Способ получения фибринолитическогофермента

 

ОП ИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (») 434662

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 25.07.72 (21) 1817741/28-13 (51) М. Кл. С 12d 13/10 (32) Приоритет 27.07.71 (31) 7127449 (33) Франция

Опубликовано 30.06.74. Бюллетень ¹ 24

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изооретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Дата опубликования описания 23.12.74 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Андрэ Беллос, жан Флоран, Жан Люнель, Дениз Манси и Жан Веррьер (Франция) Иностранная фирма

«Рон-Пуленк С.А.» (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО

ФEPMEHTA

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению фибринолитических ферментов.

Известны способы получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

Предлагаемый способ позволяет получить более активный фермент.

Для этого в качестве продуцента используют штамм Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL) 3987.

Способ получения фибринолитического фермента, названного «Энзим 22750 RP», заключается в том, что микроорганизм Streptomyces venetus DS 24288 или его мутанты выращивают поверхностным или глубинным методом в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, стимуляторы роста, сгустители.

Перед выращиванием только штамма в производственном ферментере готовят посевную культуру по следующей схеме: хранение — выращивание вначале на агаре, затем во встряхиваемой колбе и в ферментере для получения инокулума.

В качестве ассимилируемых источников углерода могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины, амидон, меласса или другие насыщенные углеводородами вещества, такие как сахарные спирты, например глицерин или манит, или некоторые органические кислоты: молочная, лимонная, винная. Некоторые животные или растительные масла, например

10 масло шпига или соевое, могут с успехом заменить углеводородные источники или служить добавками. В качестве источника азота могут быть использованы простые химические вещества, например нитраты, минеральные

15 соли или органические соли аммония, мочевины, аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие в основном азот в виде протеидов — казеин, лакталебумин. глутен и их гидролизаты, соевая мука, арахидовая му20 ка, рыбная мука, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, отходы пивоваренной промышленности, кукурузный экстракт.

Среди дополнительных неорганических элементов некоторые могут иметь действие бу2S ферного раствора или нейтрализатора, например щелочные или щелочноземельные фосфаты или карбонаты кальция или магния.

В среду могут быть введены вещества, которые вносят необходимое ионное равновесие в

3о развитие Streptomyces venetus DS 24288 и на434662

50 рН 2,2; мк 0,09 рН 4,0; мк 0,1 рН 8,6; мк 0,075

pI I 9,6; мк 0,1 б0

3 копление фермента. Такими являются хлориды и сульфаты щелочных или щелочноземельных металлов. Некоторые являются активаторами метаболических реакций Streptomyces

venetus DS 24288, например соли железа, кобальта.

Что касается сгустителей, то обычно используются амидон, карбоксиметилцеллюлоза, агар.

Вначале выращивания рН среды устанавливают 6,0 — 7,8, предпочтительно 6,4 — 7,5.

Выращивание осуществляют при температуре 23 — 40 С (25 — 28 С является оптимальной) в течение 1 — 7 дней.

Наиболее удовлетворительный процесс ферментации осуществляется при аэрации 0,3—

2 л воздуха на 1 л/мин среды.

Энзим 22750 RP может быть выделен из ферментационного сусла и очищен с применением обычных методов выделения и фракционирования белковых материалов, при этом активность и степень чистоты продукта контролируется соответствующими способами, например определением активности на казеине и электрофорезе.

Энзим 22750 RP может быть выделен из фермента ционной среды фильтрованием последней в присутствии фильтрационной добавки, фильтрат концентрируют при приведенном давлении, подкисляют при рН, близком к 4, вновь фильтруют, диализуют потоком дистиллированной воды, затем осаждают фермент добавлением ацетона в диализат.

Фермент энзим 22750 RP, полученный гаким образом, может быть затем очищен с использованием обычных физико-химических методов. B,÷àñòíîñòè, применяемые методы очистки, заключаются в растворении фермента в дистиллированной воде, с последующим осаждением при добавлении агентов, в водных концентрированных растворах которых фермент малорастворим, например в средних солях.

Фермент может быть очищен хроматографией на различных основах, например алюминии, целлюлозе в порошке, гелях декстрина или полиакриламида, диализом или подготовительным электрофорезом.

