Способ определения лозартана, его основного метаболита лозартан карбоновой кислоты и глибенкламида в сыворотке крови и моче человека

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для пробоподготовки при одновременном определении лозартана, его метаболита лозартанкарбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и/или моче человека. В предварительно приготовленные калибровочные и анализируемые образцы, представляющие собой сыворотку крови и/или мочу человека, добавляют эффективное количество внутреннего стандарта, представляющего собой раствор прометазина в концентрации 100 нг/мл. Далее добавляют эффективное количество осадителя белка, представляющего собой неразбавленный ацетонитрил, затем перемешивают до однородного состояния, с последующим центрифугированием при центробежном ускорении 15294 g до разделения на твердую и жидкую фазы, с дальнейшим отбором эффективного количества супернатанта. Проводят хроматографическое разделение компонентов пробы в режиме градиентного элюирования с последующим детектированием сигнала при положительной ионизации для лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина. Данный способ применяют для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и/или моче человека. Способ обеспечивает возможность осуществления пробоподготовки для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида, позволяющего определять анализируемые вещества, при совместном или отдельном их присутствии в сыворотке крови и/или моче человека за счет использования унифицированной схемы пробоподготовки образцов для всех анализируемых веществ с применением неразбавленного ацетонитрила, центрифугирования пробы один раз, применения прометазина, в качестве единого внутреннего стандарта для всех анализируемых веществ. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 6 табл., 10 пр.

 

Изобретение относится к фармации, к фармакологии и клинической фармакологии, к исследованию биологических материалов, в частности, к способам определения лозартана, его основного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и (или) моче человека при терапевтическом лекарственном мониторинге и исследованиях фармакокинетики.

Уровень техники

Пациенты, страдающие совокупностью таких заболеваний как артериальная гипертензия и сахарный диабет 2-го типа, часто обязаны принимать лозартан и глибенкламид, совместно. При этом отсутствует простой эффективный, чувствительный, селективный, точный и воспроизводимый способ пробоподготовки для определения низких концентраций лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека.

Из уровня техники известен способ для определения лозартана в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [1]. В данной работе к образцам плазмы крови или мочи (200 мкл) добавляют раствор внутреннего стандарта, аналиты экстрагируют с использованием 2 мл метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ), затем встряхивают и центрифугируют, после замораживания водной фазы органический слой (МТБЭ) отбирают и высушивают в токе азота, сухой остаток растворяют в 200 мкл подвижной фазы. Хроматографическое разделение проводят с использованием колонки Hypersil С18, 4,6 мм × 250 мм, диаметр частиц сорбента 3,5 мкм (Thermo), элюирование осуществляют в изократическом режиме подвижной фазой состоящей из смеси ацетонитрил:0,1% муравьиная кислота (60:40, v/v).

Недостатками данного способа являются:

- невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

- используется жидкостная экстракция в качестве способа пробоподготовки с дальнейшим замораживанием водной фазы (в течение 40 минут), что удлиняет время подготовки аналита к анализу;

- использование изократического режима элюирования удлиняет время анализа проб;

В другом известном способе для определения лозартана и его метаболита в плазме крови и моче человека [2] предложена схема пробоподготовки осаждение белков ацетонитрилом. Хроматографическое разделение проводится в режиме градиентного элюирования с подвижной фазой А (0,1 М ацетат аммония)/ В (ацетонитрил) на колонке CAPCELL РАК С18, длиной 15×x2 мм, диаметром частиц сорбента 5 мкм с масс-спектрометрическим детектором.

К недостаткам этого способа следует отнести:

- невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

- увеличение времени пробоподготовки плазмы крови в связи с тем, что после осаждения пробы ацетонитрилом, супернатант высушивают, растворяют в 300 мкл метанола, высушивают и перерастворяют в 100 мкл метанола и фильтруют;

- предложено перед осаждением проб мочи ацетонитрилом инкубировать их (3-глюкуронидазой в ацетате натрия в течение 24 ч в водяной бане при 37°С, что приводит к увеличению времени пробоподготовки аналитов;

- длительное время хроматографического разделения (общее время анализа 13 мин).

