Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией
Владельцы патента RU 2748901:
Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) (RU)
Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. Способ иммунохроматографического конкурентного анализа включает иммобилизацию специфических антител против определяемого соединения на поверхности маркерных частиц и в тестовой зоне рабочей мембраны, при этом образование окрашенного комплекса в тестовой зоне происходит при добавлении конъюгата белка-носителя с несколькими молекулами аналита за счет поливалентного взаимодействия, а в случае наличия в пробе определяемого соединения его молекулы блокируют активные центры антител как на маркерных частицах, так и в тестовой зоне. Техническим результатом является повышение чувствительности метода. 3 ил.
Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа, предназначенный для высокочувствительного выявления в пробах низкомолекулярных аналитов.
Иммунохроматографический анализ для определения различных антигенов может быть реализован в нескольких различных форматах. В аналитических системах с моновалентными антигенами комплексообразование антиген-антитело не регистрируется напрямую. В них реализуются конкурентные схемы анализа. Наиболее распространенным способом реализации конкурентной иммунохроматографии является схема, которая заключается в следующем:
На пористой мембране (как правило, нитроцеллюлозной) иммобилизуют конъюгат антигена с белком-носителем. Участок с нанесенным конъюгатом антигена с белком-носителем называют тестовой или аналитической зоной. На другой участок тест-полоски наносят конъюгат специфических антител с маркером (как правило, коллоидным золотом). Жидкость движется под действием капиллярных сил и смывает коллоидный конъюгат. Меченые антитела начинают с ее фронтом перемещаться по мембране. Если определяемый антиген в пробе отсутствует, то меченые антитела, дойдя до зоны с иммобилизованным антигеном, концентрируются там, образуя окрашенную полосу (Рис. 1, схема А). Присутствующие в пробе антигены блокируют активные центры антител, что делает невозможным их связывание с антигеном в аналитической зоне. Таким образом, отсутствие в тестовой зоне окрашенной полосы свидетельствует о положительном результате анализа (выявлении антигена в концентрации не ниже порогового уровня), тогда как формирование окрашенной полосы означает, что содержание антигена ниже детектируемого уровня. Такой способ конкурентной иммунохроматографии, например, был использован Зверевой и соавт. для определения антибиотика – хлорамфеникола [Zvereva E. A. et al. Cut-off on demand: adjustment of the threshold level of an immunochromatographic assay for chloramphenicol //Analytical Methods. – 2015. – Т. 7. – №. 15. – С. 6378-6384.]. Описанный в статье способ рассматривается в настоящей заявке как прототип.
Предметом изобретения является способ конкурентного иммунохроматографического анализа, в котором специфические антитела против определяемого соединения иммобилизуются и на поверхности маркерных частиц (Ab*) и в тестовой зоне рабочей мембраны (Abi), а конъюгат белка-носителя с несколькими молекулами антигена иммобилизуется на начальном участке теста (PAg). При попадании жидкой пробы на тест-полоску она смешивается сначала с компонентом PAg, затем – с Ab*, в результате чего происходит реакция с образованием комплекса PAg-Ab*. Под действием капиллярных сил компоненты жидкой пробы мигрируют вдоль тест-полоски и в тестовой зоне происходит взаимодействие иммобилизованных антител (Abi) с комплексом PAg-Ab* за счет наличия у PAg нескольких валентностей. В результате этого взаимодействия в тестовой зоне образуется тройной окрашенный комплекс Abi-PAg-Ab*. Образование этого комплекса может происходить и альтернативным путем: Abi вначале взаимодействует с непрореагировавшим PAg, а затем образовавшийся комплекс Abi-PAg вступает в реакцию со свободным конъюгатом Ab*. В случае наличия в пробе определяемого соединения оно взаимодействует с Ab*, блокируя возможность связывания Ab* как с PAg. После достижения фронтом жидкости тестовой зоны аналит также блокирует Abi, дополнительно снижая вероятность образования окрашенного комплекса Abi-PAg-Ab* (Рис. 1, схема Б). Таким образом, в отличие от прототипных методик, в предложенном способе конкурентной иммунохроматографии аналит блокирует не один, а два связывающих реагента, что повышает эффективность конкуренции и снижает предел детекции аналита.
Пример. Иммунохроматографическое конкурентное определение антибиотика – хлорамфеникола
Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий в себя рабочие нитроцеллюлозные мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6) и конечную адсорбирующую мембрану AP045.
Конъюгат коллоидного золота с моноклональными антителами против хлорамфеникола (клон B10) наносили на мембраны из раствора с OD520 = 2,0 в количестве 16 мкл на см полосы.
В стандартной схеме конкурентной иммунохроматографии аналитическая зона была образована конъюгатом хлорамфеникола с бычьим сывороточным альбумином (10:1 моль/моль). На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в 50 мМ фосфатно-солевом буфере pH 7,4).
В альтернативной схеме, которая является предметом разработки, в аналитической зоне иммобилизовали антитела B10 в концентрации 1 мг/мл. На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в 50 мМ фосфатно-солевом буфере pH 7,4). Конъюгат хлорамфеникола с бычьим сывороточным альбумином наносили на мембрану для нанесения образца из раствора с концентрацией 0,2 мкг/мл и высушивали в течение ночи при комнатной температуре.
После сборки мембранных компонентов их разрезали на полоски шириной 3,5 мм. Каждую полоску упаковывали в ламинированную алюминиевую фольгу с помощью мини-конвейера, используя 0,5 г расфасованного силикагеля в качестве осушителя. Нарезка и упаковка производились при 20–22 ° C в специальной комнате с относительной влажностью не более 30%.
Полученные результаты иммунохроматографического тестирования градуировочных растворов, содержащих известные концентрации хлорамфеникола, представлены на рис. 2 (для прототипного способа) и рис. 3 (для предложенного альтернативного способа). Как видно из представленных данных, предел детекции хлорамфеникола предложенным способом иммунохроматографии (1 нг/мл) на порядок ниже, чем прототипным способом (10 нг/мл), что подтверждает эффективность предложенного подхода.
Способ иммунохроматографического конкурентного анализа, отличающийся тем, что специфические антитела против определяемого соединения иммобилизуются и на поверхности маркерных частиц и в тестовой зоне рабочей мембраны; причем образование окрашенного комплекса в тестовой зоне происходит при добавлении конъюгата белка-ностителя с несколькими молекулами аналита за счет поливалентного взаимодействия; а в случае наличия в пробе определяемого соединения его молекулы блокируют активные центры антител как на маркерных частицах, так и в тестовой зоне.