Фермент, полученный по данному способу, имеет следующую физико-химическую характеристику. Он очень легко растворяется в воде, в водно-спиртовых и водно-ацетоновых смесях, малорастворим в концентрированных растворах нейтральных солей (NaCI; (NH4)gSO4) или полиэтиленгликоле и нерастворим в безводных спиртах, ацетоне, гексане, этилацетате, эфире и хлорированных растворителях.

Фермент 22750 RP является протеином, вступающим в классические для протеина реакции (биуретовая реакция, реакция Фолина, окрашивание красным Понсо, черным амидам 12 BN или голубым Гомасси) .

Фермент содержит углерод, водород, кислород, азот и серу. Его элементарный состав следующий, о : С 50,4; Н 7,35; Х 17; S 0,50.

При проведении хроматографии на геле декстрана или геле полиакриламида молекулярный вес фермента равен 40000 -5000.

Проведение кислого гидролиза фермента энзим 22750 RP позволяет выявить следующие аминокислоты, на 10 г продукта ммоль: аспарагиновая кислота 11,6, треонин 8,5, серии 7, глутаминовая кислота 3,5, пролин 2,5, глицин 13, алании 7, валин 4,5, метионин 1, изолейцин 2,5, лейцин 4, тирозин 5, фенилаланин 2, лизин 3, аргинин 2,5 и гистидин 2.

Физические свойства фермента следующие.

Внешний вид: белый порошок (после лиофилизации) УФ-спектроскопия (определение из раствора в воде 0,03 ): абсорбция 210 нм; 1 ",„=187; минимальная абсорбция 250 нм; LI,"„, =4,35; максимальная абсорбция 278 нм; Е ",„=13,35.

ИК-спектроскопия (определение на таблетках в смеси с КВЧ) .

На фиг. 1 изображен спектр, на котором по оси абсцисс с одной стороны отложены длины волн, мк (высшая шкала), с другой стороны число волн, см — (низшая шкала), на оси ординат представлена оптическая плотность; на фиг. 2 дана диаграмма результатов, полученных с применением фермента энзем

22750 RP.

Указанный спектр изображен на рис. 3, по абсциссе с одной стороны отложена длина волн, мк (верхняя шкала). с другой стороны число волн, см — (нижняя шкала), и на оси ординат представлена оптическая плотность.

Основные полосы поглощения для данного продукта следующие.

Вращательная способность: (определение на растворе 0,5о -ном в воде). (сс) P) = — 14+05 (aj 4зь = — 29,2+-0,6, Ы з о5 = — 53,5+-0,8, Фермент 22750 RP можно также отличить по его поведению при электрофорезе на геле ацетатцеллюлозы при использовании различных буферных растворов; лимонная кислота — вторичный фосфат натрия уксусная кислота — ацетат натрия диэтил - 5,5 - барбитуровая кислота (барбитал) едкий натр — глицин мк-ионная сила

Индикация может быть осуществлена колориметрическими методами или изм;-рением на протеолитическую активность.

Например, при рН 4,0 активный фактор перемещается к катоду, происходит перемеще.

434662

Таблица 1

Активность знзимов

Температура реакции, - С

Концентрация субстрата

Субстрат рН реакции

Реакция

Фермент

22750 RP

Химотрипсин

Трипсин

Субстрат 5 г/л

Субстрат

12,5 г/л

Желатиновая пленка

Казеин

Азоказеин

8,0

7,5

37,0

37,0

Протеолиз

28000

13300

3250

Желатин

37,0

7,5

800

Фибриноген

10 г/л

Плазма

400 см /1

Плазма

200 см /1

Плазма

200 см /1

Сгусток бычьего фибрина

Сгусток плазмы кролика

Сгусток плазмы собаки

37,0

7,4

Фибринолиз

6780

37,0

7,5

3800

7,4

37,0

37,0

7,4

Сгусток плазмы человека

200000

10000

Субстрат

5.10-4 М

Субстрат

S 104- M

ВАЕЕ

25,0

7,7

Эстеролиз

34000

АТЕЕ

25,0

7,0

116000 йие 5 мм/2 час, при постоянном напряжении, равном 250 в (интенсивность изменяется от б до 15 ма).

