Способ получения инозина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социапиатичеаких

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

Заявлено 12.1V.1971 (¹ 1645945/28-13) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет—

Опубликовано 23.V.1973. Бюллетень . " 23

Дата опубликования списан:;я 9.Х1.1973

М. Кл. С 12d 13,06

Государственный комитет

Совета Министров СССРпо делам изобретеиий и открытий

УДК 663.11(088.8) Авторы изобретения

С, И. Алиханян, Л. И. Ерохина, Л. A. Казаринова, Р. М. Балицкая, Т. А. Шишкина, H. А. Кострикина, Л. И. Евстюгов-Бабаев, А. Ф. Шолин, H. В. Матвейчук, T. В. Ашомко и Ю. А. Журин

Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ,получения и нозина путем вы ращивания продуцирующих его мслкроорганиэмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углевода, органического и,неорганического азота, аденина, необходимые аминокислоты, минеральные соли и стимуляторы роста при перемешивгнии и аэрации среды, отделения биомассы извлечения иноз ина из культуральной среды активированным углем, отделения инозина от угля промывкой, осветления раствора на ионообменной смоле с последующим осаждением инози на из растВОра этиловым спиртом.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход инозина.

Для этого в качеспве продуц ирующих микроорганизмов используют штамм:Bacillus

subtilis Ген-265, не продуцирующий аденин, тирозин, гистидин.

В качестве источника углевода можно использовать мелассу, гидрол, а в качестве источнлка аденина, аминокислот и органического азота — кукурJJÇIHblH экстракт, соевую муку или белково-витаминный концентрат.

Перед осветленивм .раствора на ионообменной смоле желательно его концентрировать упа риванием под вакуумом, а перед осаждением проводить вторичное упариванпе ,также,под вакуумом.

Штамм Бал1!пз subtilis Ген - 265 имеет ,следующие свойства.

Гргммполож ительная, спороооразующая палоч,ка.

На мясо-пепто нном агаре (сутки роста при

37 С) образует желтовато-серые круглые колонии диаметром 2 — 2,5 лл, шероховатые, с лопастным краем кожистой консистенции.

При посеве штрихом на мясо-пептонном агаре (сутки роста тори 37 С) наолюдается умеренный рост, штрих широкий, опаловый с лопастным краем и матовой шеро«оватой

15 поверхностью, кожистой консистенции.

На мясо-.пептоннам бульоне образует морщинистую сухую пленку.

На ломтиках картофеля пигмент не образует, .имеет матовую су «ую складчатую поверхность.

Желатину разжижает; кра«мал — гидролизует; молоко —,пептонизирует.

Во всех случая«роста на полноценных средах присутствует запа«, характерный для культур вида Bacillus subtilis.

На си нтетических среда«с м пнеральным азотом рост отсутствует.

Штамм нуждается в добавке a,eíèêa, тирози на, гисъиди на. Оптимальная температура для роста 37 С. При ферментации на спе382676

2,0

1,0

1,0

0,25

Инокулят инкубируют в аэрйруемых условиях (на качалке) при 28 С в течение 24 час.

Посевной материал передают в ферментационную среду в количестве 2 — 5 об. %. ц иально составленных средах, содержащих непищевое сырье, штамм Ген-265 накапливает до 10,0 г/л инозина.

Хранение штамма производят в виде лиоф ильно высушенных культур в стеклянных а мпулах.

В предлагаемых средах в качестве основklhIx источников углеводов, а денина и амино.кислот используют отходы пищевой промышленпоспи и пищевое сырье (свекловичная меласса, ги1дрол, кукурузный эистракт, соевая мука и белково-витаминный концентрат

БВК) .

При использовании B качесгве .источника углеводов для ми кробиологиче ского синтеза ,инозина мелассы в ферментационную среду, а следовательно, iH культуральную жидкость вносят значительное количество неорга ничеоких солей, окрашенных соединений, органическ их соединений кислого и основного хар а ктер ов.