В качестве прототипа выбран известный способ для определения глибенкламида в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [3]. Пробоподготовку осуществляют путем осаждения белков в плазме крови и моче ацетонитрилом, содержащим 0,1% муравьиную кислоту, с последующим встряхиванием в течение 3 мин и центрифугированием в течение 10 мин при 14000 g, далее 500 мкл супернатанта разбавляют ультрачистой водой в соотношении 1:2 (об/об), еще раз центрифугируют в течение 10 минут. Хроматографическое разделение проводится в режиме градиентного элюирования с подвижной фазой А (0,1% раствор муравьиной кислоты в воде) / В (0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) на колонке UPLC®HSS Суапо, 2,1 мм × 100 мм, диаметр частиц сорбента 1,8 мкм с масс-спектрометрическим детектором.

К недостаткам данного способа следует отнести:

невозможность определения глибенкламида совместно с лозартаном и его активным метаболитом Е-3174 в сыворотке и (или) моче;

разбавление проб приводит к меньшей чувствительности метода;

диапазон концентраций 125-2000 нг/мл не позволяет определять концентрации ниже 125 нг/мл;

необходимость оборудования, обеспечивающего работу при сверхвысоком давлении, из-за использования сорбента с диаметром частиц 1,8 мкм. Таким образом, существует потребность в разработке простого, эффективного, чувствительного, селективного, точного и воспроизводимого способа для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека.

Сущность изобретения

Технической задачей заявленного изобретения является - разработка эффективного, простого способа пробоподготовки без применения сильных неорганических кислот, расширение аналитического диапазона, достижения высокой чувствительности, селективности, точности и воспроизводимости для определения лозартана, его активного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174), являющийся маркером активности CYP2C9, и глибенкламида, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке крови человека и (или) моче; применение единого внутреннего стандарта.

Техническим решением предлагаемого изобретения является то, что заявленный способ для определения лозартана, его метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида, характеризуется эффективностью, селективностью, чувствительностью, точностью, с широким линейным диапазоном, позволяющим определять анализируемые вещества, при совместном или отдельном их присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

Кроме того, настоящее техническое решение - является эффективным для применения в области клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга путем исследования сыворотки крови и (или) мочи пациента.

Технический результат предложенного изобретения достигается благодаря тому, что:

- используют неразбавленный ацетонитрил, в качестве осадителя белков в сыворотке крови и (или) мочи, что позволяет унифицировать схему пробоподготовки образцов для всех анализируемых веществ и сделать ее единой для сыворотки крови и (или) мочи, что приводит к уменьшению времени пробоподготовки;

- применяют прометазин в качестве единого внутреннего стандарта для всех анализируемых веществ в сыворотке крови и (или) в моче;

- при проведении пробоподготовки центрифугируют пробу один раз;

- детектируют при положительной ионизации анализируемых компонентов. Описание изобретения

В заявленном способе для определения лозартана, основного метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ) (Фиг. 1-3), как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке и (или) моче человека осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Для количественного определения концентраций требуется приготовления набора стандартных растворов определяемых веществ, то есть, растворов с точно известной концентрацией, для дальнейшего приготовления из них калибровочных растворов, которые необходимы для построения калибровочной кривой, по которой определяются концентрации аналитов исследуемых образцов.

Калибровочные образцы готовят путем прибавления к 180 мкл интактной сыворотки крови и (или) моче 20 мкл соответственно одного из стандартных растворов лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида до получения их концентраций в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови и (или) мочи пациента проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мл биологического образца, помещенного в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина, взятого в концентрации 100,00 нг/мл, затем прибавляют 600 мкл неразбавленного ацетонитрила от 99,9% масс., смешивают в смесителе типа «вортекс» до полного перемешивания (однородного состояния), предпочтительнее в течение не менее 15 с; затем центрифугируют до разделения содержимого на твердую и жидкую фазы, с центробежным ускорением 15294 g в течение в течение от 10 до 20 минут, наиболее предпочтительно в течение 15 минут; затем 500 мкл надосадочной жидкости (супернатант) переносят в хроматографические виалы с дальнейшим помещением в автоматический пробоотборник хроматографа.

Неожиданно было обнаружено, что для извлечения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида из сыворотки крои и (или) мочи человека, целесообразно использовать неразбавленный ацетонитрил, в качестве осадителя белков, который позволяет наиболее эффективно извлекать аналиты анализируемых веществ из сыворотки крови человека и (или) мочи человека.

Таким образом, использование неразбавленного ацетонитрила, в качестве осадителя белков для аналитов анализируемой группы веществ, в виде лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека, приводит к более эффективному, точному и воспроизводимому анализу, характеризующемуся способностью, наиболее эффективно дифференцировать аналиты анализируемых веществ в сыворотке крови и (или) моче человека.