Фермент оказывает влияние на большое число субстратов, носящих белковый характер и, в частности на казеин, гемоглобин, фибрин. Очень незначительное воздействие оказывает на этиловый эфир бензоиларжинина (BAEE) и абсолютно не влияет на этиловый эфир ацетилтирозина (АТЕЕ).

Воздействие на казеин определяется в соответствии с методом Кунитца, применяемой при дозировке трипсина.

Растворимые в трихлоруксусной кислоте пептиды, освобожденные во время гидролиза, Тром болитическая и фибр инолитическая активность подтверждена испытаниями на лабораторных животных.

При дозе 0,5 мг/кг, введенной внутривенно, фермент 22750 RP весьма значительным образом предохраняет кролика против внутрисосудистой коагуляции, возникающей при проходе по шейной вене нейлоновой нити, импрегнированной коллагеном. Ускорение фибринолиза может быть выявлено у кролика при дозе 0,05 мг/кг, введенной внутривенно.

Токсичность фермента 22750 RP изучена на многих видах животных. У мыши летальная доза определена при введении внутривенно 50% (ДЛ«): она составляет 5 мг/кг; доза одна и та же при повторяющемся введении в течение 5 дней и при одноразовом введении.

У кролика ДЛ«, введенная внутривенно, составляет 1,5 мг/кг.

30 измеряются спектрофото метр ней (измерение оптической плотности при 280 нм). Энзиматическая активность может быть выражена в единицах Кунитца (У, К). В соответствии с определением Кунитца, одна единица составляет количество энзима, который освобождает достаточное количество растворимых пептидов для того, чтобы оптическая плотность при

280 нм трихлоруксусного фильтрата возрастала до 1,000 в минуту.

В табл. 1 представлены результаты, полученные с применением фермента 22750 RP в сравнении с двумя протеолитическими кристаллизованными энзимами: трипсином и химотрипсином.

Благодаря таким свойствам фермент, полученный предлагаемым способом, можно применять в терапии для профилактики и лечения венозных тромбов, легочной закупорки сосудов, тромбозов венечных артерий, артерий конечностей и мозговых артерий.

Микроорганизм — продуцент фермента

22750 RP — принадлежит к Streptomyces venetus DS 24288 (ИКК1 3987).

Продуцент выделен из образца почвы, привезенной из Индии.

Выделяют Streptomyces venetus DS 24288 по известной методике. Согласно последней в стерильную дистиллированную воду вводят небольшое количество почвы. Из полученной суспензии готовят пробы различной концентрации. Затем небольшой объем из каждой пробы наносят на поверхность питательной среды с агаром, находящейся в чашке Петри.

434662

Осуществляют выращивание колоний на поверхности среды в течение нескольких дней при температуре 25 С. Затем некоторые колонии изолируют и пересаживают на питательный агар — агар, находящийся в наклонном положении, для получения более обильных культур.

Streptomyces venetus DS 24288 образует овальные споры размером 0,4 — б мк (чаще

1 — 1,2 мк). Спорофоры содержат спиральные нити, которые наматываются в 5 — 8 оборотов, но иногда превосходят это число. Часто встречаются спорофоры, располагающиеся на нитях, которые их держат, встречаются также спорофоры гроздями из нескольких элементов. По своей манере споруляции это начальное звено можно отнести к классу Spira классификации Придхама.

Streptomyces venetus DS 24288 хорошо развивается при температуре 25 С и 37 С, плохо при температуре 50 С. Он обладает способностью производить черный меланиновый пигмент в среде, подходящей для тирозина.

Штамм образует Н Ь. Нитраты восстанавливают в нитриты.

Гидролизует амидон. Желатин сжижает.

Молоко пептонизирует без предварительной коагуляции, Использует целлюлозу.

Окрашивание мицелиума происходит поэтапно, в зависимости от среды, в которой он находится: от желтого к желто-коричневому, коричнево-желтого или темно-коричневого.

Растворимые пигменты, которые он производит, имеют обычно коричнево-желтый тон, более или менее темный, в зависимости от среды, в некоторых случаях цвет может быть коричнево-черным. При наступлении споруляции его воздушный мицелиум окрашивается в голубой цвет.

