (SNP)» представляет собой изменение последовательности ДНК, возникающее, когда один нуклеотид - A, T, C или G - в геноме (или другой родственной последовательности) различается между представителями биологического вида или парными хромосомами у индивидуума. Например, два секвенированных фрагмента ДНК от разных индивидуумов, от AAGCCTA до AAGCTTA, характеризуются различием в один нуклеотид.

[0064] Термин «растение сои» включает в себя целые растения сои (Glycine max), клетки растения сои, протопласт растения сои, культуры клеток растения сои или ткани растения сои, из которых можно получить растения сои, каллюс растения сои и клетки растения сои, которые являются интактными в растениях сои или частях растения сои, таких как семена, кожицы семян сои, цветки сои, семядоли сои, листья сои, стебли сои, почки сои, корни сои, корневые кончики сои и т.п.

[0065] Фраза «в жестких условиях» относится к условиям, при которых зонд или полинуклеотид будут гибридизироваться в специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, как правило, в сложной смеси нуклеиновых кислот, но фактически без других последовательностей. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах.

[0066] Более длинные последовательности гибридизируются при более высоких температурах. Как правило, при жестких условиях температуру выбирают приблизительно на 5-10°C ниже, чем точка температуры плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе, рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с целевой последовательностью в равновесных условиях (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов вовлечены в реакцию в равновесных условиях). Жесткими условиями будут те, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,0 М ионов натрия, обычно от 0,01 до 1,0 М натрия на концентрацию (или других солей) при рН 7,0-8,3, при этом температура составляет по меньшей мере примерно 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал является по меньшей мере в два раза, предпочтительно в 10 раз большим, чем для фоновой гибридизации. Типичными жесткими условиями гибридизации часто являются: 50% формамида, 5 x SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5 x SSC, 1% SOS, инкубирование при 65°C с промывкой в 0,2 x SSC и 0,1% SDS при 65°C. Для ПЦР температура приблизительно 36°C является типичной для амплификации при низкой жесткости, хотя температуры отжига могут варьироваться от приблизительно 32 до приблизительно 48°C в зависимости от длины праймера. Дополнительные рекомендации по определению параметров гибридизации приведены в многочисленных ссылках.

[0067] Выравнивания последовательности и процентные вычисления идентичности могут быть определены с использованием различных способов сравнения, предназначенных для обнаружения гомологичных последовательностей, включая без ограничения программу MEGALIGN® набора для биоинформатических вычислений LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Мэдисон, штат Висконсин). Если не указано иное, множественное выравнивание последовательностей, представленных в данном документе, выполнялось с использованием способа выравнивания Clustal V (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)) с параметрами по умолчанию (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10), параметры по умолчанию для парных выравниваний и вычисления процента идентичности белковых последовательностей с использованием метода Clustal V представляют собой KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 и DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеиновых добавок эти параметры представляют собой KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 и DIAGONALS SAVED=4. После выравнивания последовательностей, используя программу Clustal V, можно получить значения «процент идентичности» и «расхождение», просмотрев таблицу «интервалы расстояний» в той же программе; если не указано иное, проценты идентичности и расхождения, предусмотренные и заявленные в данном документе, были рассчитаны следующим образом.

[0068] Прежде чем подробно описывать объект настоящего изобретения, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления. Следует также понимать, что используемая в данном документе терминология представлена с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Как используется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, термины в единственном числе, например, включают ссылки на множественное число, если в содержании четко не указано иное. Так, например, ссылка на «растение» также включает в себя множество растений. В зависимости от контекста использование термина «растение» также может включать генетически сходное или идентичное потомство такого растения. Использование термина «нуклеиновая кислота» необязательно включает много копий данной молекулы нуклеиновой кислоты.

Генетическое картирование

[0069] В течение некоторого времени было признано, что специфические генетические локусы, коррелирующие с конкретными фенотипами, такие как повышенная устойчивость к PRSR, могут быть картированы в геноме организма. Селекционер растений может предпочтительно использовать молекулярные маркеры для идентификации желаемых индивидуумов путем обнаружения маркерных аллелей, которые показывают статистически значимую вероятность совместной сегрегации с требуемым фенотипом, проявляющуюся в неравновесном сцеплении. Путем идентификации молекулярного маркера или кластеров молекулярных маркеров, которые совместно сегрегируют с интересующим признаком, селекционер может быстро выбрать желаемый фенотип, выбирая подходящую аллель молекулярного маркера (способ, называемый селекцией с помощью маркера или «MAS»).

[0070] Различные хорошо известные в данной области техники способы доступны для обнаружения молекулярных маркеров или кластеров молекулярных маркеров, которые совместно сегрегируют с интересующим признаком, таким как повышенная устойчивость к PRSR. Основной идеей, лежащей в основе данных способов, является обнаружение маркеров, для которых альтернативные генотипы (или аллели) характеризуются отличающимися значимым образом средними фенотипами. Таким образом, проводят сравнение между маркерными локусами в отношении величины разницы между альтернативными генотипами (или аллелями) или уровнем значимости этой разницы. Предполагается, что гены с признаками располагаются ближе всего к маркеру (маркерам), который (которые) характеризуются наибольшим ассоциированным генотипическим различием.

[0071] Двумя такими способами, используемыми для обнаружения локусов признаков, представляющих интерес, являются: 1) ассоциативный анализ на основе популяции и 2) стандартный анализ сцепления. В ассоциативном анализе на основе популяции линии получают из ранее существовавших популяций с несколькими основателями, например, элитные линии разведения. Ассоциативный анализ на основе популяции основан на ослаблении неравновесного сцепления (LD) и идее о том, что в неструктурированной популяции после стольких поколений случайного спаривания останется только корреляции между генами, контролирующими признак, представляющий интерес, и маркерами, тесно сцепленными с указанными генами. В действительности большинство изначально существующих популяций имеют субструктуру популяции. Таким образом, использование подхода со структурированной ассоциацией помогает контролировать структуру популяции, путем выделения индивидуумов в популяциях с использованием данных, полученных из маркеров, случайно распределенных по геному, тем самым сводя к минимуму неравновесие, связанное со структурой популяции в пределах отдельных популяций (также называемых субпопуляциями). Фенотипические значения сравнивают с генотипами (аллелями) в каждом маркерном локусе для каждой линии в субпопуляции. Значимая ассоциация маркер-признак указывает на близость между маркерным локусом и одним или более генетическими локусами, которые участвуют в экспрессии этого признака.

[0072] Те же принципы лежат в основе стандартного анализа сцепления; однако LD образуется путем создания популяции из небольшого числа основателей. Основатели выбираются таким образом, чтобы максимизировать уровень полиморфизма в созданной популяции, а полиморфные сайты оцениваются по степени их совместного сегрегации с данным фенотипом. Для определения значимых ассоциаций маркер-признак использовали ряд статистических методов. Одним из таких методов является подход интервального картирования (Lander и Botstein, Genetics 121:185-199 (1989)), в котором каждое из многих положений вдоль генетической карты (скажем, с интервалом в 1 сМ) проверяют на возможность того, что ген, контролирующий признак, представляющий интерес, находится в данном положении. Данные генотипа/фенотипа используются для расчета LOD-показателя для каждого тестового положения (log или отношения вероятности). Когда LOD-показатель превышает пороговое значение, имеет место значимое доказательство местоположения гена, контролирующего признак, представляющий интерес, в данном положении на генетической карте (которое будет располагаться между двумя конкретными маркерными локусами).

Маркеры, ассоциированные с устойчивостью к PRSR

[0073] В данном документе идентифицированы маркеры, ассоциированные с устойчивостью к PRSR. Способы включают обнаружение наличия по меньшей мере одного маркерного аллеля, ассоциированного с повышенной устойчивостью, в зародышевой плазме растения сои. Маркерный локус может быть выбран из любого маркерных локусов из таблицы 6, включая BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A и InDel_1, а также любой маркер, сцепленный с этими маркерами (сцепленные маркеры могут быть определены с помощью общедоступного ресурса SoyBase). Маркерный локус может быть выбран из любых маркерных локусов, представленных в таблице 6, включая BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, а также любой другой маркер, сцепленный с данным маркером (сцепленные маркеры могут быть определены с помощью общедоступного ресурса SoyBase).

[0074] Генетические элементы или гены, расположенные на непрерывном линейном отрезке геномной ДНК на одной хромосоме, физически сцеплены. BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, оба тесно ассоциированные с устойчивостью к PRSR, определяют локус устойчивости к PRSR. Любой полинуклеотид, который собирается в непрерывную ДНК от SEQ ID NO: 6 (исходная последовательность SNP для BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T) до SEQ ID NO: 24 (исходная последовательность SNP для BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C), включительно, может содержать маркерные локусы, которые ассоциированы с устойчивостью к PRSR.

[0075] Генетические элементы или гены, расположенные на непрерывном линейном отрезке геномной ДНК на одной хромосоме, физически сцеплены на протяжении подынтервала от BARCSOYSSR_07_0295 до InDel_1. BARCSOYSSR_07_0295 и InDel_1, оба тесно ассоциированные с устойчивостью к PRSR, определяют локус устойчивости к PRSR. Любой полинуклеотид, который собирается в непрерывную ДНК от SEQ ID NO: 43 (последовательность прямого праймера для BARCSOYSSR_07_0295) до SEQ ID NO: 58 (последовательность обратного праймера для InDel_1) включительно, может содержать маркерные локусы, ассоциированные с устойчивостью к PRSR.

