Питательная среда для выращивания микроорганизмов

 

382

Сове Советских

Соцнвлистк4еских

Респ т блин

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВНДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

Заявлено 18.Ч1.1971 (№ 1675773/30-15) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет—

Опубликовано 23.Ч.1973. Бюллетень ¹ 23

Дата опубликования описания 5.XI.1973

М. Кл. С 12k 1/06

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР аа делам изаоретений и открытий

УДК 619.576.8.093.33 (088.8) Авторы изобретения

М. М. Иванов и Н. А. Михайлов

Заявитель

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ

МИКРООРГАН ИЗМОВ

Изобретение относится к области ветери.нарии.

Известно использование питательной среды для выращивания микроорганизмов, приготовленной из мяса, рыбы, частично из казенщина.

Однако такие питательные среды дороги, трудоемки в приготовлении, нестандартны, так как мясо для этих целей чаще всего используется мороженое.

Предлагаемая питательная среда для выращивания бруцеллезных микробов с целью увеличения концентрации микробных тел, обладающих длительной жизнеспособностью и иммуногенными свойствами, содержит гидролизаты из обрата молока и казеина, в ее состав введен кукурузный экстракт и компоненты взяты в следующем количестве (на 1 л), гидролизата обрата молока и казеина (a аминный азот) 100 — 120 мг!% в равггых соотношениях, пептона сухого 5 г, поваренной соли 5 г, глицерина 10 >1tai, глюкозы 10 г, куKgp) 3HoI о экстракта 5 — 7 лл (в зависимости от содержашгя vðîöåíòà фосфора), водопроводной воды до 1л.

Приготовление гидролизата из обратп..

1 л оората мо".î:õà подогревают до 45 С, подщечачивают 20%-ным раствором соды (Ха1-1СОз) до рН 7,8 и добавляют 1 г сухого г:а ",креатина или 10 г измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Фермент предварительно разводят в небольшом количестве теплой водопроводной воды.

Через 15 — 20 лгин после внесения панкреатина или поджелудочной железы добавляют

10 л,г хлороформа, затем бутыли закрывают резиновыми пробками, завернутыми в марлевые салфетки, и ставят в термостат при 40 С на четверо суток. Содержимое бутылей перемешивают через каждые 5 — б час.

В процессе гидролиза ежедневно проверяют рН и, в случае снижения его до 7,2 — 7,4, снова подщелачивают 20% -,ным раствором воды до рН 7,б — 7,8. Пробку после Встрях!»вания бутылей слегка приоткрывают для удаг ления паров хлороформа. Через 4 суток бутыли вынимают из термостата, содержимое фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают нейтральный рН или слабощелочной (7,0 — 7,2), стерилизуют при 0,5 атлг 30 лгин.

20 ранят при 5 — 8 С в бутылях, закрытых резиновой пробкой, и используют по мере надобности для приготовления питательных сред. В готовом гидролпзате должно содержаться ампнного азота 400 — 500 лгг/%, об;его азота — 700 — 800 лг/о/ .-.

Приготовление гидролизатп из казсина.

Бе", т 1 кг пищевого кислотного казеина

ТУ-15354, заливают 10 л дистиллированной нли водопрогодной воды, подогретой до 40 С, в ;оторой предварительно растворяют 100 г

382682

15 углекислого натрия (NIa>CO>) . Казеин тщательно перемешивают до полного растворения, поддерживая при этом температуру около

40 С, добавляют 300 г фарша поджелудочной железы, устанавливают рН 7,6 — 7,8 20%ным раствором едкого натра (NaOH) и добавляют 100 мл (1% ) хлороформа. Гидролиз ведут при 37 С в течение 14 — 16 суток, при этом содержимое бутылей ежедневно перемешивают и контролируют рН, который должен быть в пределах 7,4 — 7,6. Регулируют рН 20%-ным раствором едкого патра.

B конце гидролиза рН снижается до

7,0 — 7,2, а ами нный азот повышается до 700—

900 мг/%, Если аминный азот достиг указанного уровня, бутыли охлаждают до комнатной температуры, затем на трое суток помещают в холодилыник при 5 — 7 С для отстаивания. Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или полотно бельтинг. К остатку нерасщепленных белков приба вляют дистиллированной или водопроводной воды столько, сколько было декантирова но гидролизата, затем подкисляют соляной кислотой до ipH — 6,3 и кипятят в течение 10 мин. После кипячения охлаждают, отстаивают, фильтруют сначала через вату, потом через полотно бельтинг.

Обе порции фильтратов смешивают, консервируют прибавлением 1% хлороформа, хранят при 5 — 7 С в бутылях, закрытых резиновой пробкой, и используют по мере надобности для приготовления питательной среды.

В готовом гидролизате должно содержаться, мг!%:

Амин ного азота 700 — 850, Общего азота 1100 — 1200.

Приготовление жидкой оорато-казеиновой питательной среды.