Культуральные и биохимические свойства

Streptomyces venetus DS 24288 собраны в табл. 2. Представлены культуры, имеющие удовлетворительную стадию развития, т. е. выращенные в течение трех недель при 25 С.

Качества продукта подвергнуты исследованию на питательных агарах и бульонах, которые обычно применяются для определения морфологической характеристики рода Streptomyces.

Выращивание на твердых средах проводилось на агарах в наклонном состоянии. Некоторые среды приготовлены по формулам, указанным в «The Actinomycetes», A. О. Ваксман, стр.

193 — 197, «Chronica Sotanica Company, Waltham, Mass»; США, 1950. В этом случае эти среды обозначены в табл. 2 буквой В с номером, который был ей присвоен в «The Actinomycetes».

Streptomyces venetus DS 24288 обладает признаками, которые точно не совпадают ни с одной характеристикой культур, ранее описанных и использованных в качестве основы.

Фермент 24288 занимает место в известной серии Viridochromogenes, при этом принимаются во внимание его свойства производить меланиновый пигмент, обнаруживать воздушный спорулированный мицелий голубого цвета, растительный мицелий от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, образовывать растворимые пигменты от желто-коричневого цвета до коричнево-желтого или очень темного коричневого, в зависимости от среды (органической или синтетической), и представлять собой спиральные спорофоры. Он не может быть приравнен ни к одному из трех видов, на которые ссылается Л. О. Ваксман, и составляющие эту серию, а именно: Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces chartrensis u Streptomyces суапепз. С одной стороны, он не может быть отождествлен с Streptomyces cyanens, который образует на агаровых средах растительный мицелий, окрашенный s голубой цвет, этого никогда не происходит с ним; кроме того, в противовес S. venetus DS

24288, S. cyanens не использует целлюлозы и не восстанавливает нитраты в нитриты.

С другой стороны, он не может быть отождествлен с S. chartrensis, который дает растворимый пигмент зеленовато-желтого цвета к черному на келатине и не дает растворимого пигмента на питательном агаре и картофеле, в то время как S. venctus DS 24288 дает растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на желатине, а также на питательном агаре и черный растворимый пигмент на картофеле.

Наконец, он существенно отличается от

viridochromogenes тем, что последний образует на некоторых средах растительный мицелий, имеющий оттенок очень темно-зелено55 го цвета, иногда даже зелено-черноватого (в частности, на нитрированном синтетическом агаре с сахарозой, на желатине и на питательном агаре). S. venetus DS 24288 образует растительный мицелий, который во всех случаях имеет цвет от желто-кори шсвого до коричнево-желтого и не имеет никогда зеленого оттенка, он также никогда не производит растворимого пигмента темно-зеленого цвета.

S. viridochromogenes не восстанавливает нит45 раты в нитриты, в то время как S. Venetus

DS 24288 восстанавливает их быстро и активно, как в синтетических, так и в органических средах.

А. О, Ваксман относит также к группе

5п «viridochromogenes» некоторое число основных культур, описываемых Гозом и др. (Zur

Klassifizierung der Actinomycetes, G. Fischer, Вена, 1958); сравнивая его с последними, которые составляют основную часть серии Goc55 rulescens, Гоза, S. venetus DS 24288 находился бы в последней группе, которая включает все основные культуры, среди которых растительный мицелий на агаре с амидонминеральным азотом Гоза имеет темный цвет и вклю6о чает только два вида: Actinomyces (Streptomyces) viridochromogenes u Actinomyces (Streptomyces) coeruleofuscus, S. venetus DS

24288 отличается от вида S. viridochromogenes тем, что мицелий последнего на некото65 рых средах имеет темно-зеленую окраску.