[0076] Общей мерой сцепления является частота, с которой признаки совместно сегрегируют. Она может быть выражена в процентах совместной сегрегации (частота рекомбинации) или в сантиморганах (cM). сМ является единицей измерения частоты генетической рекомбинации. Один cM равен 1% вероятности того, что признак в одном генетическом локусе будет отделен от признака в другом локусе из-за кроссинговера в одном поколении (признаки расщепляются вместе в 99% случаев). Поскольку хромосомное расстояние приблизительно пропорционально кроссинговеру между признаками, имеется приблизительное физическое расстояние, которое коррелирует с частотой рекомбинации.

[0077] Маркерные локусы сами по себе являются признаками и могут быть оценены в соответствии со стандартным анализом сцепления путем отслеживания маркерных локусов во время сегрегации. Таким образом, один cМ равен 1% вероятности того, что маркерный локус будет отделен от другого локуса из-за кроссинговера в одном поколении.

[0078] Другие маркеры, связанные с маркерами, перечисленными в таблице 4, могут использоваться для прогнозирования устойчивости к PRSR у растения сои. Они включают любой маркер в пределах менее 50 сМ (например, приблизительно 10 сМ, 9 сМ, 8 сМ, 7 сМ, 6 сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0,75 сМ, 0,5 сМ или 0,25 сМ или менее) из BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, и маркеры, ассоциированные с устойчивостью к PRSR. Чем ближе маркер к гену, контролирующему признак, представляющий интерес, тем эффективнее и выгоднее данный маркер в качестве индикатора желаемого признака. Тесно сцепленные локусы отображают частоту кроссинговера между локусами, которая составляет приблизительно 10% или менее, предпочтительно приблизительно 9% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 8% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 7% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 6% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 5% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 4% или менее, еще более предпочтительно приблизительно 3% или менее и еще более предпочтительно приблизительно 2% или менее. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения соответствующие локусы (например, маркерный локус и целевой локус) показывают частоту рекомбинации приблизительно 1% или менее, например, приблизительно 0,75% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,5% или менее или еще более предпочтительно приблизительно 0,25% или менее. Таким образом, локусы находятся на расстоянии приблизительно 10 сМ, 9 сМ, 8 сМ, 7 сМ, 6 сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0,75 сМ, 0,5 сМ или 0,25 сМ или менее. Иными словами, два локуса, локализованные в одной и той же хромосоме и на таком расстоянии, что рекомбинация между двумя локусами происходит с частотой менее 10% (например, приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или менее), называются «близкими» друг к другу.

[0079] Хотя определенные маркерные аллели могут проявлять совместную сегрегацию с повышенной устойчивостью к PRSR, важно отметить, что маркерный локус не обязательно ответственен за экспрессию фенотипа устойчивости к PRSR. Например, не является обязательным, чтобы маркерная полинуклеотидная последовательность была частью гена, который придает повышенную устойчивость к PRSR (например, частью открытой рамки считывания гена). Связь между специфическим маркерным аллелем и фенотипом повышенной устойчивости к PRSR обусловлена исходной фазой сцепления, «сопряжением» между маркерным аллелем и аллелем в предковой линии сои, из которой произошел аллель. В конце концов, при повторной рекомбинации события кроссинговера между маркером и генетическим локусом могут изменять данную ориентацию. По этой причине благоприятный маркерный аллель может изменяться в зависимости от фазы сцепления, которая существует в устойчивом родителе, используемом для создания расщепляющихся популяций. Это не меняет того факта, что маркер может использоваться для мониторинга расщепления фенотипа. Это меняет только то, какой маркерный аллель считается благоприятным в данной расщепляющейся популяции.

[0080] Термин «хромосомный интервал» обозначает любые и все интервалы, определенные любым из маркеров, изложенных в настоящем раскрытии. Предусмотрен хромосомный интервал, который коррелирует с устойчивостью к PRSR. Этот интервал, расположенный на хромосоме 7, содержит BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и фланкирован ними. Подынтервалом хромосомного интервала от BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T до BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C является интервал от BARCSOYSSR_07_0295 до InDel_1.

[0081] Для идентификации хромосомных интервалов доступны различные способы, хорошо известные в данной области техники. Границы таких хромосомных интервалов изображены для охвата маркеров, которые будут сцеплены с геном, контролирующим признак, представляющий интерес. Другими словами, хромосомный интервал изображен таким образом, что любой маркер, который лежит в пределах этого интервала (включая терминальные маркеры, которые определяют границы интервала), можно использовать в качестве маркера устойчивости к PRSR. Интервал, описанный выше, охватывает кластер маркеров, которые совместно сегрегируют с устойчивостью к PRSR. Кластеризация маркеров происходит в относительно небольших доменах на хромосомах, что указывает на наличие гена, контролирующего признак, представляющий интерес, в этих участках хромосомы. Интервал был изображен так, чтобы охватить маркеры, которые совместно сегрегируют с устойчивостью к PRSR. Интервал охватывает маркеры, которые картированы в пределах интервала, а также маркеры, которые определяют концы. Например, интервал от BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T до BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, разделенный 368797 п.о., на основе эталонного генома Glyma2.0, который определяет хромосомный интервал, охватывающий кластер маркеров, которые совместно сегрегируют с устойчивостью к PRSR. Другой пример включает субинтервал от BARCSOYSSR_07_0295 до InDel_1, разделенный 61874 п.о., на основе эталонного генома Glyma2.0, который определяет хромосомный интервал, охватывающий кластер маркеров, которые совместно сегрегируют с устойчивостью к PRSR. Интервал, описываемый терминальными маркерами, которые определяют конечные точки интервала, будет включать терминальные маркеры и любой маркер, локализующийся в пределах этого хромосомного домена, независимо от того, известны ли в настоящее время эти маркеры или неизвестны.

[0082] Хромосомные интервалы также могут быть определены маркерами, которые сцеплены с (проявляют неравновесное сцепление с) маркером, представляющим интерес, и являются общей мерой неравновесности сцепления (LD) в контексте ассоциированных исследований. Если значение r2 LD между любым маркерным локусом хромосомы 7, лежащим в пределах интервала от BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T до BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, подынтервала от BARCSOYSSR_07_0295 до InDel_1 или любого другого подынтервала от BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T до BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, и определенным маркером в пределах этого интервала, который содержит аллель, ассоциированный с повышенной устойчивостью к PRSR, больше ⅓ (Ardlie et al. Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), локусы сцеплены.

[0083] Маркер раскрытого в данном документе объекта настоящего изобретения также может представлять собой комбинацию аллелей в маркерных локусах, также известную как гаплотип. Специалист в данной области может предполагать, что существуют дополнительные полиморфные сайты в пределах определенных в данном документе маркеров хромосомы 7, где один или более полиморфных сайтов находятся в неравновесном сцеплении (LD) с аллелем, ассоциированным с повышенной устойчивостью к PRSR. Считается, что два определенных аллеля в разных полиморфных сайтах находятся в LD, если наличие аллеля на одном из сайтов предполагает прогнозирование наличия аллеля на другом сайте данной хромосомы (Stevens, Mol. Diag., 4:309-17 (1999)).

Селекция с помощью маркера

[0084] Молекулярные маркеры могут использоваться в различных применениях при разведении растений (например, см. Staub et al., (1996) Hortscience 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8). Одной из основных областей, представляющих интерес, является повышение эффективности обратного скрещивания и интрогрессирующих генов посредством селекции с помощью маркера (MAS). Молекулярный маркер, который демонстрирует сцепление с локусом, влияющим на желаемый фенотипический признак, является полезным инструментом для селекции признака в популяции растения. Это особенно справедливо в тех случаях, когда фенотип сложно оценивать, например, много признаков устойчивости к заболеваниям, или оценивание происходит на поздней стадии развития растений, например, характеристика семян. Поскольку анализы маркера ДНК менее трудоемки и занимают меньше физического пространства, чем полевое фенотипирование, можно анализировать гораздо большие популяции, увеличивая шансы найти рекомбинант с целевым сегментом от линии донора, перенесенной в линию получателя. Чем ближе сцепление, тем полезнее маркер, поскольку рекомбинация менее вероятна между маркером и геном, вызывающим признак, что может привести к ложноположительным результатам. Наличие фланкирующих маркеров уменьшает вероятность того, что ложноположительная селекция будет иметь место, поскольку потребуется двойная рекомбинация. Идеальная ситуация состоит в том, чтобы иметь маркер в самом геноме, чтобы рекомбинация не могла произойти между маркером и геном. Такой маркер называется «идеальным маркером».

