Патент ссср 411072

 

Ьэ оз 1"овЕтскии

Сощивпистическим

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 18.1.1972 (№ 1741177 23-4) с присоедиио ием заявки №

Приоритет

Опубликовано 15.1.1974. Бюллетспь № 2

Дата опубликования описания 1З.V1.1974

М. 1;л. С 07с 47/18

Гааударатвенный комитет

Совета Министрав СССР да делам изабрете11ий и открытий

УД1(547 45б(088.8) Автор изобретения

И. H. Гаврилюк

Заявитель Институт физиологии и биохимии растепий AH Молдавской ССР

СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ МОНОСАХАРИДОВ

Изобретение относится к улучшенному способу разделения смеси моносахаридов, который находит широкое применение в биохимии и биологии.

Известен способ разделения смеси моносахаридов методом тотткослойной хроматографии, заключающийся в том, что на пластинку с абсорбентом аносят смесь моносахаридов, которую разделяют, используя различные системы растворителей.

В качестве абсорбента в известном способе применяют силикагель Г, кизельгур Г или окись алюминия (производства фирмы

«Мерк») и используют гипс как связующий материал, Причем сил икагель должен быть тщательно очищен от примесей железа. Однако, Использование гипса как связующего материала уменьшает величины R1, что приводит к плохому разделению сахаров.

Для импрегнировапия слоя абсорбента в известном способе используют 0,02 М раствор ацетата натрия (по Шталю) или 0,1 н. раствор борной кислоты (по Пастуска). При использовании ацетата натрия количество анализируемой смеси должно быть очень небольшим, 0,1 — 1,0 мкг, так кaê зоны перекрывают друг друга, а применение борной кислоты приводит к сильному потемнению фона, поэтому невозможно количественное определение отдельных сахаров.

Таким образом известный способ пригоден только для ультрампкроапализа смеси сахаров, причем используют специально приготовленные абсорбецты, подбирая систему раст5 ворптслей для каждого сорбента в отдельности.

Цель изобретения — уст ранение указа 1шых недостатков путем использования попого сорбспта, нового связующего материала, фосфат10 ного буфера для пмпрегнированпя слоя сорбента и новых систем растворителей.

Все это дает возможность разделять до

90 мкг каждого сахара в отдельности и наносить до 720 мкг смеси сахаров.

15 Предлагается способ разделегп1я смеси мопосахаров методом топкослойной хроматографии, заключающийся в том, чго смесь моносахаридов наносят на плас1пп с абсорбцпо11ным слоем, состоящим пз сплпкагеля 1(СК, сп20 ликатного клея и буферного раствора фосфор окислых солей высокой концентрации с последующим разгоном системой растворителей, подоораипОИ В 3авпсп i1остп От Вида с11 a pa.

Обычно для буферного раствора используют

25 0,88 М раствор NaH P0 и 0,31 М раствора

Ма21-1РО4 в соотношении 88: 13.

Для разделения галактуроповой кислоты, галактозы, глюкозы, арабпнозы+маинозы, ксилозы, рибозы и рамиозы, как правило, ис30 пользуют две системы растворителей:

A. и-Бутанол, ацетон, метанол, вода в соотношении 12: 12: 6: 3;

Б. Изопропанол, этилацетат, вода в соотношении 8: 1: 2.

Для разделения арабипозы и маннозы обычно используют смесь ацетона и воды в соотношении 12; 1.

Пример. Очистка силикагеля. Берут один объем гранулированного силикагеля марки

КСК, кипятят 30 мин с 1,5 объемами 1%-ного раствора МаОН, после чего декацтируют и силикагель промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Затем кипятят его в !,5 обьемах концентрированной соляной кислоты в течение 30 мин. Кислоту сливают и очищенный продукт промывают дистиллированной водой до отсутствия ионов хлора, после чего сушат в термостате при 140 (в течение 6 час).

Измельчение силикагеля. Высушенный силикагель измельчают на шаровой мель нице.

Фракционирование. Полученный силикагель помещают в сосуд емкостью 10 л, заливают дистиллированной водой и интенсивно перемешивают. Перемешивание прекращают и засекают время по секундомеру. Через 14 мин после прекращения перемещения сливают 1/3 смеси во второй 50-литровый сосуд. Первый сосуд вновь заполняют дистиллированной водой, перемешивают и сливают 1/3 смеси во второй сосуд. Повторяют эту операцию до тех пор, пока при сливании будет наблюдаться взмученный в воде силикагель. После отстаивания воду декантируют и силикагель сушат на воздухе. Высушенный на воздухе силикагель нагревают в сушильном шкафу 2 час при

120 С. Силикагель используют для приготовления пластинок.

Примеси железа, если и содержатся в силикагеле, «е влияют на хроматографирование сахаров. Для приготовления пластинок со слоем силикагеля используют стеклянные, предварительно отшлифованные и тщательно обезжиренные, фотопластинки (17,8 13,2 см), Состав суспензии для покрытия пластинок из расчета на одну пластинку включает 15 мл фосфатного буфера, состоящего из 0,88 М

NaH>PO4 и 0,31 М ХазНРО4 (88:13), силикатный клей 0,4 мл, силикагель 3,0 г. Компоненты смешивают,:полученную сорбционпую массу наливают на пластинку и сушат в строго горизонтальном положении на воздухе не менее 8 час. Это обеспечивает получение слоя

0,2 мм. Пластинки активируют при 145 С в течение 2 час. Хроматографию сахаров проводят при 20 — 22 С.

Нанесение растворов. Растворы наносят микропипеткой или микрошприцем. Для хроматографирования сахаров используют 0,3%ный раствор сахаров в 80%-ном водном этаноле. На пластинку наносят пробы различных количеств смеси, по 0 01 мм раствора, содержащего 20 — 60 мкг сахаров. После нанесения растворов стартовую линию подсушивают с помощью лампы накаливания в течение 3 мин.