434662

СЪЪ сЪ о Ъ а

О"ъ

f» сС о

cD

f» Ъ о

С

«1 сс;

4 а

0 О

c= « ф х с»

,а у ccl о

o.m

8,о

О

«

O ъс

СО

cd о х

И х

F о о о х

О

О

v ъх о х х

p v х со х х

И ф

О V д х

Ъ»

cD

М о

«О

О х х о. о х

cd

O о

О ф

О х х, асх о 2 ф

О х

g о

m х х х а о

М х

О

М о ф

О х

О х а о

%х ъх

О с» х а О о ф (» х

v сб а ъх

2 х а

О Ъ о

О О о о

cd ъО ф о

c ; О с

О

О сО с> Ъ

o + о

cd ф о о vo

0 v сд о

Ъ

Sm v

Е»

CCl о х

< о

О и и о о ф о со

О

sm

Е" ооф «х

< о

О с

CA v о

О ф о (Я ЪС

О

Ъ Х О

2 х

СС ф о

Ж с.ъ о

О с

О э

М

Ъ» Ъ о а о хо

cf о

ЪО Ъ

ЪО о о о о х

2О f» х (ЪХ О

О 2х

Ъ хфо фи а = х

О а о ф

О х а о х ъ со х х о и х -х сад

О

О

Ц о с, о х

9 о сС

8 о а о с

«( о сС о

1 ф

О х и со

° О

clS

m о а

v съ

O (-

О

ccS

ЪО х и О сО х

О ао

СС

О Х х х о и а

О и

Я х

О

СО

ccl о

Р.Ъ (»

Я ъ

М ъх х

О

О

t» ф

t» х а

Ф

Ъ х

И сс фоо сС, ъх .О х

И х д

:-ъ ф сб

CcS "Х о О д ф ъх ъх

2+сО х хахо

m o

CtSsm а-"

Е»" ъо, о сб

ООХО а ахБО

СО

«0

ОС.ЪО ч,:. о

О ъо оъ сО ъ

0 v ссс сО

Ъ- "" Г сО (аЖ л, с сО О»

Я («

2 о, о

Х ъо

vQ

О с»

ОО и ф р Ось ф о

Оа

О (С Т«

1 o ф

Х О хх о. о о, х о

О ХО х их о

О а

2 О ф

2 о х с- 2 ф сл ф m

m o

Д о.о

О,. " СЪ оъх а о о со Х оо (»

v х

Ф

dS Х х о.

f î х сс а

ЪОфх

Ох а

О О

1 1 ох а

o z

v

О ф

О ф

2 сС ха

О

О х о» х

О

Оо

I о

t SQ х съх F»

О

О (О ф о" х

О СЪ щ со

Ъ о о ф

v tts

ccl а

f"

- о

cd а cd ъо

o=

ОХ О аМ о о

ЪЪ о

«2

Ъ

«с

О сс, ! сО Оъ о

Ъ ЪГ)

° R ЬО

Ч P

О х

1 о ф

m х х а о

& ъх (1 о, 2 х ъ

o=.

&» о ф фх О а х

v о, X

О сО ф й

М аа о— (:

О О х

C- Cd с а

t» f»

<, v х

Ф (, о с о о

Ь .о „., ;а о о ц о

,"

О) оъ ч сл оg

Х О, н .х

«х О

t» х

F "M О о2х хфo х

О а „ =

СЪ О, -х у, оо х

ОъХ сО а о О

Ы

v ф о

v m и аcd СС сС М

О- О + (сЛ Ъ Ъ

Ор

«Ос з ci, \

О с о сс и

О

Ъ сл ( ñ7

Ъ«

О „ о «ъ

Ц о - с

В

cD

Ъ о ф

О х а о Ъ

Е"

1 сС сС ф о ф о о о о. ф

О

v v

1 о

О х д О

O m — о сх Х сх »

FcХО

o-v ф

F ъ

= сО О ф

:= х сС О а о о. о

О

О ф х о с-"Т х о о

ccS о х

Я ъ,о

O.ä сС « ъс ЪХ

В (МЪ, СъС . ъ ( а

v ! ОЪ, оо=о с ъ Я

-о"О .v

«iv J с, 3 о mсо;

СЪ

° «с

= Sc>Q

«C< c-Ч ъ » о

Ъ Ъ, о B.