[0085] Когда ген интрогрессирован посредством MAS, интрогрессии поддается не только ген, но и фланкирующие участки (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). Это называется «сцепленный груз». В случае, когда растение-донор значительно не связано с растением-реципиентом, данные фланкирующие участки содержат дополнительные гены, которые могут кодировать агрономически нежелательные признаки. Этот «сцепленный груз» также может приводить к снижению урожая или другим отрицательным агрономическим характеристикам даже после нескольких циклов обратного скрещивания в элитной линии сои. Это также иногда называют «груз урожая». Размер фланкирующего участка может быть снижен за счет дополнительного обратного скрещивания, хотя это не всегда успешно, поскольку селекционеры не имеют контроля над размером участка или точечными разрывами при рекомбинации (Young et al., (1998) Genetics 120:579-585). При классическом разведении обычно является случайностью то, что рекомбинации выбраны таким образом, что способствуют уменьшению размера донорного сегмента (Tanksley et al., (1989). Biotechnology 7: 257-264). Даже после 20 обратных скрещиваний в обратном скрещивании данного типа может ожидаться обнаружение значительной части донорной хромосомы все еще связанной с выбранным геном. Однако с помощью маркеров можно отбирать тех редких индивидуумов, которые поддались рекомбинации вблизи гена, представляющего интерес. У 150 растений, полученных путем обратного скрещивания, существует вероятность 95% того, что по крайней мере одно растение будет подвергнуто кроссинговеру в пределах 1 сМ гена на основании единичного расстояния карты мейоза. Маркеры позволят целенаправленно идентифицировать таких индивидуумов. При одном дополнительном обратном скрещивании 300 растений будет существовать 95% вероятность кроссинговера в пределах 1 сМ единичного расстояния карты мейоза другой стороны гена, с образованием сегмента рядом с целевым геном, составляющего менее 2 сМ на основании единичного расстояния карты мейоза. Данное действие может быть выполнено в двух поколениях с маркерами, в то время как потребовалось бы в среднем 100 поколений без маркеров (см. Tanksley et al. выше). Когда точное расположение гена известно, фланкирующие маркеры, окружающие ген, могут быть использованы для отбора рекомбинаций в популяциях разных размеров. Например, в популяциях меньших размеров рекомбинации можно ожидать на значительном удалении от гена, поэтому для обнаружения рекомбинации потребуется более дальние фланкирующие маркеры.

[0086] Доступность эталонного генома растения сои и консенсусных карт сцепления генома сои, характеризующегося увеличением плотности общедоступных маркеров растения сои, способствовало генетическому картированию сои и MAS. См., например, сборки Glyma1.1 и Glyma2.0, а также Comparative Glycine max Consensus 4.0, которые доступны онлайн на веб-сайте SoyBase.

[0087] Ключевыми компонентами реализации MAS являются (i) определение популяции, в которой будет определена ассоциация маркер-признак, которая может быть расщепляющейся популяцией, или случайной, или структурированной популяцией; (ii) мониторинг сегрегации или ассоциации полиморфных маркеров по отношению к признаку и определение сцепления или ассоциации с использованием статистических методов; (iii) определение набора желаемых маркеров на основе результатов статистического анализа и (iv) использование и/или экстраполяция этой информации на текущий набор разведения зародышевой плазмы для обеспечения возможности принятия решений относительно селекции на основе маркера. Маркеры, описанные в данном раскрытии, а также другие типы маркеров, такие как FLP, могут использоваться в протоколах селекции с помощью маркера.

[0088] SSR могут быть определены как относительно короткие отрезки тандемно повторяющейся ДНК длиной 6 п.о. или менее (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471, Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6). Полиморфизмы возникают из-за изменения числа повторных единиц, вероятно, вызванного проскальзыванием при репликации ДНК (Levinson and Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). Изменение длины повторения может быть определено путем разработки ПЦР-праймеров к консервативным неповторяющимся фланкирующим участкам (Weber and May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396), при этом SSR очень подходят для картирования и MAS, поскольку они многоаллельны, кодоминантны, воспроизводимы и способны к высокопроизводительной автоматизации (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic Press, pp 75-135).

[0089] Могут образовываться различные типы SSR-маркеров, а профили SSR из устойчивых линий могут быть получены с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации. Оценка генотипа маркера основана на размере амплифицированного фрагмента. Услуга определения SSR для сои доступна для общественности на контрактной основе Landmarks DNA, Сен-Жан-сюр-Ришелье, Квебек, Канада.

[0090] Также могут быть созданы различные типы FLP-маркеров. Чаще всего праймеры для амплификации используется для создания полиморфизмов длин фрагментов. Такие FLP-маркеры во многом похожи на SSR-маркеры, за исключением того, что участок, амплифицированный праймерами, обычно не является часто повторяющимся участком. Тем не менее амплифицированный участок, или ампликон, будет характеризоваться достаточной изменчивостью в зародышевой плазме часто из-за вставок или делеций, так что фрагменты, образуемые праймерами для амплификации, могут различаться среди полиморфных индивидуумов, и известно, что такие вставки/делеции часто встречаются у сои (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547, Rafalski (2002b) выше).

[0091] SNP-маркеры обнаруживают замены в одну пару нуклеотидных оснований. Из всех типов молекулярных маркеров SNP являются наиболее многочисленными, поэтому они могут обеспечить наивысшее разрешение генетической карты (Bhattramakki et al., 2002, Plant Molecular Biology 48:539-547). SNP можно анализировать на еще более высоком уровне пропускной способности, чем SSR, в так называемой «сверхвысокой пропускной способности», поскольку они не требуют большого количества ДНК, и автоматизация анализа может быть прямой. SNP также обещают быть относительно недорогими системами. Эти три фактора вместе делают SNP весьма привлекательными для использования в MAS. Для SNP-генотипирования доступны несколько способов, включая без ограничения гибридизацию, удлинение праймера, лигирование олигонуклеотида, расщепление нуклеазами, минисеквенирование и кодируемые сферы. Данные методы рассмотрены в Gut (2001) Hum Mutat 17 pp. 475-492: Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95-100: Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. А также в R, J Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, VVallingford. В широком спектре коммерчески доступных технологий используют эти и другие способы для исследования SNP, включая Masscode™ (Qiagen), Invader® (Third Wave Technologies), SnapShot® (Applied Biosystems), Taqman® (Applied Biosystems) и Beadarrays™ (Illumina).

[0092] Ряд SNP вместе с последовательностью, или через связанные последовательности, могут использоваться для описания гаплотипа любого конкретного генотипа (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta et al., 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). Гаплотипы могут быть более информативными, чем одиночные SNP, и могут быть более описательными для любого конкретного генотипа. Например, одиночный SNP может представлять собой аллель «Т» для конкретной линии или разновидности с повышенной устойчивостью к PRSR, но аллель «Т» может также возникать в популяции сои для размножения, которая используется для рекуррентных родителей. В этом случае гаплотип, например, сочетание аллелей в сцепленных SNP-маркерах, может быть более информативным. После того, как уникальный гаплотип был присвоен хромосомной области донора, данный гаплотип может использоваться в этой популяции или любой ее субпопуляции для определения наличия у индивидуума определенного гена. См., например, WO2003054229. Использование автоматизированных высокопроизводительных платформ обнаружения маркеров, известных специалистам в данной области, делает этот способ высокопродуктивным и эффективным.

[0093] Последовательности для маркеров, перечисленных в таблице 6, могут быть легко использованы для получения дополнительных полиморфных SNP (и других маркеров) в пределах интервала хромосомы, описанного в данном раскрытии. Маркеры в описанном участке карты можно гибридизировать с бактериальными искусственными хромосомами (BAC) или другими геномными библиотеками или выравнивать в электронном виде с последовательностями генома, чтобы найти новые последовательности в том же приблизительном местоположении, что и описанные маркеры.

[0094] В дополнение к SSR, FLP и SNP, как описано выше, также широко используются другие типы молекулярных маркеров, включая без ограничения маркеры экспрессируемых последовательностей (EST), SSR-маркеры, полученные из последовательностей EST, произвольно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD) и другие маркеры на основе нуклеиновой кислоты.

[0095] Профили изоферментов и сцепленные морфологические характеристики также могут в некоторых случаях косвенно использоваться в качестве маркеров. Несмотря на то, что они напрямую не обнаруживают различия в ДНК, на них часто влияют специфические генетические различия. Однако маркеры, которые обнаруживают изменения ДНК, гораздо более многочисленны и полиморфны, чем изоферменты или морфологические маркеры (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8).

[0096] Выравнивания последовательности или контиги также могут использоваться для поиска последовательностей выше или ниже специфических маркеров, перечисленных в данном документе. Эти новые последовательности, близкие к маркерам, описанным в данном документе, затем используются для выявления и разработки функционально эквивалентных маркеров. Например, различные физические и/или генетические карты выравнивают, чтобы найти эквивалентные маркеры, не описанные в данном раскрытии, но находящиеся в одинаковых участках. Эти карты могут находиться в пределах видов сои или даже среди других видов, которые были генетически или физически выровнены с соей, таких как маш, вигна китайская или фасоль обыкновенная.

[0097] В общем, в способе MAS используются полиморфные маркеры, которые были идентифицированы как имеющие значимую вероятность совместной сегрегации с признаком устойчивости к PRSR. Такие маркеры, как предполагается, картируют вблизи гена или генов, которые обеспечивают у растения фенотип устойчивости к PRSR и считаются индикаторами желаемого признака или маркеров. Растения проверяют на наличие желаемого аллеля в маркере, и растения, содержащие желаемый генотип в одном или нескольких локусах, как ожидается, передают желаемый генотип вместе с желаемым фенотипом их потомству. Средства для идентификации растений сои, которые характеризуются повышенной устойчивостью к PRSR, путем идентификации растений, которые содержат указанный аллель в любом из маркерных локусов, описанных в данном документе, включают BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C.

[0098] Представленный в данном документе интервал находит применение в способе MAS для отбора растений, которые демонстрируют повышенную устойчивость к PRSR. Для этой цели можно использовать любой маркер, который картирован в пределах интервала хромосомы 7, определяемого BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и включающего их. Кроме того, гаплотипы, содержащие аллели в одном или более маркерных локусах в пределах интервала хромосомы 7, определяемого BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T и BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C и включающего их, могут использоваться для введения повышенной устойчивости к PRSR в линии или разновидности сои. Любые аллель или гаплотип, которые находится в неравновесном сцеплении с аллелем, ассоциированным с повышенной устойчивостью к PRSR, могут использоваться в способе MAS для отбора растений с повышенной устойчивостью к PRSR.

