Патент ссср 411090

 

и. си1ф. ехн ., иаМ

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

411О90

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ЛЪ

М. Кл. С 070 51/50

Заявлено 26.Х1.1971 (№ 1718070/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 15,1.1974. Бюллетень ¹ 2

Дата опубликования описания 1.VII.1974

Государственный комитет

Совета Министрав СССР

IIo делам иеасретений и аткрытий

УДК 547.857.7.07(088.8) Авторы изобретения

П, П. Пумпен и Э. Я. Грен

Заявитель

Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза АН Латвийской ССР

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕОЗИД-5 -ТРИФОСФАТОВ, МЕЧЕНЫХ ИЗОТОПАМИ С 4 ИЛИ Нз

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения соединений, которые могут найти применение в биохимических исследованиях.

Известен способ получения С 4-уридин-5 трифосфата из С"- оротовой кислоты в присутствии ферментов, выделенных из Escherichia coIi в качестве катализатора.

Однако данный способ требует приготовления специального компонента реакционной смеси — 5 -фосфо- L,0- р ибозил-1-пирофосф ата, что весьма затрудняет и усложняет процесс.

По предлагаемому способу получения рибонуклеозид-5 -трифосфатов, меченых изотопами С" или Н, приготовления специального компонента реакционной смеси не требуется, рекомендуемый способ заключается в том, что соответствующие меченые пуриновые или пиримидиновые основания подвергают ферментативному превращению в присутствии D-рибозы, аденозин-5 -трифосфата, или в случае синтеза меченого аденозин-5 -трифосфата используют уридин-5 -трифосфат, ионов Mg2+, пируваткиназы и фосфоенолпирувата, применяя в качестве катализатора ферментную фракцию бесклеточного экстракта Esche ichia

coli АВ 259 Hfr 3000 с последующим выделением целевого продукта известным способом, Процесс обычно протекает при 37 С н рН 7,8 в течение 45 мин. Выход нуклсозид-5 -трнфосфата (по меченому основанию) не менее 90%.

Радиохимическая чистота 96 — 98%.

5 Примеры. а) Приготовление бесклеточных экстрактов

Е, coli АВ 259 Н1г 3000.

Клетки выращивают на пептонной среде с интенсивной аэрацией при 37 С, осаждают в

1о центрифуге, отмывают от среды буферным раствором (0,01 114 трис-НС1, рН 7,8; 0,005 AJ . 1дС1 ). Бесклеточные экстракты готовят растиранием клеток со стеклом при 1 — 2 С, разбавляют полученную массу двукратным объе15 мом буфера (0,1 М трис-НС1, рН 7,8; 0,05 М

NgClq), вносят дезоксирибонуклеазу (0,01 мг/

/мл раствора), центрифугируют 20 мнн при скорости вращения в низкоскоростной центрифуге 10000 об/мин. Надосадочную жидкость

20 подвергают ультрацентрифугированню при

100000 g в течение 1 часа. Полученный экстракт быстро замораживают и хранят при — 20 С. Непосредственно перед внесением в реакционную смесь бесклеточный экстракт на25 гревают при 50 С (в водяной бане) 3 мнн, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость используют в качестве ферментной фракции Escherichia

col i, Ф

> г, 411090

Составитель В. 7Кестков

Техред Л. Богданова

Корректор А. Дзесова

Редактор Л. Емельянова

Заказ 1254/2 Изд. № )230 Тираж 506 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 б) Синтез рибонуклеозид-5 -трифосфатов, меченных С" или Нз.

Синтез уридиц-5 -трифосфата. Реакциош|ую смесь, содержащую (IB м кмоль/ мл): Ст4 или

Н -урацила 1,8; D-рибозы 9,0; аденозип-5 -трифосфата 1,5; фосфоенолпирувата 10; трис-НС1, рН 7,8 100; 31gCI> 25; бесклеточного экстракта 0,14 мл на 1 мл реакционной смеси, инкуоируют 45 мин при 37"С (в водяном термостате). По истечении 30 мин инкубации дополнительно вносят (на 1 мл смеси):

1,5 мкмолей адецозин-5 -трифосфата, 10 мкмолей фосфоенолпирувата и 30 .мкг пируваткиназы. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на 1,5 — 2 мин.