Компоненты среды взяты в следующих количествах на 1 л:

Гидролизата обрата молока и казеина (на аминный азот) в равных соотношениях 100 — 120 мг/%

Пептона (сухого) 5 г

Пова ренной соли (NaC1) 5 г

Глицерина 10 мл

Кукурузного экстракта (в зависимости от его качества) 5 — 7 мл

Глюкозы на сухое вещество 10 г

Водопроводной воды до 1 л

П р п м е ч а н и е: При добавлении 2,5 — 3,5О/о агарагара получают плотную среду. При добавлении 1,5 — 1,7% агар-агара получают среду, пригодную для опре. деления количества живых бруцелл в сухой бруцеллезной вакцине културальным методом.

До стерилизации смесь перечисленных компонентов подщелачивают 10%-ным раствором едкого патра и устанавливают рН до

6,7 — 6,8. После стерилизации в готовой среде

65 рН должен быть 6,5 — 6,6. Количество необходимого гидролизата для приготовления 1 л среды в расчете на аминный азот вычисляют по формуле: а 1000

Х = — = мл, в где а — количество мг/% аминного азота, необходимого для приготовления среды;

Ь вЂ” количество мг/ /в аминного азота, содержащегося в применяемом гидролизате;

Х вЂ” искомое количество гидролизата.

100 . 1000

Пример. Х вЂ” 200 мл; или

120 . 1000

Х =- — 240 мл, Определяем, какое количество гидролизата обрата следует взять на 1 л среды, если в нем содержится 500 мг/% аминного азота.

В данном случае 200 мл, но так как его берут в равном соотношении с гидролизатом из казеина, то следует взять на 1 л ореды 100 мл.

Все компоненты среды, за исключением глюкозы, смешивают в варочном котле, подщелачивают 10%-ным раствором едкого патра до рН 6,7 — 6,8, Смесь кипятят при помешивании до полного растворения всех компонентов, затем к смеси прибавляют горячую водопроводную воду до первоначального ооъема. Готовую среду фильтруют через фильтр-пластины и одновременно перекачивают в реактор для стерилизации, Стерилизуют среду при 120 С (1 атм) 40 — 45 мин.

После стерилизации в жидкой среде рН должен быть 6,4 — 6,6.

По сравнению с мясными средами, предлагаемая среда имеет более однородный состав белка. Готовая ореда по содержанию аминокислот приближается к полусинтетической и используется для выращивания микробов без пеногасителя, так как при культивировании почти не пенится. Использование достаточно полного набора аминокислот в среде обеспечивает полноценное физиологическое и морфологическое развитие микробной клетки, что обусловливает сравнительно высокий выход микробной массы с единицы объема питательной среды, т. е. 55 — 60 млрд микробных тел в 1 мл, а в лабораторном реакторе с автоматическим регулированием рН накопление микробной массы составляло 70 — 80 млрд микробных тел в 1 .мл по бруцеллезному стандарту мутности при наличии высокого процента живых бруцелл типичной морфологии.

В целях подтверждения стабильности результатов по накоплению микробной массы, получаемой при глубинном выращивании бруцеллезной культуры, готовят шесть серий ферментативпого гидролизата из обрата (2, 4, 382682

Среднее содержание микробов, выращенных на б льоие в течение

34 час, млрд.

Среднее количество живых бруцелл прн проверке цветным методом бульоны

1 о о (Ч

Б ) 2

Л г о г о х2

o >

44

15

19 39

19 3

19 1

17

19

22

20

52 26

24 47

19 49

22

G0 29

21

6, 7, 8, 9) и три серии ферментативного гидролизата казеина (1, 3, 5), из которых в дальнейшем готовят жидкую питательную среду для глубинного культивирования вакциоиного штамма бруцелла абортус 19, Как опытная, так и контрольная среда содержит

100 — 120 мг!% аминного азота; в обоих средах после стерил изации устанавливается рН

6,4 — 6,6 (для жидкой среды) . B качестве контроля используют гидролизат Хоттингера и пептон Мартена, п рименяемый обычно в производстве. Материалом для засева реакторов служит 36-часовая бруцеллезная культура производственного вакционного штамма № 19. Посевная доза составляет не менее

100 — 150 ллн микробных тел на 1 лгл питательной среды по бруцеллезному стандарту мутности ГКИ.

Перед засевом реактора в среду стерильно добавляют глюкозу в виде 40%-ного раствора из расчета 0,5% к объему среды. Культуру выращивают при 36 — 37 С в реакторах емкостью 480 л, содержащих 100 — 250 л среды. Аэрацию осуществляют подачей стерильного воздуха из расчета 1,5 — 2 л воздуха на

1 л1мин среды механическим перемешиванием со скоростью 260 об(лин. Выращивание продолжается в течение 32 — 34 час.

В процессе выращивания бруцеллезной культуры определяют рН среды. Для поддержания на определенном уровне рН через

16 — 18 час культивирования в среду повторно добавляют глюкозу в количестве 0,2 — 0,5г.

Через 24 — 32 или 34 час отбирают пробы, в которых определяют оптическую концентрацию микробной взвеси по бруцеллезному стандарту мутности количество живых бруцелл цветным методом с помощью краски метиленовой сини.