Кандидатные гены, лежащие в основе Rps11

[0099] Разработка молекулярных маркеров для выполнения генотипирования устойчивости к Phytophthora в поддержку программы разведения растений обеспечивает, помимо прочего, экономию затрат и времени; ранний отбор желаемого потомства; и более точную и быструю коммерциализацию устойчивых к роду Phytophthora сортов сои. Для коммерческих селекционеров растений достаточно наличия высококачественных генетических маркеров, которые можно скринировать в различных популяциях. Однако идентификация ответственного (ответственных) гена (генов) и его (их) аллельных изменений и способов действия, лежащих в основе фенотипической характеристики устойчивости к Phytophthora, дает дополнительные преимущества. Идентификация ответственного (ответственных) гена (генов), лежащего (лежащих) в основе или ассоциированного (ассоциированных) с фенотипическим признаком, может преодолеть ограничения селекции с помощью маркера с использованием молекулярных маркеров, ассоциированных с основным геном или QTL. Например, молекулярные маркеры, сцепленные с QTL или геном, представляющим интерес, которые идентифицированы в одной популяции, могут не быть полиморфными или не так тесно сцеплены в селекционном материале другого генетического происхождения. Представленными в данном документе являются кандидатные гены, потенциально лежащие в основе описанного нового фенотипа устойчивости Rps11.

ПРИМЕРЫ

[00100] Следующие примеры предлагаются для иллюстрации, а не для ограничения прилагаемой формулы изобретения. Является понятным то, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что специалистам в данной области будут известны различные реагенты или параметры, которые могут быть изменены без отступления от сути изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1. Растительные материалы и изоляты Phytophthora sojae

[00101] В общей сложности 204 линии сои, предположительно обеспечивающие устойчивость к PRSR, отбирали из коллекции растений сои USDA-ARS для первоначальной оценки. После первого цикла скрининга идентифицировали в общей сложности 72 линии, переносящих устойчивость как к расе 17, так и расе 25. Устойчивость к расе 17 и расе 25 редко встречается среди одиночных генов Rps, зарегистрированных на сегодняшний день, и поэтому эти линии отобрали как многообещающие относительно устойчивости к нескольким расам. Указанные 72 линии дополнительно сократили до 23 линий, которые показали PRSR широкого спектра после инокуляции дополнительными изолятами P. sojae. После дальнейшего анализа, Plant Introduction (PI) 594527 идентифицировали как многообещающую резистентную линию благодаря ее сильной устойчивости широкого спектра к P. sojae.

[00102] Популяция для картирования состояла из 58 индивидуумов F2 и 209 совокупностей F2:3, полученных из скрещивания между восприимчивым сортом Williams и резистентной линией, идентифицированной изобретателями, PI 594527. PI 594527 представляет собой линию сои, поддерживаемую в коллекции зародышевой плазмы сои USDA (Министерства сельского хозяйства США) и безвозмездно предоставленную из провинции Фуцзянь, Китай. USDA сообщало о линии PI 594527 как о переносящей сильную устойчивость к числу изолятов P. sojae, включая расу 1, расу 3, расу 7 и расу 25, но генетический источник этой устойчивости ранее был неизвестен. Обеспечивали самоопыление растений F1 с образованием популяции F2 в теплице. Небольшое количество семян F2 сохраняли для первоначального анализа, в то время как остальные подвергали самоопылению в поле для разработки совокупностей F2:3 для картирования с целью оценки как фенотипа, так и генотипа.

[00103] Набор растений-дифференциаторов сои использовали в качестве стандартного контроля во всех экспериментах по инокуляции, чтобы обеспечить выполнение изолятами соответствующего инфицирования (Lin et al., 2013). Эти контрольные растения-дифференциаторы представляли собой Union (Rps1-a), Harosoy 13xx (Rps1-b), Williams79 (Rps1-c), PI 103091 (Rps1-d), Williams82 (Rps1-k), L76-1988 (Rps2), L83-570 (Rps3-a), PRx146-36 (Rps3-b), PRx145-48 (Rps3-c), L85-2352 (Rps4), L85-3059 (Rps5), Harosoy 62xx (Rps6), Harosoy (Rps7), PI 399073 (Rps8) и воспримчивый сорт Williams (rps).

[00104] В общей сложности восемь изолятов P. sojae с различной вирулентностью впервые использовали для оценки устойчивости линии сои PI 594527. В качестве изолятов использовали ISA19A-1, ISA71D-1, ISA33O-8, 124C-1 (раса 1), pmg(10)-1 (раса 10), pmg (13)-1 (раса 13), pmg (17)-1 (раса 17), pmg (25)-1 (раса 25) and 96-13S-106A (раса 28). Для валового анализа расщепления и генетического картирования изолят 124C-1 (раса 1) P. Sojae использовали для получения фенотипических данных индивидуумов F2 и совокупностей F2:3. Изоляты поддерживали на агаровой среде с лимской фасолью (LBA) (150 г/л лимской фасоли, 2% агара).

[00105] Линию PI 594527 идентифицировали как многообещающую устойчивую линию, так как она обладала сильной устойчивостью широкого спектра к P. sojae, включая расу 1, расу 10, расу 13, расу 17, расу 25, расу 28 и три других изолята, чьи патотипы не соответствуют любому известному обозначению расы (таблица 1).

Таблица 1. Оценка линии сои PI 594527 по ее взаимодействию с различными изолятами P. sojae

Изолят Вирулентный патотип Кол-во высаженных Кол-во выживших Кол-во погибших Устойчивость к изоляту
Раса 1 7 12 12 0 Устойчивая
Раса 10 1b, 3a, 3b, 3c, 5, 7 11 11 0 Устойчивая
Раса 13 4, 6, 7 11 11 0 Устойчивая
Раса 17 1b, 1d, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7, 8 12 12 0 Устойчивая
Раса 25 1a, 1b, 1c, 1k, 7 12 12 0 Устойчивая
Раса 28 1a, 1b, 1k,2, 3c, 5, 7 10 9 1 Устойчивая
ISA 19A-1 1a, 1b, 1k, 4, 6, 7 12 11 1 Устойчивая
ISA 71D-1 1a, 1c, 1d, 7 11 10 1 Устойчивая
ISA 33O-8 1a, 1b, 1c 1d, 1k,3a, 3c, 4, 5, 7 11 11 0 Устойчивая
Раса 3* 1a, 7 - - - Устойчивая
Раса 7* 1a, 2, 3a, 3c, 4, 5, 6, 7 - - - Устойчивая

* Информация получена из базы данных коллекции культуры сои USDA-ARS.

Пример 2. Инокуляция возбудителя заболевания и оценивание

[00106] Во всех экспериментов применялась модифицированная методика инокуляции в гипокотиль (Dorrance et al., 2008). Иными словами семена высаживали и выращивали в теплице со средней температурой 25°C. На 7-й день посева семян мицелиальную суспензию из 14-дневных культур, выращенных на 1/2 LBA, инъецировали в гипокотиль сеянца (~1 см ниже семядолей). После инокуляции сеянцы покрывали пластиковой крышкой на более чем 12 часов, чтобы обеспечить высокую относительную влажность во время инфицирования (из-за прямого солнечного света). Крышку снимали, и заболеванию давали развиваться на протяжении 5-7 дней (максимум 10 дней) перед оценкой.

[00107] Реакции регистрировали как устойчивые, если сеянец жив без распространяющегося поражения или как восприимчивые, если сеянец был мертв с коричневым гипокотилем. Для каждой совокупности F2:3 оценивали 12-36 потомков. Из анализа данных удаляли любую совокупность с менее чем 12 сеянцами. Совокупность классифицировали как гомозиготно устойчивую (R), если выживало более 80% потомства, гомозиготно восприимчивую (S), если выживало менее 20% сеянцев, или расщепляющуюся (Rs), если 21-79% не были мертвы (Gordon et al., 2006; Zhang et al., 2013).

[00108] Отдельных потомков F2, полученных посредством скрещивания PI 594527 и восприимчивого сорта Williams, тестировали с использованием изолята расы 1, которая была авирулентной для большинства генов Rps. Среди 58 потомков F2 45 были устойчивыми и 13 были восприимчивыми. Коэффициент расщепления 45:13 хорошо согласуется с отношением Менделя 3:1 (χ²=0,21, p=0,65) (таблица 2). Чтобы получить более точные фенотипические результаты и информацию о гетерозиготной резистентности потомков F2 использовали остальную часть популяции F2 до образования F2:3, а затем оценивали ~12-36 сеянцев F3 с каждого растения F2. Соотношение расщепления дополнительно исследовали в популяции для картирования F2:3. Наблюдаемое соотношение R (гомозиготная устойчивость): Rs (расщепление): S (гомозиготная восприимчивость) составило 59:102:48, которое также хорошо согласуется с ожидаемым соотношением 1:2:1 (χ²=1,28, p=0,53). Все результаты показали, что устойчивость к расе 1 у PI 594527 контролировалась одним доминантным новым геном устойчивости, который авторы настоящего изобретения обозначили Rps11.