Эти соединения сильно затрудняют выделение инозина.

На стадии выделения для отделения биомассы культуральную жидкость центрифугируют и к супернатанту добавляют для адсорбции иноэи на активизированный уголь марии СТ (100 — 250 меш) из расчета 100 мг угля на 10 мг нуклеозида.

После перемешивaiHHkk уголь огфильтровывают. Инозин элюирует шестикратной экстракцией водно-спиртовыи,расгвором аммиака .и фильтраты концентрируют в вакууме до

1/10,первоначального объема.

Поскольку полученный сконцентрированный раствор сильно окра шен, то его осветляют, пропуская через колонку с крупнопористой смолой на о снове мета фенилендиамина и формальдегида. Смола обладает более сильньгми адсорбционными свойствами по отношению к пигментам мелассы, чем к нуклеозидам.

Выходящую бесцветную жидкость, содержа щую инозин, упар ивают под вакуумом и для осаждения инозина добавляют четыре объема эгилового спирта.

Инозин кристаллизуют на холоде в течение несколькиx. часов, отфильтровывают и высушива ют,на воздухе.

Пример 1. Размножение культуры осущест1вляют в несколько этапов.

Ее поддерживают на агаре Хоттингера и инкуб и руют при 37 С в течение 24 час. Культуру со скошен ного агара - Хоттингера переносят на жидкую, посевную среду следующего

COICTB Ba, %:

Глюкоза

Пептон

Дрожжевой экстракт

NaC1

20

Предварительно уголь кипятят с 3 М соляной кислотой и отмывают до нейтральной реакции. Раствор с а ктивированным углем перемешивают 15 — 20 мин, после чего отфильтровывают под вакуумом через бумажный фильтр. После промывания угольных осадков водой пноз ин извлекают спиртовым раствором аммиака (С НЕОН: NH40H: вода — 25:

: 1: 24).

Используют ферментационные среды следующего cocraiaa, %:

Ферментационная среда 1

Мел асса 20,0

5 Кукуруз ный эктра кт 3,0 (1 Н4) $04 2,0

СаСОз 2,0

КНРО 0,2

К НРО 0,2

1О Mg $04 7Н О 0,4

Вода водо проводная

Ферментационная среда 2

Меласса 20,0

Кукурузный экстракт 3,0

Моч евин а 0,6

СаС1 2Н О 0,01

КН,Р04 0,2

К,НР04 0,2

MgSO4 7Н О 0,2

Вода водопроводная

Процесс ферментаци и проводят методом глубинного,ку.тьгивирова ния в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 15 мл среды, на качалке, делам щей 220 — 250 об/мин, или металлических ферментерах емкостью

20 л с турбинной мешалкой (скорость

700 ооб/мин), барбатером и системой автоматического пенога шения.

Перед нача.том ферментации значение рН среды должно быть близким к нейтральному (перед стерилизацией,рН среды доводят раствором NaOH до 7,0 — 7,2).

Оптимума Ibíàÿ аэрация для указанных сред соответствует скорости растворения кислорода (35,0 мг О л в мин).

Уменьшение окорости растворения кислорода в среде подавляет биосинтез инозина.

Опгимальной температурой процесса биосинтеза является 28 — 30 С. При понижении

4О или повышении тем пературы на 4 — 6 С биосинтез инозина в з начительной степе ни тормозигся.

При оптимальных условиях ферментацпи максимальное накоплен не инозина наблюда45 ется на шестые сутки. В ко нце ферментации в культуральной жидкости накаиливается до 7,0 г/л инозина.

Для выделения,инозина культуральную жидкость (600»të) центр ифугируют 30 мин.

Показатель преломления центрифугата равен

1,3512; вязкость раствора 3,8 cn; pH раствора после, прибавления 1,5 мл концентрированной соляной кислоты, равен 7,0.

К центрифугату добавляют 30 г активирован ного угля СТ (100 — 250 меш) .

