Способ получения щелочной протеазы

 

Ф I У Д

ОПИС НИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социаписти48схих

Респубпих

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

М. Кл. С 12d 13/10

Заявлено 26.Н.1970 (№ 1456462/28-13) Приоритет 04.VII.1969, № WP 6а/140990, ГДР

1 асударственный квинтет

Саввтв Мнннатрав СССР па девам нзабретеннл н атнрытнй

УДК 577.15.08(088 8) Опубликовано 22 1/111.1973. Бюллетень ¹ 34

Дата опубликования описания 29.Х1.1973

Авторы изобретения

Иностранцы

Герхард Бервальд, Гизела Ян и Барбара Мецнер (Германская Демократическая Республика) Иностранное предприятие

«Феб Арцнаймиттельверк, Дрезден» (Германская Демократическая Республика) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению щелочной протеазы.

Известен способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов— плесневых грибов рода Aspergillus на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.

Предлагаемый способ позволяет получить более активную щелочную протеазу.

Согласно изобретению в качестве продуцента протеазы используют штамм Aspergillus

ochraceus № 1079.

Штамм Aspergillus ochraceus № 1079 зарегистрирован в институте Микробиологии и экспериментальной терапии в Иене под № I

МЕТ РА 126.

Способ получения щелочной протеазы заключается в двухстадийном культивировании указанного штамма на питательной среде, содержащей источники углерода — оттек глюкозы и лактозу, источник азота — соевую муку, при температуре 20 — 30 С, преимущественно 25 С, при аэрировании и перемешивании среды.

Посевным материалом служат высушенные методом сублимации споры на обезжиренном молоке, хранившиеся при температуре

+ 4 С.

Вначале сухими спорами засевают скошенный агар, а затем пересевают на стерильное просо при температуре 25 С для их размножения и обогащения.

Первая стадия культивирования состоит в ее предварительном выращивании в течение

48 час при температуре 25 С, при этом засевают 10 — 10 спор на 1 мл питательной среды.

Затем 10 $ предварительно выращенной культуры переводят на вторую стадию культивирования н вновь выращивают при температуре 25 С. Питательная среда как на второй, так и на первой стадиях культивирования, может содержать в изменяющихся количествах картофельный крахмал, сухую крахмальную патоку, набухшую целлюлозу, оттек глюкозы, техническую лактозу, соевую муку, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, мяснои отвар, пептон.

При культивировании осуществляют контроль значения рН среды, восстанавливающих веществ, активности синтезируемой протеазы.

Активность протеазы определяют по модифицированному методу Кунитца. В качестве субстрата используют казеин.

2,9 мл буферного раствора Бриттона — Робинзона с рН 6,0 .и 0,1 мл культурального фильтрата выдерживают в термостате с 3,0 мл

394972

15 го

Зо

Зо/о-ного раствора казенна при 37 С в течение

30 мин.

Затем нерасщенленный казеин осаждают добавлением 3,0 мл 10 /,-ной трихлоруксусной кислоты и отделяют центрифугированием.

Экстинцию не растворимых в трихлору ксусной кислоте продуктов расщепления измеряют при 280 нм на спектрофотометрс «Спектромон».

Таким же образом готовят слепую пробу (без инкубационного периода), а затем производят расчет.

Данные о рН-активности протеазы и ее стабильности (через 3 час) приведены на фиг. 1 а 2.

П р и и е р 1. Первая стадия — предварительное культивирование. В широкогорлую колбу Эрленмейера объемом 500 ггг наливают 100 лгл питательной среды, содержащей 5% декстрозы из оттека глюкозы, 3 /о жидкого кукурузного экстракта, 0,5 /о СаСОз, 0,3 /о (М1-14) SO.ь и водопроводную воду — до 100мл.

Среду стерилизуют, засевают спорами штамма Aspergillus ochraceus Ke 1079/I MET РА

126 в количестве 10 на 1 мл и культивируют при 25 C в течение 48 час при взбалтывании на ротационной вибрационной машине.

I-Iа второй стадии культивирования в качалочныс колбы,наливают по 100 мл:питательной среды, содержащей l о/, технической лактозы, 4 /о декстрозы из оттека глюкозы, 1,5 /о соевой муки, 0,05/о КС1, 0,05/о MgSO4 7Н О, 0,1 /о

КНгРО, 0,001 /О Ее$04 7Н О, и водопроводную воду — до 100 мл, и стерилизуют. Затем эту среду засевают 10 /о культуры, полученной на первой стадии,,и культивируют при 25 С.

Величина рН среды при этом повышается с 4,7 до 6,6.

На седьмые сутки культивирования активность протеазы в культуральном фильтр ате равна 7 CE на 1 мл.

Пример 2. Первую стадию — предварительное культивирование осуществляют на питательной среде, содержащей 5О/о декстрозы из оттека глюкозы, 3 /О жидкого кукурузного экстракта, 0,5 /о СаСОЗ, 0,3 (Х 14)SO<, 0,1 пепогаоителя, и водопроводную во,1у — до

40 л.

Стерильную среду (стерилизация при 120 С в течение 60 мин) засевают спорами штамма

Aspergillus ochraceus М 1079/I МЕТ PA 126 в количестве 5 108 спор на 1 л питательной среды и культивируют при аэрации воздухом в количестве 0,5 л/мин на 1 л среды, перемешивая со скоростью 300 об/мин в течение

48 час при 25 С. При этом величина рН среды повышается с 5,0 до 6,0.

Полученную таким образом предварительную культуру пересевают в такую же среду, как описана в примере 1.

