Универсальный эпигеномный репрессор транскрипции целевых генов в клетках человека

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к эпигеномному репрессору транскрипции гена или генов в клетках человека, исключая клетки зародышевой линии человека, представляющему собой белок dCas9, соединенный линкером с белком DNMT3a-L, который соединен линкером с репрессорным доменом KRAB, который соединен линкером с белком МеСР2. Изобретение эффективно для научных экспериментов в области фундаментальной клеточной биологии, биомедицинских исследований при моделировании наследственных заболеваний, а также в терапии наследственных заболеваний. 3 ил.

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно, к генной инженерии. Предлагаемый репрессор может быть использован для научных экспериментов в области фундаментальной клеточной биологии, биомедицинских исследований при моделировании наследственных заболеваний, а также в терапии наследственных заболеваний. Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

В настоящее время известно несколько технологий контроля экспрессии целевого гена в клетках млекопитающих. Широко используется РНК-интерференция (RNAi). RNAi, однако, имеет ряд ограничений, например, неполный нокдаун экспрессии и большое количество нецелевых мишеней (Krueger U, Bergauer Т, Kaufmann В, Wolter I, Pilk S, Heider-Fabian M, Kirch S, Artz-Oppitz C, Isselhorst M, Konrad J, Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNA validation screening, Oligonucleotides, 2007; 17(2): 237-2S0.; Sigoillot FD, Lyman S, Huckins JF, Adamson B, Chung E, Quattrochi B, King RW, A bioinformatics method identifies prominent off-targeted transcripts in RNAi screens," Nat Methods. 2012; 9(4): 363-6).

Более специфичными являются технологии на основе ДНК-связывающих белков с доменами цинковых пальцев или эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), слитые с доменами-репрессорами транскрипции, например, KRAB (Margolin JF1, Friedman JR, Meyer WK, Vissing H, Thiesen HJ, Rauscher FJ 3 rd., Kriippel-associated boxes are potent transcriptional repression domains, Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(10): 4509-13.).

Однако для каждой отдельной мишени требуется создание дизайна и последовательности гена отдельного белка, что является достаточно долгой и весьма трудозатратной процедурой (Gaj Т, Gersbach СА, Barbas CF 3 rd., ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering, Trends Biotechnol. 2013; 31(7): 397-405; Joung JK, Sander JD, "TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing," Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14(1): 49-55).

Современная технология редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 (Jinek М, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E, A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science. 2012; 337(6096): 816-21; Cho SW, Kim S, Kim JM, Kim JS, Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease, Nat Biotechnol. 2013; 31(3): 230-2) может быть трансформирована для получения универсальных искусственных репрессоров. Ключевыми компонентами системы являются РНК-зависимая ДНК эндонуклеаза Cas9 и направляющая РНК. Направляющая РНК состоит из конститутивной структурной части, распознаваемой Cas9 и геном-специфичной вариабельной части, которая нацеливает Cas9 на специфичный участок генома.

Введение двух мутаций D10A и Н840А в последовательность гена Cas9 лишает белок Cas9 способности разрезать ДНК, однако сохраняет его способность связывать направляющую РНК и распознавать целевой локус генома (Qi LS, Larson МН, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA, Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression, Cell. 2013; 152(5): 1173-83). Такой белок получил название dCas9. Изменить специфичность dCas9 белка очень легко путем изменения вариабельной части направляющей РНК. Будучи направленным на сайт инициации транскрипции, dCas9 способен подавлять экспрессию гена (Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA, Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression, Cell. 2013; 152(5): 1173-83).

Однако эффективность этого способа контроля экспрессии гена невысокая, так как он требует знания точного положения старта транскрипции и не эффективен в случае, если у гена несколько стартов транскрипции.

Эффективность ингибирования транскрипции в свое время была повышена путем добавления к dCas9 Kruppel-ассоциированного домена репрессии (KRAB) (Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS, CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes, Cell. 2013; 154(2): 442-51; Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, Guimaraes C, Panning B, Ploegh HL, Bassik MC, Qi LS, Kampmann M, Weissman JS, Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation, Cell. 2014; 159(3): 647-61; Thakore PI, Black JB, Hilton IB, Gersbach CA, Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation, Nat Methods. 2016; 13(2): 127-37) или гистон-метил трансферазы Ezh2 (O'Geen H., Bates SL., Carter SS. Nisson KA, Halmai J, Fink KD, Rhie SK, Farnham PJ, Segal DJ. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin. 2019; 12, 26).