Пример 3. Забор образцов и выделение ДНК

[00109] Ткани молодых листьев собирали в теплице и выдерживали на льду, если их не содержали в жидком азоте или не хранили в морозильной камере при температуре -80 ℃ перед использованием. Для совокупностей F2:3 из приблизительно 12-20 сеянцев F3 собирали смесь эквивалентных количеств тканей листьев. Данные смеси, в некоторой степени, представляли каждое растение-предшественник F2. Геномную ДНК экстрагировали посредством способа с применением цетилтриметиламмония бромида (CTAB) с незначительными модификациями (Allen et al., 2006). Концентрацию ДНК определяли с применением спектрофотометра Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Вилмингтон, Делавер). Конечную концентрацию ДНК доводили до 50 нг/мкл.

Пример 4. Валовый анализ расщепления в сочетании с генотипированием SNP

[00110] Для быстрого определения местоположения локусов, ассоциированных с фенотипом Rps, к расщепляющейся популяции F2 применяли способ валового анализа расщепления (BSA) (Michelmore et al., 1991). Устойчивые и восприимчивые группы образовывали путем объединения равных количеств образцов ДНК из 10 устойчивых или 10 восприимчивых индивидуумов F2 на основании результатов инокуляции. Устойчивые и восприимчивые родительские линии также включали для генотипирования SNP. Генотипирование SNP проводили с использованием SoySNP8K BeadChip посредством платформы Illumina iScan (Illumina, Inc. Сан Диего, Калифорния) в Мичиганском государственном университете. Подробный протокол анализа Infinium II описан у Song (Song et al., 2013). Аллели с SNP обозначали с использованием модуля генотипирования v1.8.4 от GenomeStudio (Illumina, Inc. Сан Диего, Калифорния).

Пример 5. SSR-маркеры и ПЦР-анализ

[00111] Праймеры для SSR получали из информации, опубликованной Song (Song et al., 2010), а затем синтезировали с помощью Integrated DNA Technologies, Inc (Коралвилл, Айова). В экспериментах использовали полиморфные SSR-маркеры между двумя родительскими линиями. ПЦР-амплификацию проводили согласно Ping et al. 2014 с незначительными модификациями. Вкратце каждая реакция ПЦР содержала 100 нг матричной ДНК, 10 × ПЦР-буфер (2,5 мМ Mg2+), 0,2 мМ дНТФ, 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров и 1,0 Ед. ДНК-полимеразы Taq в общем объеме 20 мкл. Реакции проводили на амплификаторе MyCycler (Bio-Rad Lab, Геркулес, Калифорния), включающем начальную денатурацию при 95°С в течение 3 мин, затем 35 циклов при 95°С в течение 30 с, 55~60°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с, с окончательной элонгацией в течение 10 мин при 72°С. Продукты ПЦР смешивали с 6 × загрузочным буфером и разделяли 4% агарозным гелем (DOT Scientific Inc., Burton, MI), окрашенным бромистым этидием, а затем визуализировали на системе гель-документирования Gel Doc XR (Bio-Rad Lab, Геркулес, Калифорния). Затем полосы SSR оценивали вручную на изображениях геля.

Пример 6. Анализ данных и построение карты сцеплений

[00112] Анализ хи-квадрата (χ²) проводили для проверки фенотипических и генотипических данных в отношении критерия согласия ожидаемому соотношению Менделя с использованием программного обеспечения SPSS 22.0 (SPSS, Чикаго, США) с порогом значимости P=0,05. Маркеры, которые показали значимое искажение сегрегации от ожидаемых соотношений Менделя, исключали из построения карты. Генетическую карту сцепления строили с использованием программного обеспечения Joinmap 4.1 (Van Ooijen 2011). Группы сцепления определяли с использованием порога 3.0. логарифма значения шансов (LOD).

[00113] В общей сложности 2588 SNP, случайно распределенных между 20 хромосомами, идентифицировали между двумя родительскими линиями. На основании гипотезы моногенного наследования ожидалось, что SNP гена и его фланкирующих участков, обнаруженных в восприимчивых группах F2, будут гомозиготными по аллели восприимчивости, унаследованной от восприимчивого сорта Williams, в то время как другие участки должны были быть гетерозиготными, поскольку обе аллели могли быть получены от родителей. Однако SNP устойчивых групп F2 всегда должны быть гетерозиготными, поскольку гомозиготные устойчивые и гетерозиготные устойчивые потомки F2 существовали в пуле ДНК. Таким образом, две группы были генетически отличимыми в целевом участке и гетерозиготными во всех других участках. С использованием этого подхода определяли общий геномный участок ~5 Мб, начиная с 3 Мб до 8 Мб на хромосоме 7 (MLG M), как потенциальное расположение причинного локуса (фиг. 1). Идентифицированные SNP в данном участке показаны в таблице 2.

[00114] Для улучшенного картирования нового локуса Rps11 анализ сцепления и генетическое картирование проводили с 209 совокупностями F2:3, полученными в результате скрещивания. На основании результатов BSA из предварительного участка выбрали 14 случайно распределенных праймеров для SSR (Song et al., 2010). Были определены четыре полиморфных маркера SSR BARCSOYSSR_07_0223, BARCSOYSSR_07_0266, BARCSOYSSR_07_0278 и BARCSOYSSR_07_0459 между двумя родителями популяции для картирования. Затем эти четыре маркера использовали для генотипирования 50 из совокупностей F2:3. Идентифицировали 9, 2, 0 и 14 рекомбинантов, соответственно, с указанием, что локус Rps11 находится между BARCSOYSSR_07_0223 и BARCSOYSSR_07_0459 и больше сцеплен с BARCSOYSSR_07_0266 и BARCSOYSSR_07_0278. Предварительный анализ также подтвердил результаты сопоставления с анализом SNP-Chip.

[00115] Затем отобрали 9 полиморфных SSR-маркеров, расположенных между SSR_07_0223 и SSR_07_0459, для генотипирования целой популяции. Хи-квадратный анализ генотипических данных из 209 совокупностей F2:3 показал, что все девять полиморфных маркеров соответствуют ожидаемому соотношению расщепления 1:2:1 (таблица 3). Поэтому генетическую карту, состоящую из 9 SSR-маркеров и Rps11, строили с использованием программного обеспечения Joinmap 4.1 (Van Ooijen 2011). В этом подходе локус Rps картировали на участке 0,5 cM, охватывающем 226 т.о. в соответствии с эталонным геномом Glyma1.1, и фланкировали SSR-маркерами BARCSOYSSR_07_0286 и BARCSOYSSR_07_0300 (фигура 2). Было обнаружено, что SSR-маркер BARCSOYSSR_07_0295 совместно сегрегирует с локусом.

Таблица 2. SNP-маркеры, идентифицированные в хромосомном интервале устойчивости к PRSR на хромосоме 7. Перечислены генотипы родителей и восприимчивые и устойчивые группы. Физические положения маркеров основаны на эталонной карте сои Glyma1.1

ID SNP SEQ ID NO: Положение в хромосоме (п.о.) Аллели образцов
Williams Восприимчивая группа Устойчивая группа PI 594527
BARC_1.01_Gm07_5143130_A_G 1 5143130 AA AA AG GG
BARC_1.01_Gm07_5330061_G_A 2 5330061 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5346264_G_A 3 5346264 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5352313_T_C 4 5352313 TT TT TC CC
BARC_1.01_Gm07_5382683_C_T 5 5382683 CC CC TC TT
BARC_1.01_Gm07_5383355_C_T 6 5383355 CC CC TC TT
BARC_1.01_Gm07_5402911_T_C 7 5402911 TT TT TC CC
BARC_1.01_Gm07_5442375_T_C 8 5442375 TT TT TC CC
BARC_1.01_Gm07_5457696_C_T 9 5457696 CC CC TC TT
BARC_1.01_Gm07_5481829_T_C 10 5481829 TT TT TC CC
BARC_1.01_Gm07_5488504_A_G 11 5488504 AA AA AG GG
BARC_1.01_Gm07_5490895_G_T 12 5490895 GG GG TT TT
BARC_1.01_Gm07_5495895_G_A 13 5495895 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5500269_T_G 14 5500269 TT TT TG TG
BARC_1.01_Gm07_5504994_G_T 15 5504994 GG GG TG TT
BARC_1.01_Gm07_5519521_G_A 16 5519521 GG GG AG AG
BARC_1.01_Gm07_5529382_A_G 17 5529382 AA AA AG AG
BARC_1.01_Gm07_5555040_T_G 18 5555040 TT TT TG TG
BARC_1.01_Gm07_5580414_T_C 19 5580414 TT TT CC CC
BARC_1.01_Gm07_5599140_A_C 20 5599140 AA AA AC AC
BARC_1.01_Gm07_5600654_A_G 21 5600654 AA AA AG AG
BARC_1.01_Gm07_5601844_G_A 22 5601844 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5610838_T_C 23 5610838 TT TT TC TC
BARC_1.01_Gm07_5629128_A_C 24 5629128 AA AA AC AC
BARC_1.01_Gm07_5762798_C_T 25 5762798 CC CC TC TT
BARC_1.01_Gm07_5835517_C_T 26 5835517 CC CC TC TC
BARC_1.01_Gm07_5863012_C_A 27 5863012 CC CC AC AA
BARC_1.01_Gm07_5900018_A_G 28 5900018 AA AA AG GG
BARC_1.01_Gm07_5951000_G_A 29 5951000 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5963920_G_A 30 5963920 GG GG AG AA
BARC_1.01_Gm07_5974721_A_G 31 5974721 AA AA AG GG
BARC_1.01_Gm07_5989451_C_T 32 5989451 CC CC TC TT
BARC_1.01_Gm07_6016358_A_G 33 6016358 AA AA AG GG

Таблица 3. Критерий согласия хи-квадрат (χ²) для девяти SSR-маркеров в популяции для картирования F2:3, полученной из PI 594527 × Williams

Маркер SEQ ID NO прямого праймера SEQ ID NO обратного праймера Наблюдаемое числоa Критерий согласия χ²
a h b χ2 1:2:1 p
BARCSOYSSR_07_0241 34 35 52 97 59 1,41 0,49
BARCSOYSSR_07_0266 36 37 58 104 47 1,16 0,56
BARCSOYSSR_07_0275 38 39 57 105 47 0,96 0,62
BARCSOYSSR_07_0278 40 41 57 104 48 0,78 0,68
BARCSOYSSR_07_0286 42 43 58 103 48 1 0,61
BARCSOYSSR_07_0295 44 45 59 102 48 1,28 0,53
BARCSOYSSR_07_0300 46 47 59 103 47 1,42 0,49
BARCSOYSSR_07_0320 48 49 64 97 48 3,53 0,17
BARCSOYSSR_07_0339 50 51 62 101 45 2,95 0,23

a «a» представляет собой гомозиготных по маркерному аллелю от устойчивой линии PI 594527; «b» представляет собой гомозиготных по маркерному аллелю от восприимчивого сорта Williams; «h» представляет собой гетерозиготных по маркерным аллелям от обоих родителей.