411072

Растворитель

Соединение

А, Б

22

53

94

68

73

Галактуроиовая кислота

Галактоза

Глюкоза

Арабиноза

Манноза

Рибоза

Ксилоза

Рамноза

Смесь сахаров

5

4

Качественный анализ сахаров. Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером 150+150X200 мм. Расход растворителя составляет примерно 200 мл.

Для разделения галакту роновой кислоты, галактозы, глюкозы, маннозы+арабинозы, р ибозы, ксилозы и рамнозы подобраны две системы растворителей:

А. н-Бутанол, ацетон, метанол, вода в соотношении 12: 12: 6: 3;

Б. Изопропанол, этилацетат, вода в соотношении 8: 1: 2.

Систему растворителей А дважды пропускали восходящим током при подъеме ее на

16 см. Систему растворителей Б пропускали два раза на 9,2 см и один раз на 16 см от линии старта.

Для разделения арабинозы и маннозы подобрана система растворителей  — ацетон и вода в соотношении 12: 1. Разделение проводят при пятикратном хроматографировании.

Время разгонки 50 мин. После каждой разгонки пластинки подсушивают горячим воздухом в течение 15 мин. Разделение сахаров на слое силикагеля происходит за 6 час. Для качественного определения сахаров используют проявитель — и-анизидинфосфат (5 мл

85% -ной НзРО4+0,5 r n-анизидин а+25 мл

НзО+50 мл 95%-ного этанола) .

Хроматотраммы проявляют при 130 С в течение 15 мин.

Полученные разноцветные пятна характеризуют следующие компоненты: темно-коричневая — галактуроновая кислота; красно-коричневая — галактоза, глюкоза; светло-красная— манноза; светло-к оричневая — арабиноза, ксилоза, рибоза; желто-коричневая — рамноза.

Значения К сахаров на слое силикагеля приведены в таблице.

Значения Rf (X100) сахаров на слое силикагельсиликатный клей, импрегнированном 0,88 М

ИаН,РО4 и 0,31 М Ха,НР04

Определение состава продуктов гидролиза целлюлозы. Целлюлозу выделяют из плодов яблони методом Кюршнера. Для определения элементарного звена макромолекул выделенпую клетчатку гидролизуют. Растворы нейтрализуют карбонатом бария, деионизируют и упаривают до небольшого объема. На готовые пластинки диаметром 17,8)(13,2 см, покрытые

41107 2

Предмет изобретения

Составитель Г. )Хукова

Техред Г. Васильева

Редактор Е. Хорина

Корректор Н. лук

Заказ 1066/9 Изд. № 1166 Тираж 606 Подписное

1II-IИИПИ Государственного комитета Совета,\1пнпстров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-36, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 биликагелем, калиброванной микропипеткой наносят одновременно иа стартовую линию растворы анализируемых образцов и свидетелей. Объемы нанесенных растворов равняются 0,04 х1мз, что является оптимальным объемом, Отдельно го1овят два раствора свидетелей с разли шым процентным содержанием сахаров. Первая смесь свидетелей объемом

0,02 мм содержит 480 мкг (смесь состоит из восьми сахаров по 60 мкг каждого). Вторая смесь свидетелей объемом 0,03 мм содержит

720 мкг и состоит из тех же сахаров по 90 мкг каждого.

Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере, как описано выше. ,Эл1оцию проявленных пятен сахаров проводят в день их проявления. Сразу же после проявления соскобленные пятна количественно переносят в 2 мл смеси 1 /в-ной НС1 и

0,1 /,-ной аскорбиновой кислоты в метаноле в соотношении 3: 97. Силикагель удаляют цецтрифугироваиием (20 мин при 8000 об/

/мин) . Количество сахаров определяют иа спектрофотометре СФ-4, используя кварцевую кювету (1 см) с подставкой, применяемой для уменьшения объема элюепта. Определение оптической плотности проводят при 650 им.

В качестве контроля используют равный по площади участок сил и кагеля, свободный от сахаров. Стандартные кривые строят для каждого сахара отдельно после разделения их иа пластинке в прш1ятых условиях по 20—

60 мкг соответствующего сахара.

В кислотных гидролизатах целлюлозы этим

MeToJoM ооиар) JKHBaIQT «po ae преоб IapaIDIUего количества глюкозы (70% яа сухой вес целлюлозы) следы галактуроновой кислоты, галактозы, арабинозы и ксилозы.

1. Способ разделения смеси моносахаридов методом тоикослойной хроматографии путем

10 нанесения ее па слой абсорбецта с последующим разделением системой растворителей, отличающийся тем, что, с целью увеличения количества и улучшепия разделения смеси мопосахаридов, абсорбционный слой гото15 вят из спликагеля КСК, силикатного клея и буферного раствора фосфорцокислых солей высокой концентрации, а систему растворителей подбирают в зависимости от вида сахара, 20 2. Способ по и. 1, отлича1ощийся тем, что в качестве буферного раствора используют 0,88 М раствор NaH>PO< и 0,31 Ч раствор )а 11РО4 в соотношении 88: 13.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, 25 что для разделения галактуроновой кислоты, гал а ктозы, гл юкозы, ар а би11озы+ м а я возы, ксилозы, рибозы и рампозы используют две системы растворителей:

А. н-Ьутанол, ацетон, метанол, вода в со30 î íîøåíèè 12: :12: :6: 3;

Б. Изопропаиол, этилацетат, вода в соотношении 8: 1: 2.

4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что для разделения арабииозы и манцозы пс35 пользуют смесь ацетона и воды в соотношении 12: 1.