Тем не менее, для достаточно большого числа генов эффективность таких искусственных репрессоров с одним доменом до сих пор не высока, что стимулирует разработку новых эффективных репрессоров транскрипции.

На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих аналогах.

Известны способы применения CRISPR/Cas9 систем для редактирования паттернов экспрессии генов человека, в том числе применение белка dCas9, слитого с доменами активации транскрипции VP64 или репрессии транскрипции KRAB или SID4X (RU 2725502, С2).

Известны также способы применения CRISPR/Cas9 систем для целенаправленного воздействия и терапии в клетках печени, в том числе применения белка dCas9, слитого с доменами активации транскрипции VP64 или репрессии транскрипции KRAB или SID4X (RU 2716420, С2).

Кроме того, известны различные способы и составы лечения болезни Хантингтона с применением CRISPR/Cas9 систем, в то числе с применением белка dCas9, слитого с такими репрессорами транскрипции как ДНК-метилтрансфераза 3А (DNMT3A) или метил-CpG-связывающий белок (МеСР) (RU 22639277, С2).

Однако, как было уже упомянуто ранее, подобные репрессорные системы первого поколения с одним доменом репрессии не обеспечивают достаточную эффективность ингибирования транскрипции для ряда генов.

В качестве прототипа нами выбран искусственный репрессор, представляющий собой химерный белок dCas9-KRAB-MeCP2, в котором к KRAB домену добавлен метил-CpG-связывающий белок 2 (МеСР2). (Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y, Menn D, Milanova D, Kuo C-C, Guo X, Sharma S, Tung A, Cecchi RJ, Tuttle M, Pradhan S, Lim ET, Davidsohn N, Ebrahimkhani MR, Collins JJ, Lewis NE, Kiani S, Church GM. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018; 15, 611-616).

Однако этот репрессор не эффективен в случае тех генов, где не эффективен репрессор dCas9-KRAB (O'Geen Н., Bates SL., Carter SS. Nisson KA, Halmai J, Fink KD, Rhie SK, Farnham PJ, Segal DJ. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin. 2019; 12, 26).

Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка высокоэффективного универсального репрессора транскрипции генов в клетках человека, исключая модификацию генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемого репрессора, заключается в обеспечении эффективной репрессии транскрипции гена за счет одновременного действия на него факторов репрессии KRAB и МеСР2 и CpG-метилирования посредством ДНК-метилтрансферазы DNMT3a-L.

Благодаря наличию в составе предлагаемого репрессора ДНК-метилтрансферазы, он может использоваться не только для изменения экспрессии различных генов, но и для метилирования регуляторных участков генов, что также подавляет экспрессию генов. Универсальность предполагаемого репрессора также обеспечивается за счет изменения последовательности направляющей РНК; модификация самого репрессора не требуется. При использовании нескольких направляющих РНК предлагаемый репрессор может быть использован для одновременного подавления экспрессии нескольких генов.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предложен эпигеномный репрессор транскрипции гена или генов в клетках человека, исключая клетки зародышевой линии человека, представляющий собой белок dCas9, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 1, соединенный линкером 1, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2, с белком DNMT3a-L, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 3, который соединен линкером 2, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 4, с репрессорным доменом KRAB, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 5, который соединен линкером 3, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6, с белком МеСР2, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 7.

Белок dCas9 - это белок Cas9, содержащий две мутации D10A и Н840А

и лишенный эндонуклеазной активности.

Белок DNMT3a-L - это химерный белок мышиной ДНК-метилтрансферазы DNMT3a, состоящий из двух слитых субъединиц 3а и 3L.

Репрессорный домен KRAB - это Kruppel-ассоциированный домен репрессии человека.

Белок МеСР2 - это метил-CpG-связывающий белок 2 человека.