На четвертые сутки культивирования активность протеазы в культуральном фильтрате составляет 3,5 СЕ на 1 мл.

Пример 3. Опыт осуществляют так же, как описано в примере 1, но на питательной среде, содержащей 0,1 /о КН РО, 0,05 /о КС1, 0,05 /, MgSO4 7Н О, 0,01 /о Fe$04 7НгО, 4 /о сахара-сырца, 1 соевой муки, 0,5 /о картофельного крахмала, О, l о/о пептона.

При этом величина рН повышается с 5,0 до

8,0. На седьмой день культивирования в культуральном фильтрате определяется активность протеазы — 4,4 СЕ на 1 мл, Характеристика штамма

Штамм Aspergillus ochraceus М 1079 определен по ТНОМ.и Raper-критериям. (I МЕТ PA-126) М о р ф о л î r и я. Штамм выращен на агаре по Чапек-Доксу с вариантом по Тому.

Инкубационная температура 24 С.

Период выращивания 9 дней.

Носитель конидий неразделенный.

Размер 344,5 — 809,9X4,48 — 9,94 мк.

Пузыри (вестикула).

По большей части круглые, частично эллиптические.

Продольная ось 17,92 — 39,68 мк, поперечная

12,80 — 32,90 мк.

С т е р и r м ы. В две серии: первая серия размером 4,80 — 10,56)(0,96 мк; вторая серия размером 6,08 — 8,37 1,28 мк.

С п о р ы. Чаще круглые, частично овальные, но овальные споры не очень сдвинуты в длину.

Круглые споры имеют диаметр 2,40 — 2,90 мк, длина продольной оси овальных спор 1,92 —

3,24 мк.

Д е ф и с. Частично септирован, имеются включения. Размер отдельных клеток 9,39)(;к,0,35 — 2,0 мк.

В таблице приведены результаты испытаний штамма Aspergillus ochraceus Xo 1079 по отношению к различным веществам, испытанным на пористых пластиках, 9-дневная культура.

394972

Е

И г

f»

О X

Я щ О ,:4 O

Спорообразование

Нижняя сторона колонии

Субстрат

С-источник.N-источник

Форма колонии

Агар по

Когхиллю

Глицерин, сахароза

Пептон

Очень хорошее, охряного цвета

Светло-красноватая, лилово-коричневая, в центре лилово-пурпурное кольцо, края колоний слоновой кости

Пивной сусло-агар

Пивное сусло

Мальтоза

Очень хорошее, охряного цвета

Центр желто-зеленый, колония бежев атого цвета

Солодовый экстракт

Солодовый агар

Солодовый экстракт ) 70

Умеренное, светлый цвет нуги

Центр темно-коричневый, средне-коричневого цвета

Сахароза

NANO, Умеренное, светло-охряного цвета

Желтая

ИН4ИОз

Сахароза

Слабое

Цвета слоновой кости, складчатая, вдавленная

Сахараза

NaNO, Нет роста

Сироп сухого крахмала

Сахароза

Дрожжевой экстракт, пептон

Желтоватое оспоренное кольцо

Очень слабое, светло-бежевый

Светло-желтая, складчатая

Складчатость

Мочевина

Цвета слоновой кости

Кукурузная вода

ИаХО, Сахароза

Светло-коричневая разорванная

Средне-коричневая

Очень слабое, белое

Колония складчатая

Лактоза

Очень хорошее, охряного цвета

Маннит

То же

Светло-коричневая

Средне- и темно-коричневая

То же

Ростки сол ода, сахароза, глюкоза

Незначительное светло-охряного цвета

Сахароза

Нет

Нежно-желтая

Агар по

Зоппу

Мясной бульон

Сахароза, глюкоза

=- 75

Хоро.нее, охряного цвета, кольцеобразные зоны оспоривания

Незначительное

Кукурузного цвета

Агар по

Раулину

Сахароза, винная кислота

NH,NO

<ЫН,1,ЯО, (NH4)2 НРО4

Цвета слоновой кости, частично вдавленная

Поднятая

Предмет изобретения среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, от.гичаюгггийся тем, что, с целью получения более активной протеазы, в качестве продуцента используют штамм

5 Aspergillus ochraceus № 1079.

Способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов — плесневых грибов рода Aspergillus на питательной

Агар по

Чапек-Доксу с вариантом по Тому

Агап по

ЧапекДоксу

Агар по Чапек-Доксу с ростками солода

Аспарагин агар

NaNO, Ростки солода, пентон, NaNO, Аспарагин

Плоская, центр приподнят, белая облачная широкая зернистая зона спорообразования, край широкий, белый, прозрачный

То же

Центр опущен, с утолщением, складчатый, светлый цвет нуги, колония зонирована с различной интенсивностью, радиальная складчатость

Центр кратерообразный, светло-охряный, слабая складчатость, край широкий, белый, шерстистый

Центр выпукло-рельефный, складчатый

Центр опущен, радиальная складчатость

Колония очень плоская, мало воздушного мицелия

Центр опущен, колония белая, шерстистая, сильно складчатая

Центр кратерообразный, белая, неравномерно складчатая, край волокнистый

Центр неравномерно утолщенный, бархатистьш, сильно складчатый

5 а 7 В г иван

Фиг.1

Ю 7 В Е /О н

Фиг. Z

Редактор Н. Белявская

Заказ 3021/15 Изд. № 1927 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб„д, 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Е ч

Составитель T. Полянская

Техред Л. Богданова

Корректоры: Е. Давыдкина и М. Коробова