382676

Состав посевной среды, Р/р.

Гидрол 4,0

Ку курузный экстракт 2,0

Б. В. К. 1,0 Н4ХОз- 0,5

СаСОз 1,0

Состав ферментацпонной среды, /р

Г.H+p o. I 20,0

Кукурузный экстракт 2,0

Б. В. К. 1 0

1 1 4 1 - з 2,0

CaCO. 2,0

Вода Водопроводная

Предмет изобретения

Составитель В. Дунье

Техред Г. Дворина

Редактор А. Либкина

Корректор А. Дзесова

Заказ 434/1278 Изд. № 591 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета . 1ииистров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

После шестикратной экстракции объем фильтрата,равен 600 тил.

Полученный концентрат пропускают через колонку со смолой ИА — 1 на основе формальдегида .и парафенилендиамина и фенола (высота 5 слг, Объем 10 ил) со скоростью 1,5 л.г в 1 тгин. Затем колонку .промывают двумя объемами воды с той же скоростью и фракции, содержащие инозин, объади няют и упаргивают в,вакууме при 40 С до 10 ил.

Для осаждения инозина ix раствору дооавляют 40,пл этилового спирта,и,раствор выдерживают при 40 С 10 час. Выпавш1ие кристаллы отфильтровывают и .перекристалл изовывают из водно-спиртового раствора. Кристаллы высушивают в вакуум-экстракторе над

Са С 1 .

Выход инози на на стадии кристаллгизацип

33 /;

Маточные растворы добавляют к следующей партии концентрата и вместе с ним ос ветляют на колонке со,смолой ИЛ-1.

Пример 2. Штамм-продуцент, услов: я ферментации и выделения инозина те же, что и в лр имере 1. О тгличие состоит в составе посевной среды.

По севная среда содержит, Р/р.

Меласса 4,0

Кукурузный экстракт 2,0 (КН4) з$04 0,5

3О

СаСОз 1,0

Вода водопровод ная

Содержание инозина в конце ферментацпп

7,2 г/л.

П р и м е,р 3. Штам м;продуцент, условия ферментации и выделения инозина такие же, как в примере 1. Отличие в составе фермента цио нной среды.

Состав ферментационной среды, Мел асса 20,0 40

Соевая мука 5,0

NH4NOç 2,0

СаСОз 2,0

Вода водопроводная

Содержание инозина в конце ферментации 45

6,7 г/л.

П,р и м е р 4. Штами-продуцент, услснпя ферментации и .выделения инозина такие же, как в примере 1. Отличие в составе посевной и ферментацион ной сред. 50

Содержание инозина в конце ферментацпи

10 г/л.

1. Способ получения инозипа путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов рода Bacillus на питательной среде, содержащей источники углевода, органического и неорганичеокого азота, аденпна, необходимые ам,;гпокислоты, минеральные co;Iп и стимуляторы роста при персмешивании и аэрации среды, отделения биомассы, извлечения инозина пз культуральной среды активпрова нным углем, отделения инозина от угля промывкой, осветления раствора На ионообменной смоле с последующим осаждением инозина из раствора этиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода инозина в качестве продуцпрующих микроорганизмов используют штамм Ва illus

subtilis Ген-265, не продуцирующий аде. III, тирозин, гистидин.

2. С пособ по и. 1, от.гичпюtqийcя тем, что в качестве источника углевода используют

МЕЛаССУ, ГИДРОЛ, а В КаЧЕСПВЕ ИСтОЧнгИКа аДЕнина, аминокислот и оргаIIIIwec oIo азота кукурузный экстракт, соевую муку или бел ково-витаминный концентрат.

3. Способ по п.п. 1 и 2, от.гичающгшся тем, что перед осветлением раствора на понообменной смоле его концентрируют упариванием под вакуумом, а перед осаждением проВодят Вторичное мпарпван!1е, также под Вак; 1 мом.