Заявлена универсальная система высокоэффективной репрессии транскрипции целевых генов на основе химерного белка - искусственного регулятора транскрипции, состоящего из белка dCas9, белка DNMT3a-L, репрессорного домена KRAB и белка МеСР2, связанных тремя оригинальными линкерами последовательно между собой.

Готовая последовательность гена, кодирующего созданный химерный белок-репрессор, состоит из последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующей кодон-оптимизированный для экспрессии в клетках человека белок - dCas9 (содержит 1368 а.о), соединенной линкером 1, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2, с последовательностью SEQ ID NO: 3, кодирующей химерный белок мышиной ДНК-метилтрансферазы - DNMT3a-L, состоящий из двух слитых субъединиц 3а и 3L (содержит 564 а.о.), соединенной линкером 2, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 4, с последовательностью SEQ ID NO: 5, кодирующей Kruppel-ассоциированный репрессорный домен человека - KRAB (содержит 65 а.о.), и соединенной линкером 3, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6, с последовательностью SEQ ID NO: 7, кодирующей метил-CpG-связывающий белок 2 человека - МеСР2 (содержит 298 а.о.).

В настоящий момент данный ген клонирован в лентивирусный вектор Lenti-SIC1-GS-dnmt3A-3L (фиг. 1), обеспечивающий экспрессию искусственного репрессора транскрипции, который содержит также репортерный зеленый флуоресцентный белок eGFP и селективный маркер пуромицин-N-ацетилтранферазу. Вектор имеет размер 15675 п.н.

Искусственный репрессор может быть доставлен в клетку в виде плазмидного вектора, в виде лентивирусного вектора или готового белка, наработанного и очищенного из штамма-продуцента.

Направляющая РНК может быть доставлена в клетку в виде плазмидного вектора pU6-gRNA, в виде лентивирусного вектора, в виде готовой РНК, созданной при помощи химического синтеза или Т7-транскрипции.

Репрессор и направляющая РНК могут быть доставлены в клетку при помощи липофекции, кальций-фосфатной преципитации, электропорации, микроинъекции.

После доставки всех компонентов в клетку, репрессорный комплекс с помощью направляющей РНК связывается с регуляторной областью целевого гена и подавляет его экспрессию, привлекая другие внутриклеточные репрессоры транскрипции, а также производя CpG-метилирование.

Для доказательства эффективности предлагаемого искусственного репрессора мы продемонстрировали его работу на примере метилирования энхансера гена эпоксидгидролазы (ЕРНХ2) и подавления экспрессии гена допа-декарбоксилазы (DDC) в нейрональной линии клеток SH-S5Y5 (Biedler J.L., Helson L., Spengler B.A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture // Cancer research. - 1973. - T. 33. - №. 11. - C. 2643-2652).

Внутри энхансера EPHX2 мы выбрали три участка-мишени для связывания репрессора, к каждому из которых подобрали по две последовательности направляющей РНК. На фиг. 2 представлены результаты MS-HRM анализа (Wojdacz Т.K., Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation // Nucleic acids research. - 2007. - T. 35. - №. 6. - C. e41) этого энхансера. Представлен график первой производной от графика плавления фрагментов ДНК. Кривые r1, r2 и r3 демонстрируют уровень метилирования первого, второго и третьего участков-мишеней, соответственно. Кривые 100% 5 mC и 0% 5 mC демонстрируют контроли гиперметилирования и гипометилирования, соответственно. Видно, что при заражении пустым вектором, не несущим последовательности направляющих РНК, уровень метилирования не изменяется. В то же время при заражении вектором, кодирующим направляющие РНК, уровень метилирования энхансера в третьем участке r3 значительно возрастает по сравнению с пустым вектором, r1 и r2, где направляюще РНК были написаны на другие участки энхансера.

На фиг. 3 представлены результаты ПЦР в реальном времени в виде относительных уровней экспрессии генов DDC, Tub-A и dCas9. В качестве опытных образцов взяты клетки, экспрессирующие искусственный репрессор транскрипции, в качестве контрольных - клетки без репрессора. Разброс данных представлен стандартным отклонением от среднего (n=3). ***р<0.001. Статистическая значимость рассчитана с помощью двустороннего критерия Стьюдента для сравнения двух независимых средних. Сравнивали значения в парах DCC/Tub-A, Cas9/Tub-A. Поскольку с введением в клетки гена репрессора уровень экспрессии гена Tub-A не меняется, его относительный уровень экспрессии равен единице и принят в качестве контроля.