Также, неожиданно было обнаружено, что применение неразбавленного ацетонитрила, в качестве осадителя белка для анализируемой группы веществ, в виде лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида и внутреннего стандарта представляющий собой раствор прометазина, при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека, приводят к уменьшению времени пробоподготовки, в связи с тем, что позволяют использовать единую пробоподготку для сыворотки крови и (или) мочи, и что позволяют экономить время при проведении анализа.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что настоящее техническое решение с заявленным техническим результатом - является эффективным для применения в области клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга и при проведении исследования сыворотки крови и (или) мочи пациента.

Условия хроматографического разделения и детектирования

Количественное определение лозартана, его метаболита лозартан карбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида (ГЛБ), проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем). Обработку первичных данных проводят при помощи соответствующего программного обеспечения.

Колонка (неподвижная фаза), для проведения ВЭЖХ МС/МС. Выбрана колонка размером 50×4,6 мм с привитой фазой С18 из группы XBridge и сорбентом с диаметром частиц 3,5 мкм, с универсальной предколонкой С18, 4×3,0 мм, что обеспечивает рабочее давлении в системе, не превышающее 17МПа.

Температура термостата колонок: 40°С.

Подвижная фаза:

- Элюент А: 0,1% (об.) раствор муравьиная кислота/деионизированная вода

- Элюент В: 0,1% (об.) раствор муравьиная кислота/ ацетонитрил

Градиентный режим элюирования по составу подвижной фазы представлен в таблице 1.

Градиентный режим элюирования по скорости потока подвижной фазы представлен в таблице 2.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-5,3 мин.

Время удерживания прометазина: 1,59±0,02 мин Время удерживания лозартана: 1,88±0,02 мин Время удерживания Е-3174: 2,19±0,02 мин Время удерживания глибенкламида: 2,67±0,02 мин

Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десольвации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.

Условия детектирования лозартана, его основного метаболита Е-3174 и прометазина (внутренний стандарт) и глибенкламида в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 3.

Полученные калибровочные кривые имеют линейный характер в диапазоне концентраций, для анализируемых веществ от 1 нг/мл до 1000 нг/мл в сыворотке крови и (или) моче человека, с соответствующими коэффициентами корреляции (Фиг. 4-9). Правильность и прецизионность результатов рассчитывают в соответствии с требованиями Руководства по экспертизе лекарственных средств [4]. Правильность измерений (Е, %) не превышает 6,33%, а относительное стандартное отклонение, позволяющее оценить прецизионность результатов, имеет значение не более 12,32% (Таблица 4-6).

Предложенный способ позволяет:

Отказаться от использования сильных неорганических кислот при пробоподготовке и использовать в качестве осадителя белков неразбавленный ацетонитрил.

Получить аналитические диапазоны, для анализируемых веществ от 1 нг/мл до 1000 нг/мл за счет унификации пробоподготовки.

Повысить эффективность, чувствительность, селективность, точность и воспроизводимость предлагаемого способа для определения комбинации лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека.

Использовать прометазин в качестве единого и доступного стандарта.

Расширить спектр аналитических методик для определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и (или) моче человека при хроматографическом разделении на сорбенте с диаметром частиц 3,5 мкм, при рабочем давлении в системе не более 17МПа при сохранении скорости анализа.

Количественное определение изучаемых веществ в моче человека позволяет использовать неинвазивный метод отбора проб.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-15).

Фиг. 1. Структурная формула лозартана.

Фиг. 2. Структурная формула активного метаболита лозартана (Е-3174).

Фиг. 3. Структурная формула глибенкламида.

Фиг. 4. Калибровочная зависимость отношения площади пика лозартана к площади пика прометазина от отношения концентрации лозартана к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 5. Калибровочная зависимость отношения площади пика Е-3174 к площади пика прометазина от отношения концентрации Е-3174 к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 6. Калибровочная зависимость отношения площади пика глибенкламида к площади пика прометазина от отношения концентрации глибенкламида к концентрации прометазина в сыворотке крови.

Фиг. 7. Калибровочная зависимость отношения площади пика лозартана к площади пика прометазина от отношения концентрации лозартана к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 8. Калибровочная зависимость отношения площади пика Е-3174 к площади пика прометазина от отношения концентрации Е-3174 к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 9. Калибровочная зависимость отношения площади пика глибенкламида к площади пика прометазина от отношения концентрации глибенкламида к концентрации прометазина в моче.