Образовавшийся осадок удаляют в низкоскоростной центрифуге, а цадосадочпую жидкость (после концентрирования в ротационном испарителе при 32"С)»a бумагу W15 (10 CEgpp Ita 1 см старта) для хроматографированпя в системе: изомасляная кислота — вода †концентрированн гидроокись аммония (66: 33: 5) нисходящим способом в течение

20 час. Хром ггограммы сушат в струе холодного воздуха (2 — 3 часа), отмывают эфиром (в течение суток) или подвергают нисходящей хроматографии в системе к-бутанол — ацетон— уксусная кислота — 5%-ная гидроокись аммония — вода (9: 3: 2: 2: 4) (12 — 15 час) прп 3—

4 С. Зоны урпдин-5 -трифосфата вырезают и элюиру|от водой. С целью получения продукта в виде аммоцпевой соли элюат обраоатывают Dowex 50/1-1+, смолу оприльтровывают на мембранном фильтре, фильтрат нейтрализуют 5%-ным раствором гидроокиси аммония.

В случае необходимости получеш1ый раствор аммонпевой соли меченого уридип-5 -трифосфата концентрируют в ротационном испаритсле (32"С). Препарат замораживают и хранят при — 20 С. в) Синтез 5-фторуридип-5 -трифосфата. В качестве меченого соед шеция используют

1,8 мкмоль 5-фторурацпла па 1 мл реакционной смеси). В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта анало гиче11 описанному для уридиц-5 -трифосфата.

r) Синтез цитидип-5 -трифосфата. Для синтеза цитидиц-5 -трифосфага бесклето-шый экстракт Escherichia coli приготовляют по описанной выше методике, но трис-НС1 в буферных растворах Во всех случаях заменяют глицинатом калия (0,05 М, рl-l 8,1). В качествс меченого соединения используют цитозип (1,8 мкмоль/мл смеси). Реакционная смесь имеет состав, описанный для синтеза уридин5 -трифосфата, с той разницей, что дополни10

4 тельно вносят 10 мкмоль/мл смеси NH4C1, а трис-НС1 заменяют глицинатом калия—

100 мкмоль/мл смеси, рН 8,1. Процесс синтеза и очистки препарата аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. д) Синтез аденозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого предшественника используют аденин (1,8 мкмоль/мл смеси). Реакционная смесь имеет состав, описанный для синтеза уридин-5 -трифосфата, с той разницей, что аденозин-5 -трифосфат заменяют аналогичным количеством уридин-5 -трифосфата.

Процесс синтеза и очистки препарата аналогичен описанному в случае синтеза уридин-5 трифосфата. е) Синтез гуанозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого соединения используют

1уанин (1,0 мкмоль/мл смеси). Состав реакционной смеси, а также процесс синтеза и очистки аналогичен описанным для синтеза уридин-5 -трпфосфата.

Полученные С 4- и Нв-нуклеозид-5 -трифосфаты анализируют хроматографически в системах: 1) этанол — 1 Л1 ацетат аммония — 0,1 М

ЗДТЛ (75: 29: 1), восходящая, 18 час; 2) изомасляная кислота — вода — концентрированная гидроокись аммония (66: 33: 1,5), нисходящая, 18 час. Нуклеозид-5 -трифосфаты подвергают также кислотному гидролизу, и полученные пуриновые и пиримидиновые основания идентифицируют в хроматографической системе: и-пропапол — HC1 (17:4 — вода до 250 мл), нисходящая, 20 час. Радиохимическая чистота препаратов составляет 96 — 98% . Основные характеристики УФ-спектров полученных нуклеозид-5 -трифосфатов соответствуют характерным для них.

Предмет изобретения

1. Способ получения риоонуклеозид-5 -трифосфатов, меченых изотопами С" или На, путем ферментативного превращения соответствующих меченых соединений в присутствии ферментов, выделенных из Escherichia coli в качестве катализатора, с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве меченых соединений используют пуриновые или пиримидпповые основания и процесс ведут в присутствии D-рибозы, аденозин-5 -трифосфата или в случае синтеза меченого аденозин-5 -трифосфата используют уридин-5 -трифосфат, ионов

Мр- +, пируваткиназы и фосфоенолпирувата.

2. Способ по п. 1, отл ич а ющи йс я тем, что процесс ведут при 37 С и рН 7,8.