Пример 7. Точное картирование участка QTL Rps11 и прогнозирование кандидатного гена

[00116] Популяция для точного картирования состоит из 2640 индивидуумов F3, полученных из начального скрещивания между Williams и PI594527. Образцы листьев собирали у каждого индивидуума в поле для выделения ДНК посредством стандартного метода с использованием цетилтриметиламмония бромида (CTAB). Для оценки устойчивости рекомбинантов использовали расу 1 P. sojae. Все работы по инокуляции выполняли с использованием стандартного метода инокуляции гипокотиля, как описано Lin et al. (2013). Совокупность F3:4 считалась гомозиготно устойчивой, если выживало более 80% потомков, и гетерогенно устойчивой, если выживало 21%-79%, и восприимчивой, если выживало менее 20%.

[00117] SSR-маркеры BARCSOYSSR_07_0286 и BARCSOYSSR_07_0300, которые фланкируют QTL Rps11 на хромосоме 7 и разделены физическим расстоянием 225 т.о., на основании эталонного генома Glyma1.1 (Ping et al., 2015). Эти фланкирующие маркеры использовали для сканирования целой популяции F3 для идентификации рекомбинантов, что приводило к идентификации 10 новых рекомбинантов. В дополнение к SSR-маркерам для генотипирования рекомбинантов также разрабатывали маркеры KASP™ и маркеры вставки/делеции (InDel). Rps11 картировали в участке размером 61 т.о., определенном SSR-маркером BARCSOYSSR_07_0295 и InDel-маркером InDel_1 (фигура 3, таблица 4). В пределах участка размером 61 т.о. прогнозировали пять моделей генов в соответствии с новым эталонным геномом Glyma2.0 (таблица 5). На основании аннотации гена Glyma.07G062900 был единственным геном, который может кодировать белок устойчивости к заболеванию, содержащему домен NB-ARC.

Таблица 4. Маркеры, картированные в интервале размером 348 т.о. относительно устойчивости к PRSR на хромосоме 7. Перечислены генотипы родителей. Маркеры, точно картированные в интервале размером 61 т.о., выделены жирным шрифтом и затенены серым цветом. Физические положения маркеров основаны на эталонном геноме Glyma2.0

Таблица 5. Аннотация гена в картированном участке размером 61 т.о. согласно эталонному геному сои (Glyma2.0)

ID гена Функциональная аннотация
Glyma.07G62500 Белок, содержащий GRIP-связывающий домен семейства ARF
Glyma.07G62600 Белок семейства ретикулонов
Glyma.07G62700 Белок суперсемейства S-аденозил-L-метионин-зависящей метилтрансферазы
Glyma.07G62800 Белок суперсемейства RING/U-box
Glyma.07G62900 Белок устойчивости к заболеванию, содержащий домен NB-ARC

Маркерная рамка и использование селекции с помощью маркера

[00118] Набор общих маркеров можно использовать для создания рамки для идентификации маркеров в хромосомном интервале. В таблице 4 показаны маркеры, которые находятся в последовательном положении относительно друг друга на генетической карте сцепления хромосомы 7. Физические положения SSR-маркеров определяют с помощью программы BLAST, которая ищет их последовательности праймеров относительно эталонных геномов сои, Glyma 1.1 или Glyma2.0, которые общедоступны на веб-сайте SoyBase.

[00119] Тесно сцепленные маркеры, фланкирующие локус, представляющий интерес, которые содержат аллели в неравновесном сцеплении с благоприятным аллелем в этом локусе, могут быть эффективно использованы для отбора растений потомства с повышенной устойчивостью к PRSR. Таким образом, описанные в данном документе маркеры, такие как перечисленные в таблице 6, а также другие маркеры, генетически или физически картированные на одном и том же хромосомном сегменте, можно использовать для отбора растений сои с повышенной устойчивостью к PRSR Как правило, набор этих маркеров будет использоваться (например, 2 или более, 3 или более, 4 или более, 5 или более) в участках, фланкирующих локус, представляющий интерес. Необязательно маркер может быть использован в пределах фактического гена и/или локуса.

[00120] Таблица 6. Молекулярные маркеры в интервале устойчивости к PRSR на хромосоме 7 и их донорная аллель. Маркеры в пределах хромосомного интервала являются желаемыми для селекции с помощью маркера

Справочные материалы

Allen G, Flores-Vergara M, Krasynanski S, Kumar S, Thompson W (2006) A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide Nature protocols 1:2320-2325.

Demirbas A et al. (2001) Simple sequence repeat markers linked to the soybean genes for Phytophthora resistance Crop Sci 41:1220-1227.

Dorrance A, Mills D, Robertson A, Draper M, Giesler L, Tenuta A (2007) Phytophthora root and stem rot of soybean The Plant Health Instructor 10.

Dorrance A, Schmitthenner A (2000) New sources of resistance to Phytophthora sojae in the soybean plant introductions Plant Dis 84:1303-1308.

Dorrance AE, Berry SA, Anderson TR, Meharg C (2008) Isolation, storage, pathotype characterization, and evaluation of resistance for Phytophthora sojae in soybean Plant Health Progress 10:1094.

Ellis J, Dodds P, Pryor T (2000) Structure, function and evolution of plant disease resistance genes Curr Opin Plant Biol 3:278-284.

Erwin DC, Ribeiro OK (1996) Phytophthora diseases worldwide. American Phytopathological Society (APS Press).

Fan A, Wang X, Fang X, Wu X, Zhu Z (2009) Molecular identification of Phytophthora resistance gene in soybean cultivar Yudou 25 Acta Agronomica Sinica 35:1844-1850.

Ganal MW et al. (2011) A large maize (Zea mays L.) SNP genotyping array: development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome PloS one 6:e28334.

Gao H, Narayanan NN, Ellison L, Bhattacharyya MK (2005) Two classes of highly similar coiled coil-nucleotide binding-leucine rich repeat genes isolated from the Rps1-k locus encode Phytophthora resistance in soybean Mol Plant-Microbe Interact 18:1035-1045.

Gordon SG, Martin SKS, Dorrance AE (2006) Rps8 maps to a resistance gene rich region on soybean molecular linkage group F Crop Sci 46:168-173 doi:DOI 10.2135/cropsci2004.04-0024.

Kanazin V, Marek LF, Shoemaker RC (1996) Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean Proceedings of the National Academy of Sciences 93:11746-11750.

Kaufmann MJ, Gerdemann J (1958) Root and stem rot of soybean caused by Phytophthora sojae n. sp Phytopathology 48:201-208.

Kim K-S et al. (2010) Fine mapping the soybean aphid resistance gene Rag1 in soybean Theor Appl Genet 120:1063-1071.

Koenning SR, Wrather JA (2010) Suppression of soybean yield potential in the continental United States by plant diseases from 2006 to 2009 Plant Health Prog http://dx doi org/101094/PHP-2010-1122-01-RS.

Li Y, Hill CB, Carlson SR, Diers BW, Hartman GL (2007) Soybean aphid resistance genes in the soybean cultivars Dowling and Jackson map to linkage group M Mol Breed 19:25-34.

Lin F et al. (2013) Molecular mapping of two genes conferring resistance to Phytophthora sojae in a soybean landrace PI 567139B Theor Appl Genet 126:2177-2185.

McDonald BA, Linde C (2002) Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance Annu Rev Phytopathol 40:349-379.

Michelmore RW, Meyers BC (1998) Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process Genome Res 8:1113-1130.

Michelmore RW, Paran I, Kesseli R (1991) Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations Proceedings of the National Academy of Sciences 88:9828-9832.

Ping J et al. (2014) Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean The Plant Cell Online 26:2831-2842.

Polzin K, Lohnes D, Nickell C, Shoemaker R (1994) Integration of Rps2, Rmd, and Rj2 into linkage group J of the soybean molecular map J Hered 85:300-303.

Sandhu D, Gao H, Cianzio S, Bhattacharyya MK (2004) Deletion of a disease resistance nucleotide-binding-site leucine-rich-repeat-like sequence is associated with the loss of the Phytophthora resistance gene Rps4 in soybean Genetics 168:2157-2167.

Saruta M et al. (2012) Screening and genetic analysis of resistance to peanut stunt virus in soybean: identification of the putative Rpsv1 resistance gene Breeding science 61:625.