Фиг. 10. Хроматограмма образца сыворотки крови пациента с содержанием лозартана 11,39 нг/мл, Е-3174 57,49 нг/мл, глибенкламида 12, 28 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 11. Хроматограмма образца сыворотки крови пациента с содержанием глибенкламида 21,27 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 12. Хроматограмма образца сыворотки крови человека, принимавшего лозартан в дозе 25 мг, с содержанием 8,68 нг/мл лозартана, Е-3174 133,66 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина с концентрацией 3,33 нг/мл.

Фиг. 13. Хроматограмма образца сыворотки крови человека, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, с содержанием 103,89 нг/мл лозартана, Е-3174 489,6 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина с концентрацией 3,33 нг/мл.

Фиг. 14. Хроматограмма образца интактной сыворотки крови человека не содержащего лозартан, Е-3174, глибекламид и прометазин.

Фиг. 15. Хроматограмма образца мочи пациента с содержанием лозартана 430,51 нг/мл, Е-3174 155,59 нг/мл, глибенкламида 1,05 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 16. Хроматограмма образца мочи пациента, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, с содержанием лозартана 516,7 нг/мл, Е-3174 929,23 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 17. Хроматограмма образца мочи пациента, принимавшего глибенкламид в дозе 7 мг, с содержанием глибенкламида 9,7 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 3,33 нг/мл.

Фиг. 18. Хроматограмма образца интактной мочи человека не содержащего лозартан, Е-3174, глибекламид и прометазин.

Возможность осуществления заявляемого изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1. Определение содержания лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови человека.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной терапии глибенкламидом (глибенкламид микронизированный 3,5 мг), а в день исследования принимал в терапевтически эффективных дозировках 50 мг лозартана. Отбор крови производили непосредственно перед приемом лозартана и глибенкламида, а также через 4 часа после приема указанных препаратов. Проведение анализа.

1. Получение сыворотки крови человека. Забор крови производят в вакуумные пробирки. Кровь, взятую у пациента, выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. По истечении 30 минут пробирки центрифугируют не менее 15 минут при 3000 об/мин. Затем аликвоту полученной сыворотки переносят в пробирки типа Eppendorf Save Lock вместимостью 2 мл для дальнейшей пробоподготовки.

2. Калибровочные образцы готовят путем прибавления к интактной сыворотке крови и/или моче 20 мкл стандартных растворов лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида до получения концентраций в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл.

3. Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови и (или) мочи человека проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мкл биологического образца, помещенным в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина в концентрации 100 нг/мл, затем прибавляют 600 мкл неразбавленного ацетонитрила, перемешивают в смесителе типа «вортекс» до полного перемешивания в течение не менее 15 с; затем центрифугируют до разделения содержимого на твердую и жидкую фазы с центробежным ускорением 15294 g в течение от 10 мин до 20 мин, наиболее предпочтительно в течение 15 мин. Затем 500 мкл надосадочной жидкости (супернатант) переносят в хроматографические виалы и помещают в автоматический пробоотборник хроматографа.

4. Количественное определение лозартана, метаболита Е-3174 и ГЛБ проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем). Обработку первичных данных проводят при помощи соответствующего программного обеспечения.

Колонка (неподвижная фаза), для проведения ВЭЖХ МС/МС. Выбрана колонка размером 50×4,6 мм с привитой фазой С18 из группы XBridge и сорбентом 3,5 мкм, с универсальной предколонкой С18,4×3,0 мм.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-5,3 мин.

Время удерживания прометазина: 1,59±0,02 мин

Время удерживания лозартана: 1,88±0,02 мин

Время удерживания Е-3174: 2,19±0,02 мин Время удерживания глибенкламида: 2,67±0,02 мин

Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десольвации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.

Условия детектирования лозартана, его основного метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина, в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 3.

Обнаружено лозартана 11,39 нг/мл, лозартан-карбоксилат (Е-3174) 57,49 нг/мл и глибенкламида 12,28 нг/мл (Фиг. 10). От момента забора крови до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.

Данный пример показывает возможность определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови человека заявленным способом.

Пример 2. Определение количественного содержания глибенкламида в сыворотке крови пациента при монотерапии глибенкламидом.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной монотерапии глибенкламидом в терапевтической эффективной дозе 7,0 мг.

В пробе сыворотки крови, отобранной через 4 часа после приема препарата, обнаружено 21,27 нг/мл глибенкламида, без присутствия лозартана и его основного метаболита (Фиг. 11).