На фиг. 3 видно, что в опытных клетках уровень мРНК dCas9 значительно повышен, что свидетельствует об эффективной экспрессии химерного репрессора на основе dCas9; понижение уровня экспрессии гена-мишени DCC свидетельствует о репрессии транскрипции данного гена вследствие работы искусственного репрессора.

Следует понимать, что данное описание и фигуры служат только для иллюстрации осуществления изобретения, и не ограничивают объема настоящего изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский

университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской

Федерации (Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie

vysshego obrazovaniya «Rossijskij natsionalnyj issledovatelskij meditsinskij

universitet imeni N.I. Pirogova» Ministerstva zdravookhraneniya Rossijskoj

Federatsii)

<120> Универсальный эпигеномный репрессор транскрипции целевых генов в

клетках человека

<160> 7

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 4104

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая белок dCas9

<400> 1

atggacaaga agtactccat tgggctcgct atcggtacca acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggagcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagctggtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcac 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga ggagaacccg 600

atcaacgcat ccggcgttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc tgcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctga acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgctcg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagagac gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatggcatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aaccggttgt ccgactacga cgtggatgct 2520

atcgtgcccc aaagctttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc tggaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc gcaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatccagct tcgagaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgaag cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gctgcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgagttctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agac 4104

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая линкер между белком dCas9 и белком