Schmitthenner A (1999) Phytophthora rot of soybean Compendium of soybean diseases, 4th edn The American Phytopathological Society Press, St Paul:39-42.

Schmitthenner AF (1985) Problems and Progress in Control of Phytophthora Root-Rot of Soybean Plant Dis 69:362-368 doi:Doi 10.1094/Pd-69-362.

Song Q, Hyten DL, Jia G, Quigley CV, Fickus EW, Nelson RL, Cregan PB (2013) Development and evaluation of SoySNP50K, a high-density genotyping array for soybean PloS one 8:e54985.

Song QJ et al. (2010) Abundance of SSR Motifs and Development of Candidate Polymorphic SSR Markers (BARCSOYSSR_1.0) in Soybean Crop Sci 50:1950-1960 doi:DOI 10.2135/cropsci2009.10.0607.

Sugimoto T et al. (2011) Genetic analysis and identification of DNA markers linked to a novel Phytophthora sojae resistance gene in the Japanese soybean cultivar Waseshiroge Euphytica 182:133-145.

Sun J, Li L, Zhao J, Huang J, Yan Q, Xing H, Guo N (2014) Genetic analysis and fine mapping of RpsJS, a novel resistance gene to Phytophthora sojae in soybean [Glycine max (L.) Merr.] Theor Appl Genet 127:913-919.

Sun S et al. (2011) Characterization and mapping of RpsYu25, a novel resistance gene to Phytophthora sojae Plant breeding 130:139-143.

Tian Z et al. (2010) Artificial selection for determinate growth habit in soybean P Natl Acad Sci USA 107:8563-8568 doi:10.1073/pnas.1000088107.

Van Ooijen J (2011) Multipoint maximum likelihood mapping in a full-sib family of an outbreeding species Genetics research 93:343-349.

Wang S et al. (2014) Characterization of polyploid wheat genomic diversity using a high‐density 90 000 single nucleotide polymorphism array Plant Biotechnol J.

Weng C, Yu K, Anderson T, Poysa V (2001) Mapping genes conferring resistance to Phytophthora root rot of soybean, Rps1a and Rps7 J Hered 92:442-446.

Wrather J, Koenning S (2009) Effects of diseases on soybean yields in the United States 1996 to 2007 Plant Health Progress.

Wu X et al. (2011a) Identification, Genetic Analysis and Mapping of Resistance to Phytophthora sojae of Pm28 in Soybean Agricultural Sciences in China 10:1506-1511.

Wu X, Zhou B, Sun S, Zhao J, Chen S, Gai J, Xing H (2011b) Genetic analysis and mapping of resistance to phytophthora sojae of Pm14 in soybean Scientia Agricultura Sinica 44:456-460.

Yao H, Wang X, Wu X, Xiao Y, Zhu Z (2010) Molecular mapping of Phytophthora resistance gene in soybean cultivar zaoshu18 Journal of Plant Genetic Resources 11:213-217.

Zhang J, Xia C, Wang X, Duan C, Sun S, Wu X, Zhu Z (2013) Genetic characterization and fine mapping of the novel Phytophthora resistance gene in a Chinese soybean cultivar Theor Appl Genet 126:1555-1561.

Zhang X, Feng Y, Cheng H, Tian D, Yang S, Chen J-Q (2011) Relative evolutionary rates of NBS-encoding genes revealed by soybean segmental duplication Mol Genet Genomics 285:79-90.

Zhao K et al. (2011) Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa Nature communications 2:467.

Zhu Z, Huo Y, Wang X, Huang J, Wu X (2007) Molecular identification of a novel Phytophthora resistance gene in soybean.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Доу Агросайенсис, ЛЛС

