Способ получения уриказы
. лМв
1 Л
1 6н .„„. м
1и1 42 I I 62
ОПИСАНИЕ ,ИЗОБРЕТЕНИЯ, Союз Советских
Социалистических
Республик
К ПАТЕНТУ
I (51) 3<. Кл, А Glk 19/00
С 12d 13/10
С 078 7/02! (61) Зависимый от патента
\ (22) Заявлено 29.03.68 (21) 1228281/31-16
I (32) Приоритет 29.03.67 (31) 100672 (33) Франция
1 Опубликовано 25.03.74. Бюллетень ¹ 11
Ф . . Дата опубликования описания 26.07.74
Государственный номитет
Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Пьер Лабуро, Марсель Даниель, Пьер Брюно и Клод Ланглуа (Франция) Иностранная фирма
«Сосьете д Этюд эд Аппликасьон Бношимик, Этаблиссман
Клен — Била и Южин Кюльманн» (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИКАЗЫ
0,750
0,500
1,0
10
25
Изобретение относится к области медицины, точнее к производству ферментных препаратов.
Известен способ получения уриказы, заключающийся в том, что культуру Clostridium
cylindrosporum Нсl выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 37 С в течение 5 — 7 дней, отделенные клетки промывают раствором хлористого калия и лиофильно высушивают, а затем экстрагируют фосфатным буфером рН вЂ” 7,0 при 35 С, выделяют целевой продукт из экстракта путем высаливания сульфатом аммония и последующего растворения в 0,1 М буфере, содержащем цистеин.
Целью изобретения является разработка микробиологического способа получения уриказы, который позволяет повысить удельную активность фермента.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют культуру
Aspergillus flavus oryzae № 624, которую выращивают при 20 — 35 С и рН среды 4,0 — 8,0 в течение 15 — 60 час, отделенный мицелий замораживают при температуре от — 15 до — 30 С и измельчают, а экстракцию осуществляют при температуре не выше 30 С.
Пример. Посевной материал, хранящийся на зернах риса, помещают в термостат на
9 дней при 28 С в склянках Рукса с длинным горлом емкостью 1 л до спорообразования.
Затем споры смывают 2 л физиологического раствора при концентрации бг NaC1 на 1 л и засевают в питательную среду, имеющую следующий состав (в кг):
Глюкоза (в куске)
Азотнокислый натрий
Калий фосфорнокислый
Калий первичный кислый, фосфорнокислый 0,250
Магний сернокислый (7Н О)
Кальций углекислый железо сернокислое двухвалентное (7НзО) 1,0
Кобальт сернокислый (7Н О)
Экстракт дрожжевой
K) 1bT) Pbl 1,0
Экстракт растворимый кукурузы 0,30
Кислота мочевая 0,60
Вода на 1000 л рН среды 6,45
Среду стерилизуют 30 мин при 120 С. Инкубацию проводят в течение 24 час при аэрации стерильным воздухом, расход которого состав421162
Предмет изобретения
Составитель С. Щенева
Техред А. Камышникова
Редактор Д. Пинчук
Корректор В. Брыксина
Заказ 1820/11 Изд. № 687 Тираж 482 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раугпская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
3 ляет 0,3 л на 1 л питательной среды в 1 мин, поддерживая температуру на уровне 28+-1 С.
После фильтрования культуральной жидкости получают 20 кг мицелия, концентрация которого равна 150 ед/г.
Мицелий промывают 40 г дистиллированной воды, после чего быстро замораживают при температуре — 20 С. Замороженный мицелий измельчают и экстрагируют 40 л аммиачной воды, имеющей величину рН 9.
После фильтрации производят концентрацию экстракта при пониженном давлении с уменьшением его объема в четыре раза. Затем концентрат обрабатывают двумя объемами ацетона и получают при этом 380 г неочищенного продукта, концентрация которого составляет 7000 ед/г.
Полученный продукт обрабатывают 3,8 л водного раствора карбоната натрия концентрацией 0,002 М, центрифугируют и заливают равным объемом насыщенного водного раствора сернокислого аммония.
Выпавший осадок центрифугируют, обрабатывают водным раствором углекислого натрия. Концентрация полученного продукта составляет 0,002 М.
Нерастворившуюся часть осадка удаляют центрифугированием.
Раствор после этого деминерализуют путем его пропускания через колонку «Sephadex
G-25» с использованием в качестве буферного соединения раствора углекислого натрия концентрацией 0,002 М, после чего полученные таким образом активные элюаты стерилизуют пропусканием через мембрану Tillipore GS c последующей лиофильной сушкой.
Выделяют 57 г готового продукта, концентрация которого соответствует 49000 ед/г. ю
Способ получения уриказы путем выращивания культуры-продуцента в аэробных условиях на среде, содержащей источники углегода, азота и минеральные соли, экстракции культуры водой или буфером при нейтральном или слабощелочном рН и выделения и очистки целевого продукта из экстракта из20 вестными приемами, отличающийся тем, что, с целью получения фермента с высокой удельной активностью, в качестве продуцента используют культуру Aspergillus flavus oryzae № 624, которую выращивают при 20 — 35 С и
25 рН среды 4,0 — 8,0 в течение 15 — 60 час, отделенный мицелий замораживают при температуре от — 15 до — 30 С и измельчают, а экстракцию осуществляют при температуре пе выше 30 С.