DNMT3a-L

<400 >2

ggcaccggcg ggcccaagaa gaagaggaag gtatacccat acgatgttcc tgactatgcg 60

ggctatccct atgacgtccc ggactatgca ggatcgtatc cttatgacgt tccagattac 120

gctgGATCCA TGGGCAGCAG CCATCATCAT CAtcatcaca gcagcggcct ggtgccgcgc 180

ggcagccat 189

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 1632

<212>ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая белок DNMT3a-L

<400> 3

atgaaccatg accaggaatt tgacccccca aaggtttacc cacctgtgcc agctgagaag 60

aggaagccca tccgcgtgct gtctctcttt gatgggattg ctacagggct cctggtgctg 120

aaggacctgg gcatccaagt ggaccgctac attgcctccg aggtgtgtga ggactccatc 180

acggtgggca tggtgcggca ccagggaaag atcatgtacg tcggggacgt ccgcagcgtc 240

acacagaagc atatccagga gtggggccca ttcgacctgg tgattggagg cagtccctgc 300

aatgacctct ccattgtcaa ccctgcccgc aagggacttt atgagggtac tggccgcctc 360

ttctttgagt tctaccgcct cctgcatgat gcgcggccca aggagggaga tgatcgcccc 420

ttcttctggc tctttgagaa tgtggtggcc atgggcgtta gtgacaagag ggacatctcg 280

cgatttcttg agtctaaccc cgtgatgatt gacgccaaag aagtgtctgc tgcacacagg 540

gcccgttact tctggggtaa ccttcctggc atgaacaggc ctttggcatc cactgtgaat 600

gataagctgg agctgcaaga gtgtctggag cacggcagaa tagccaagtt cagcaaagtg 660

aggaccatta ccaccaggtc aaactctata aagcagggca aagaccagca tttccccgtc 720

ttcatgaacg agaaggagga catcctgtgg tgcactgaaa tggaaagggt gtttggcttc 780

cccgtccact acacagacgt ctccaacatg agccgcttgg cgaggcagag actgctgggc 840

cgatcgtgga gcgtgccggt catccgccac ctcttcgctc cgctgaagga atattttgct 900

tgtgtgtcta gcggcaatag taacgctaac agccgcgggc cgagcttcag cagcggcctg 960

gtgccgttaa gcttgcgcgg cagccatatg ggccctatgg agatatacaa gacagtgtct 1020

gcatggaaga gacagccagt gcgggtactg agccttttta gaaatattga taaagtacta 1080

aagagtttgg gctttttaga aagcggttct ggttctgggg gaggaacgct gaagtacgtg 1140

gaagatgtca caaatgtcgt gaggagagac gtggagaaat ggggcccctt tgacctggtg 1200

tacggctcga cgcagcccct aggcagctcc tgtgatcgct gtcccggctg gtacatgttc 1260

cagttccacc ggatcctgca gtatgcgctg cctcgccagg agagtcagcg gcccttcttc 1320

tggatattca tggacaatct gctgctgact gaggatgacc aagagacaac tacccgcttc 1380

cttcagacag aggctgtgac cctccaggat gtccgtggca gggactacca gaatgctatg 1440

cgggtgtgga gcaacattcc agggctgaag agcaagcatg cgcccctgac cccaaaggaa 1500

gaagagtatc tgcaagccca agtcagaagc aggagcaagc tggacgcccc gaaagttgac 1560

ctcctggtga agaactgcct tctcccgctg agagagtact tcaagtattt ttctCAAAAC 1620

TCACTTCCTC TT 1632

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 102

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая линкер между белком DNMT3a-L и

реперссорным доменом KRAB

<400> 4

GGTGgatccg ctggaggagg tggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggtagcgga 60

cctaagaaaa agaggaaggt gcgatccctt acggcatggt cg 102

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 195

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая репрессорный домен KRAB

<400> 5

agaacactgg ttacgttcaa ggacgtgttt gtggacttta cacgtgagga gtggaaattg 60

ctggatactg cgcaacaaat tgtgtatcga aatgtcatgc ttgagaatta caagaacctc 120

gtcagtctcg gataccagtt gacgaaaccg gatgtgatcc ttaggctcga aaagggggaa 180

gaaccttggc tggta 195

<210> SEQ ID NO: 6

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая линкер между репрессорным доменом KRAB

и белком MeCP2

<400> 6

tcgggaggtg gttcgggtgg ctctggatca agcccaaaga agaaacggaa ggtggaagcc 60

tca 63

<210> SEQ ID NO: 7

<211> 861

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность, кодирующая белок MeCP2

<400> 7

gtgcaggtga aaagggtgct ggaaaaatcc cccggcaaac tcctcgtgaa gatgcccttc 60

caggcttccc ctggcggaaa aggtgaaggg ggtggcgcaa ccacatctgc ccaggtcatg 120

gtcatcaagc gacctggaag gaaaagaaag gccgaggctg accctcaggc cattccaaag 180

aaacggggac gcaagccagg gtccgtggtc gcagctgcag cagctgaggc taagaaaaag 240

gcagtgaagg aaagctccat ccgcagtgtg caggagactg tcctgcccat caagaagagg 300

aaaactaggg agaccgtgtc catcgaggtc aaagaagtgg tcaagcccct gctcgtgtcc 360

accctgggcg aaaaatctgg aaaggggctc aaaacatgca agtcacctgg acggaaaagc 420

aaggagtcta gtccaaaggg gcgctcaagc tccgcttcta gtccccctaa aaaggaacac 480

catcaccatc accatcacgc cgagtctcct aaggctccta tgccactgct cccaccacct 540

ccaccacctg agccacagtc aagcgaagat cccatcagcc cacccgagcc tcaggatctg 600

tcctctagta tttgcaaaga ggaaaagatg cccagagcag gcagcctgga gagtgatggc 660

tgtccaaaag aacccgccaa gacccagcct atggtggcag ccgctgcaac taccaccaca 720

accacaacta ccacagtggc cgaaaaatac aagcatcgcg gcgagggcga acgaaaggac 780

attgtgtcaa gctccatgcc cagacctaac cgggaggaac cagtcgatag taggacaccc 840

gtgactgaga gagtctcatg a 861

<---

Эпигеномный репрессор транскрипции гена или генов в клетках человека, исключая клетки зародышевой линии человека, представляющий собой белок dCas9, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 1, соединенный линкером 1, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2, с белком DNMT3a-L, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 3, который соединен линкером 2, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 4, с репрессорным доменом KRAB, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 5, который соединен линкером 3, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6, с белком МеСР2, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 7.