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в сыворотке крови человека заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 3. Определение содержания лозартана и метаболита Е-3174 в сыворотке крови пациента принимавшего лозартан в дозе 25 мг.

В пробе сыворотки крови пациента, принимавшего лозартан в дозе 25 мг, обнаружено лозартана 8,68 нг/мл и Е-3174 133,66 нг/мл (Фиг. 12). На хроматограммах полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания. Отбор проб сыворотки крови, пробоподготовку и анализ аналитов осуществляли заявленным способом, описанным в Примере 1.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ, как по отдельности, так и при применении меньших терапевтических доз препаратов, заявленным способом.

Пример 4. Определение содержания лозартана и метаболита лозартана Е-3174 в сыворотке крови пациента принимавшего лозартан в дозе 100 мг.

В данном исследовании пациент принимал лозартан в эффективной дозе 100 мг. Отбор проб сыворотки крови, пробоподготовку и анализ аналитов осуществляли способом, описанным в Примере 1.

В пробе сыворотки крови пациента, принимавшего лозартан в дозе 100 мг, обнаружено лозартана 103,89 нг/мл и метаболита Е-3174 489,60 нг/мл (Фиг. 13). На хроматограммах, полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ как по отдельности, так и при применении больших терапевтических доз препаратов, заявленным способом.

Пример 5. Определение содержания лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в интактной сыворотке крови.

Определение содержания лозартана, Е-3174 и глибенкламида в интактной сыворотке крови человека, достоверно не содержащей эти препараты, проводят заявленным способом, описанным в Примере 1.

На хроматограммах (Фиг. 14), полученных образцов отсутствуют пики, соответствующие лозартану, метаболиту Е-3174 и глибенкламиду по времени удерживания.

Таким образом, данный пример демонстрирует селективность заявленного способа и отсутствие риска предоставления ложноположительных результатов количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови.

Пример 6. Определение содержания лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в моче человека.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной терапии глибенкламидом (3,5 мг), в день исследования принимал 50 мг лозартана. Сбор мочи проводили в течение 8 часов после приема, а концентрацию аналитов измеряли в усредненной пробе.

Определение содержания лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в моче человека проводят заявленным способом, описанным в Примере 1.

Обнаружено лозартана 430,51 нг/мл, метаболита Е-3174 155,59 нг/мл и глибенкламида 1,05 нг/мл (Фиг. 13). От момента забора крови до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.

Данный пример показывает возможность количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в моче человека заявленным способом.

Пример 7. Определение содержания лозартана и метаболита лозартана Е-3174 в моче пациента принимавшего 100 мг лозартана.

Пациент, включенный в исследование, принимал лозартан в дозе 100 мг. Сбор мочи проводится как описано в Примере 6, определение содержания лозартана и Е-3174 в моче человека проводят способом, описанным в Примере 1.

В аналитах обнаружено лозартана 566,70 нг/мл и метаболита Е-3174 929,23 нг/мл (Фиг. 16). На хроматограммах полученных образцов отсутствует пик, соответствующий глибенкламиду по времени удерживания.

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в моче человека, а также возможность применения других терапевтических доз изучаемых препаратов, заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 8. Определение содержания глибенкламида в моче пациента, находящегося на монотерапии глибенкламидом в дозе 7 мг.

Пациент, включенный в исследование, находился на постоянной монотерапии глибенкламидом в дозе 7,0 мг. Определение содержания глибенкламида в моче проводят способом, описанным в Примере 1.

В исследуемом образце обнаружено 9,7 нг/мл глибенкламида. На хроматограммах отсутствуют пики, соответствующие лозартану и его метаболиту (Фиг. 17).

Данный пример показывает возможность количественного определения изучаемых веществ по отдельности в моче человека, а также возможность применения других терапевтических доз изучаемых препаратов, заявленным способом, описанным в Примере 1.

Пример 9. Определение содержания лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в интактной моче человека.

Определение содержания лозартана, Е-3174 и глибенкламида в интактной моче человека, достоверно не содержащей эти препараты, проводят способом, описанным в Примере 1.

На хроматограммах (Фиг. 18) полученных образцов отсутствуют пики, соответствующие лозартану, метаболиту Е-3174 и глибенкламиду по времени удерживания.

Таким образом, данный пример демонстрирует селективность заявленного способа и отсутствие риска предоставления ложноположительных результатов количественного определения лозартана, метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови.