Каждую пробу взвеси бруцелл контролируют на чистоту роста и типичность морфологии путем просмотра под микроскопом окрашенных по Граму мазков, а также высевом на питательные среды (ar.asap и бульон).

Чистую культуру бруцелл осаждают в течение 18 — 24 час, надосадочную жидкость удаляют. Концентрированную микробную массу сливают в стерильные баллоны, определя ют оптическую концентрацию микробных тел в 1 л г, затем добавляют в зависимости от полученной концентрации среду высушивания, Из полученной стерильной микробной массы готовят сухую живую бруцеллезную вакцину (в соответствии с требованиями инструкции по изготовлению и контролю сухой живой бруцеллезной вакцины).

Как показывают исследования, выращивание вакцинного бруцеллезного штамма 19 B жидкой обрато-казеиновой среде не оказывает влияния на его морфологию, антигенные и иммуногенные свойства. При длительном хранении (18 — 25 мес.) в сухой вакцине сохраняется высокий процент живых бруцелл, типичных по своей морфологии.

В опытах на морских свинках устанавливают высокую иммуногенность c) èê вакцин серий (1, 4, 14, 15), полученных из культур, выращенных на предлагаемой среде.

Результаты сравнительного испытания интенсивности роста вакцинного бруцеллезного штамма 19 на обрато-казеиновом, мартеновском и хоттингеровском бульонах прп глубинном методе выращивания приведены в таблице.

Оптическая концентрация бруцелл определяется по бруцеллезному стандарту мутности; количество живых бруцелл — цветным методом с помощью краски метиленовой си ни. Накопление микробной массы с 1 лгл среды в среднем в два раза больше, чем на средах из мясных гпдролизатов.

Высушивают 15 экспериментальных серий из вакционного штамма бруцелла абортус 19.

B качестве контроля высушивают 12 серий бруцеллезной вакцины, изготовленной из культур, выращенных на плотной агаровой среде, основу которых составляют мясные гидролизаты.

На основании регулярных сравнительных исследований сухой бруцеллезной вакцины, хранящейся при 4 — 6 С в течение 18 — 25 мес. со дня изготовления, устанавливают, что вакцина сохраняет морфологические, антпгенные и иммуногенные свойства. Вакцина, полученная из культур, выращенных в жидкой среде, по своему качеству не уступает вакцине, выращенной на агаре. Эта вакцина вполне отвечает требованиям действующей инструкции по изготовлению и контролю сухой живой бруцеллезной вакцины.

При добавлении 2,5 — 3,5% агар-агара к жидкой обрато-казеиновой среде, получается плотная агаровая среда, которая может быть использована в производстве для выращивания вакцинного штамма бруцелла абортус 19.

382682

5 — 7мл до 1 л

Составитель Р. Иахниок

Техред Г. Дворина

Редактор А. Аибкина

1(орректоры Л. Чуркина и С. Сатагуловд

Заказ 612/2000 Изд. X. 858 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )1(-35, Раушскаи наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фпл. пред. «Патент»

Накопление микроб ной массы на плотной обрато-казеиновой среде на 15 — 20% больше, чем на агаровой печеночной и мясной средах.

При проверке на стабильность в пробе с трипафтавином и в реакции термопреципитации бруцеллезной культуры вакци нного штамма 19, хранившейся B пробирках kI3 скошенном обрато-казеиновом агаре при 4 — 6 С в течение 3 мес. (время проверки), культура этого штамма остается стабильной и не имеет признаков диссоциации. При испытании той же культуры, сохранившейся в тех же условиях на печеночно-тлюкозо-глицериновом н мартеновском агарах, в пробе с трипафтавином отмечается положительная реакция агглютинации, что доказывает, наличие диссоц нации.

Для плотной среды рН до стерилизации устанавливают 7,1 — 7,2, стерилизуют при

115 С в течение 30 мин. Эта же среда может быть использована для определения количества живых бруцелл в бруцеллезной вакцине, если к жидкой обрато-казеиновой среде добавить 1,5 — 1,7% агар-агара.

Предмет изобретения

1. Питательная среда для выращивания микроорганизмов, например бруцелл, содержащая пептон, поваренную соль, глицерин, глюкозу, отличающаяся тем, что, с целью увеличения концентрации микробных клеток, обладающих длительной жизнеспособностью н иммуногенными свойствами, она содержит гидролизаты из обрата молока и казеина.

10 2 . Среда по п. 1, отличающаяся тем, что, с целью ускорения процесса деления микробной клетки (бруцелл), в нее введен кукурузный экстракт.

3. Среда по пп. 1 и 2, отличающаяся тем, что ее компоненты взяты в следующих количествах (на 1 л среды):

Гидролизата обрата молока ,и казеина (IHB аминный азот) в равных соотношениях 100 — 120 мг/%

Пептона сухого 5 г

Поваренной соли 5 г

Глицерина 10 мл

Глюкозы 10 г

Кукурузного экстракта в зависимости от содержания процента фосфора

Водопроводной воды