Ма, Сцянсинь

Ачарья, Ананта

Пин, Цзецин

Фицджеральд, Джошуа

Чжан, Чунбао

Лин, Фэн

Бай, Юнхэ

Рехман, Максуд

Краста, Освальд

Аггарвал, Раджат

Ачарья, Ананта

<120> ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЛОКУС, АССОЦИИРОВАННЫЙ С ГНИЛЬЮ КОРНЯ И СТЕБЛЯ,

ОБУСЛОВЛЕННОЙ PHYTOPHTHORA, У СОИ

<130> 77970-US-NP

<160> 60

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 1

aatgggcgtg cacagttatc agttatcagt tatcattccc tattttgtag tcttaattgt 60

rgggtcagtt tcgtacctct ctagttacat gttaaaatca atcctctcta ctgtgttaca 120

c 121

<210> 2

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 2

atatgtgaag gtgaatggaa tggtattggt tgttgtactt atgaggcacc agcagccaac 60

rtattcataa taacgtggag gatcagtgat aatatgaaac tcgagcctaa ggtgaatggt 120

t 121

<210> 3

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 3

tggatgaacc aaacccattg aagcttctat catgcagtaa tatttccact aatcatcagt 60

rgaaggacaa gttttctcac tacaggcaca aactatgatt tttttccttc tgatttgatt 120

a 121

<210> 4

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 4

attctcgaat ctttcctggg ccagcccatt gaggtttttc tttttggacc ggcccatatc 60

ycactatcac tccactcttc ctttctcttg ccctacctca gaaacccaca ctccaaaacc 120

a 121

<210> 5

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 5

tagatttgaa ttgatataga tatatgggtg attattaatt aatatgccag ctcttaccca 60

yaaatagtct taattaaact aaaagaaaag gaaattaaga tctcattgta aaaataaaag 120

g 121

<210> 6

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 6

tggggggtgg gaggttcttg gaaagataag tggttgctta ttcattatgc catctcgcat 60

ycctttttgg aggttttgat tggttgttgt acagacagga ctgacagccg aagaggttta 120

t 121

<210> 7

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 7

tttatcattt gttttatatt tacatacttc gcctaactaa acgtatttaa aagaaatatg 60

ytaataattt aaaattataa tttgtaaatt aaaatctatt aattatttaa aagtgtgatt 120

a 121

<210> 8

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 8

caagtggtgg caaagagtgg agatggggca acctgatgat tctttttagg acgtacgttt 60

ycccactcta gagtgtgtat gtgtttgctc gtgttgggag ttcaatagct gcaatcacta 120

c 121

<210> 9

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 9

tgtcaccatc taccggcatg ggaggcaaag aatccgcatc accttttacc ccatacattc 60

ycctcatggc ttctgagaaa gcaaaccttc actcaaacac aaatgaagag aaaatcaagc 120

t 121

<210> 10

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 10

gtagttttga acttttgata actacaattt cgctatcaat aaaagtgtat gccctttaat 60

yatagagcag tacttccctt tcttggttat caaaatggat ggtgataaat tgtcttattt 120

t 121

<210> 11

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 11

gcggcggcgg caaccctaaa attcgataca agcaagtaca cagtcgcagc tccttttata 60

rtgagcgttt tggttcaaat gctagtgcag aaacccaaaa cattcccaaa tttatttaat 120

t 121

<210> 12

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 12

catgccatgt tttttaaaaa catttaaaga aaaaataaat attaagcaga tggtatacga 60

kaaattattg tataatccca gatcaccatg gtattggtca atctaacaaa tgccaagttt 120

a 121

<210> 13

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 13

aatcttacca ttttgcaatg tcataggctg ggatatatag tttttggtta tctaactaat 60

rcatatatta tgttattgct ttgaaggcat caaaggagat gaacaaaata catactgaat 120

t 121

<210> 14

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 14

gatcggaggt gctcaacaag gttcgggtaa aggtgttgtt cgtggagttc ttgggctgcc 60

kggccgcctg gttggaggca tcttgggagg aagttcgact gatgctgctg caaatgcggg 120

a 121

<210> 15

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 15

acatttgttt cttatgtaca acagtgttac agtggcaaca agtatagaat ttaagatatt 60

ktgtaaaata cttaaacttt acttctctag gcctgtccgt agtgattttg cttaaaactt 120

t 121

<210> 16

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 16

aattctagat ttggaatgaa agggggcttg gaattttggt tgggcgtgtg gcacagatga 60

raaggatgtg tgcgacaaat catatagaac tgtgggacct aactggagtt gtacatgtgc 120

a 121

<210> 17

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 17

cttctaacag cttgtctgtt ttgactgtac ctgcacacaa actttccatc ctctcgcaaa 60

rgaatactgt gaattcctcc aaggacggga aacttaaact ccctttgtag aaccttctca 120

g 121

<210> 18

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 18

tctcaaataa ccttatgcta aggaatccaa ccaccactaa ccgctaaata taattagaat 60

kattattcaa atagataata tttcttacat atatatcatt gctttagtga aatagtaagt 120

g 121

<210> 19

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 19

ctgttccagt atttcttgct gatatctgtg gatggggttg gatggttata taggtttccg 60

yggcgacaac aatatcatcg cagatatccc gaattttctt gacaaatctg atgcaaaggt 120

a 121

<210> 20

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 20

cagaatttat tttagagact agctatagca aggcttgtgg ctaagccagt taccttcctg 60

mgagtgaact tgagaaagta cagaggctag ctaaggtagg tattagtcta cctaaacctg 120

a 121

<210> 21

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 21

gaagacatta tcgggtccac tgtaaaatta attgtttgtt ctactattgt ggacaacaca 60

ractccattc tttcagcttg attttcttgt acagtgacta catctcttct cgaaataaaa 120

a 121

<210> 22

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 22

gcggtttgaa ggtggcggtg gtgaggtcct gtcttggtgt tctaggtatt ttgaaggaga 60

rgagaatggg gatggtgtag ctcttgccat gtggttgggg tttggcacga ggtcatgatg 120

g 121

<210> 23

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 23

caaaaaaact tcatctggac tagtggctcc atatcttatg caagttaatt ggagataaat 60

ycacgctctc taaaatttcg catttttaac ttacaagcac gtgcacattt gaattactct 120

g 121

<210> 24

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 24

gttttgaagc ttgccgcttt gggtaagggg ccaacagtaa agacacagta gatatattga 60

maagatctct ggtggtcatg cggaacaggt ttatccacca aatctttttt tttttttttt 120

t 121

<210> 25

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 25

tccttaacac ccttaccgca gttacttgcc gcctcaatcc attgctgaaa tgaatgctca 60

yaaataaata tatttgcagg ctacgaatct ctgctcctag atttttgttt cttaattatt 120

t 121

<210> 26

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 26

aacaaacgaa ttcttggact tgttgctatg tacagtctag caactttaag aaacacgggt 60

ygtagtaagc atgacactat tacaaaagtc cttttaaaga tacttttcac aatagttcgc 120

c 121

<210> 27

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 27

taaaatattt aaaagaaaaa gaaaaagaaa tgagggttta aaatagaagt acaaattaaa 60

mattatcgaa aaatgaaatt agtatgcaat ataataaatg gaaccatttt cactttcacc 120

a 121

<210> 28

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 28

acaacttgaa gagtttattt aatcaatgtc aatcatggca aagggtgagg aatggcttgg 60

rttaaatggg atttggttgc ttcacccatt gacatggggg gttggggatt aaaaatttag 120

a 121

<210> 29

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 29

ttgccgtgag attcactgga aatggtttac attagtatgt gtcgagaaac aattagttcc 60

rattatcctt gcttttttaa actgttgtcc atgctatcat cttctttgaa ccatattgta 120

a 121

<210> 30

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 30

gcatgcatac actggtatac atgtcaatgc ttgaattgtt ttgatcacag tggtttttgt 60

rtatcttttc agattggctt atcttcatga aggtcttgaa ccaaaagttg tccaccgaga 120

t 121

<210> 31

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 31

atagaaggtg gtagaatctg gctgaaggca tggcagcagg cagctgtggc agtgggttcc 60

rcggtggggg cgttgttgga ccctcgaaga gcagatttga tagcagctct tggtgagacc 120

a 121

<210> 32

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 32

aatcagttaa gatttctgga cacgtacaaa gaaggttaca agaaatgctt atgaggaatg 60

yagattagaa gatttctagt catataaaag gatagaagga ggagaccaag aagaatgtta 120

a 121

<210> 33

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 33

cttgcctatc ggcagtccat catagttctc gcctatattg gcacctcgcc tatatcagcg 60

rcatctatga aggggaatgt tagaaagtct cacacgcctg attcgttctt tggatgcaac 120

t 121

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для 'BARCSOYSSR_07_0241

<400> 34

caaacaaggc cgcttaaatc 20

<210> 35

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0241

<400> 35

tccttaaaac atgctcatgg aa 22

<210> 36

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0266

<400> 36

ctgtcaagtg aggcaccaaa 20

<210> 37

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0266

<400> 37

cccccatgct tgttctctta 20

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0275

<400> 38

actactcacc ggccaaaatg 20

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0275

<400> 39

cacactcgat cgatatccca 20

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0278

<400> 40

ggggatcgaa aatgtcttcc 20

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0278

<400> 41

gacaaccgtc catcatgaca 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0286

<400> 42

aaaaatcagc acccatcgac 20

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0286

<400> 43

agccctggcc ttattttgtt 20

<210> 44

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0295

<400> 44

ctctcctttc attccccaca 20

<210> 45

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0295

<400> 45

ttcttggagc ttcggaggta 20

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0300

<400> 46

tcgcaatatt ggctacgatg 20

<210> 47

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0300

<400> 47

ctgaaaacaa aataaaagag aacaaa 26

<210> 48

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0320

<400> 48

tttaactgaa aatactccgg ca 22

<210> 49

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0320

<400> 49

tcataattta agagaccaaa ccga 24

<210> 50

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0339

<400> 50

cgcaaggtct aatattcact cg 22

<210> 51

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0339

<400> 51

aaaactgatt gcaggagatt agc 23

<210> 52

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0289

<400> 52

ggcaaaaggt aaaaagggtt t 21

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0289

<400> 53

tccccaaact ttcatcatgt 20

<210> 54

<211> 121

<212> ДНК

<213> Glycine max

<400> 54

gtagttttga acttttgata actacaattt cgctatcaat aaaagtgtat gccctttaat 60

yatagagcag tacttccctt tcttggttat caaaatggat ggtgataaat tgtcttattt 120

t 121

<210> 55

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для InDel_2

<400> 55

ctccattctt ttgagtcgag t 21

<210> 56

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для InDel_2

<400> 56

actcagggcg gatcccaaag tg 22

<210> 57

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для InDel_1

<400> 57

aataaattta ttttggaatg tatc 24

<210> 58

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для InDel_1

<400> 58

tttatgttga tcccaacatg ta 22

<210> 59

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для BARCSOYSSR_07_0297

<400> 59

ttgtctatca aaatttaacc acgaa 25

<210> 60

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для BARCSOYSSR_07_0297

<400> 60

tccacatgtg cactgttagt gt 22

<---

1. Способ идентификации растения сои, которое проявляет повышенную устойчивость к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR), при этом способ включает обнаружение в зародышевой плазме растения сои по меньшей мере одного аллеля маркерного локуса, связанного с PRSR, где маркерный локус характеризуется одой или более из SEQ ID NO: 1-33, где указанные аллели обнаружены с помощью пары праймеров, выбранной из SEQ ID NO: 34 и 35, 36 и 37, 38 и 39, 40 и 41, 42 и 43, 44 и 45, 46 и 47, 48 и 49, 50 и 51.

2. Способ по п. 1, где по меньшей мере один маркерный локус, связанный с PRSR, содержит BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0300 или BARCSOYSSR_07_0320.

3. Способ по п. 2, где по меньшей мере один маркерный локус, связанный с PRSR, содержит BARCSOYSSR_07_0300.

4. Способ идентификации растения сои, которое проявляет повышенную устойчивость к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR), при этом способ включает обнаружение в зародышевой плазме растения сои гаплотипа, содержащего аллели в одном или более маркерных локусах, связанных с PRSR, где маркерный локус характеризуется одой или более из SEQ ID NO: 1-33, где указанные аллели обнаружены с помощью пары праймеров, выбранной из SEQ ID NO: 34 и 35, 36 и 37, 38 и 39, 40 и 41, 42 и 43, 44 и 45, 46 и 47, 48 и 49, 50 и 51.

5. Способ по п. 4, где маркерный локус, связанный с PRSR, содержит один или более из BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0300 или BARCSOYSSR_07_0320.

6. Способ по п. 5, где маркерный локус, связанный с PRSR, содержит BARCSOYSSR_07_0300.

7. Способ селекции с помощью маркера, включающий:

получение первого растения сои по меньшей мере с одним аллелем маркерного локуса, связанного с PRSR, где маркерный локус характеризуется одой или более из SEQ ID NO: 1-33, где указанные аллели обнаружены с помощью пары праймеров, выбранной из SEQ ID NO: 34 и 35, 36 и 37, 38 и 39, 40 и 41, 42 и 43, 44 и 45, 46 и 47, 48 и 49, 50 и 51.

8. Способ по п. 7, где по меньшей мере один маркерный локус, связанный с PRSR, содержит один или более из BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0300 или BARCSOYSSR_07_0320.

9. Способ по п. 8, где по меньшей мере один маркерный локус, связанный с PRSR, содержит BARCSOYSSR_07_0300.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к выделенному полинуклеотиду вируса гриппа A. Предложен выделенный полинуклеотид вируса гриппа A, кодирующий мутант PB2 полимеразы вируса гриппа A, причем мутант PB2 полимеразы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с замещением одной аминокислоты, выбранным из группы, состоящей из: Q306H, Q306L, F323S, F323Y, S324G, S324I, S324N, S324R, S337L, S337P, F363L, K376N, K376Q, K376R, F404Y, M431I, M431T, N510K и N510T.

Изобретение относится к области медицины. Предложена тест-система для диагностики патогенных вариантов в гене ASPA, связанных с болезнью Канаван.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу введения функционального гена-восстановителя Rf4 в растение кукурузы. Изобретение может быть эффективно использовано для восстановления цитоплазматической мужской стерильности в кукурузе.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ обнаружения вируса Джона Каннингема (JCPyV), а также набор и специфические олигонуклеотиды для осуществления способа.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к направляющим РНК, рибонуклеопротеиновым комплексам системы CRISPR/CAS, содержащим направляющие РНК, и наборам, содержащим рибонуклеопротеиновые комплексы системы CRISPR/CAS и специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации высококонсервативных участков генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS, и может быть использовано для выявления генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен сенсор для выявления одиночных молекул, меченый нуклеотид, набор, сенсорная система и способ секвенирования нуклеиновых кислот.
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине. Описан полинуклеотид для экспрессии в клетках целевого организма, кодирующий гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или SEQ ID NO.:2.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и медицинской генетике, и предназначено для прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к тест-системе связывания с лигандом для обнаружения присутствия гиббереллинов в образце. Изобретение позволяет эффективно обнаружить присутствие гиббереллинов в образце.
Наверх