Пример 10. Определение правильности и прецизионности результатов определения лозартана, его метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и моче человека. Оценку точности и прецизионности проводили в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл путем анализа образцов контроля качества, содержащих лозартан, его метаболит Е-3174 и глибенкламид на уровнях 1 нг/мл, 3 нг/мл, 500 нг/мл, 750 нг/мл, 1000 нг/мл. Анализ проводили в рамках 3 циклов, включавших по 5 образцов для каждого уровня концентраций. Правильность (Е,%) и прецизионность (RSD,%) определяли внутри аналитического цикла и между циклами (таблицы 4-6). Величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) соответствовали нормам (не более 20% для нижнего предела количественного определения (НПКО) и не более 15% - для остальных уровней).

Величины правильности (Е,%) (табл. 4-6) не превышают 6,33%, что свидетельствует о высокой степени соответствия между истинным значением аналита и его значением, полученным по данной методике.

Данный пример раскрывает возможность определения лозартана, метаболита лозартана Е-3174 и глибенкламида при совместном присутствии в сыворотке крови и (или) моче человека с приемлемой эффективностью, точностью и воспроизводимостью в концентрациях диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, что отвечает заявленным аналитическим диапазонам.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры, подтверждают эффективность, чувствительность, селективность, точность и воспроизводимость заявленного способа.

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка эффективного, чувствительного, селективного, точного и воспроизводимого заявленного способа для количественного определения лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида в сыворотке крови и моче, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Применение заявленного способа в клинической фармакологии при проведении терапевтического лекарственного мониторинга для исследования сыворотки крови и (или) моче пациента, является эффективным.

Список литературы:

1. Z.Li, G.Wang, L.-S.Wang et al. Effects of the CYP2C9*13 allele on the pharmacokinetics of losartan in healthy male subjects. Xenobiotica. 2009. 39(10): 788-793.

2. Shimako Tanaka, Shinya Uchida, Naoki Inui et al. Simultaneous LC-MS/MS Analysis of the Plasma Concentrations of a Cocktail of 5 Cytochrome P 450 Substrate Drugs and Their Metabolites. Biol.PHarai.Bull. 2014. 37(1): 18-25.

3. Mariana Milan Fachi, Leticia Bonancio, Leticia Paula Leonart et al. Simultaneous Quantification of Antidiabetic Agents in Human Plasma by UPLC-QToF-MS Method. PLoS ONE. 2016. 11(12): 1-10.

4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под ред. проф. А.Н. Миронова. Том I. М.: Гриф и К, 2013. С.201-207.

5. Руководство по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств. Решение Коллегии Евразийского экономической комиссии от 17 июля 2018 N113.

1. Способ пробоподготовки для одновременного определения лозартана, его метаболита лозартанкарбоновой кислоты (Е-3174) и глибенкламида высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в сыворотке крови и/или моче человека, характеризующийся тем, что в предварительно приготовленные калибровочные и анализируемые образцы, представляющие собой сыворотку крови и/или мочу человека, добавляют эффективное количество внутреннего стандарта, представляющего собой раствор прометазина в концентрации 100 нг/мл; далее добавляют эффективное количество осадителя белка, представляющего собой неразбавленный ацетонитрил, затем перемешивают до однородного состояния, с последующим центрифугированием при центробежном ускорении 15294 g до разделения на твердую и жидкую фазы, с дальнейшим отбором эффективного количества супернатанта; с последующим хроматографическим разделением компонентов пробы в режиме градиентного элюирования, далее с последующим детектированием сигнала при положительной ионизации для лозартана, его метаболита Е-3174, глибенкламида и внутреннего стандарта прометазина.

2. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что аналитический диапазон для лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида составляет от 1 до 1000 нг/мл соответственно.

3. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что осаждают белки неразбавленным ацетонитрилом в соотношении к сыворотке крови и/или моче человека 3:1.

4. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что предварительно подготовленные сыворотка крови и/или моча человека содержат эффективное количество лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида.

5. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что используют сорбент из группы XBridge с привитой фазой С18 с диаметром частиц 3,5 мкм.

6. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что хроматографическое разделение компонентов пробы проводят при рабочем давлении не более 17 МПа с сохранением скорости анализа.

7. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что центрифугируют в течение 15 минут.

8. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что детектированный сигнал получают с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме мониторинга множественных реакций.

9. Применение способа по п. 1 для определения лозартана, его метаболита Е-3174 и глибенкламида в сыворотке крови и/или моче человека.