Ъ

cd

c o

О g

И,О

О О (»

z x сС v ф о о

Д о х О са

Ох х о о ф

v cs

"а х о

f» ф х а«фф с х ссха

О О аО х

".с ОС

- ъх х

О О

_#_ cd ооО аале х с (»

О О ХХХ

F cd х ф о о

ЪО асО

С- f» cd с v а

Х lg

О с

С С

Ъ о,о о

1 сС

5 СС

- О ф

CcS й

z o с хоф

2 офо

0 с- о.

cd О

Х х хх а" оф х

Х О х о (О

О,О лф«

О О х

-х ьх .О (» х 2

О Е»

О ф

vmm

С> ф сО О а х хо аа о

x v

1 W 1 б

% к о

df о

О х х и

dj m х е

3.3 ъх о

Ijl

О 0 х

1

3.

О

О ф

Й х х а о х

И 2

i» о

f» к

Ф х ъх

FÎl ъх ф

О д

3 Х

О Х фа

0о х

С0 :.( о к

Ф х х д х Г„

3- Х

О Ъх х х о

f» к

О

К -х«

ЪХ фл д О к х

t x

О Х

0 О х б х о Ъх ъ

3- О Х О Cd

К 3

Х фоо

Мох

О ф С4

О О х и

О

Й х х

С4 о ъх д

Н к

Ф

И о ф х

С4

О ЪХ

И 2

f сх

3 и х а О о и ф с»

f x

Ы а о ф

Й

Х ЪХ х а 3ок

"3 ф

cd а

».Ъ к оъх с я !

33»

С0 л о к о.

О

О v ф

03х о со ф о

CQ

О к

f x

ccj

О ко

cD

2 и о

М Ъ

X о х, 3О л ф к

LQ О ф

1 о

О ъх о 0

Ъх

3О л ко

О 1

m o

0„ф

Ъх О

«ъо

cd

g o о д к

О о, е»

3М л ф

CI3 х

1 л х а

»

v—

:Я fa» к

Х 1

cd ф О

О Х х

-. o х m аф

o > х о а«

3-О>, к х о

« о х, Ъх

33

Х О о ко х ф рс О а ь. х а хо ъх уО

Оо х „ х ах х ох ха х

О О

3» Х»3 х к

ЯМ х

f» «х од

3 3 щ х к а х

3

cD,33 М

f 3m

О с х,", ха ко а 1 хо

V 3х о ъх

«хл л (»

f- ъХ КО о л

f» 1

m cd O

Х III

Х О ак х

v 0

I о, х д х

f ЪХ Ф о х

Lr-1

Х 333 О

m с - О х х

v O.

О

f- o

О m

Ф х ф»х х f».

m o m аХ cd О !»

ОЙ" о О аМ о о ф

И О х х

"а хо фхх а ь

ЪО ф f»

Охк

O4Х

1 с» ф о

f к х

cd

m

О

tQ

cCj

Е к о о ф

O О х О

2 о

С4 о к л х (»

О !

» ф

3» <

0 а

»3 о х а д о ф о О О

5 о

О4 о

»С а о

»С О

О х с

С», 0

cd

О cd хк хх и С о

R х

О

И сэ х

1 х х

С4

«»с

Ф м

ccj а

f х х

1 х о к а.

Ьъ к !

ЬЪ

ccj

cf

С4 о, х о ф

3=3 О

O4 g ф

О Ccj

3 Ь ам о о х х ю а

f»c С

О ф (-с сЬ

v и ах

ICj

Р а

В а

»3

Ъх фоООХ

3Х Х М д дхк х ко цксо2а ,х йо ехх

3-(v v

ОЗ-О,Х

g) СЮ 33 ъх сх г

2IQ cd x хах о д 3 к ко

О.х С4ОХ

Х с!»

i» кох о

cd

ОхХа ах хо

Я

О О х

1 о х о g

cd ° cd ф а ох кфо

О Х CO (Q со ссс

»ъ к

L v о х х а

ccj .

t СМ

Й Kl о с » а

O cd х

C3j Cd

3Х к

3 х! о

m

О

О

33» cd

О а о х кфо

О RCO

Я!О Cd к

s v

3 рМ

:,, 33» о\

< f».

Ч Ъ ю

СС) 1-!

Я

° Ц 3О

Ч.Ъ, ОЪ

3» с»

L W о С . c»

СЪ 1

3 . ) ф

Î L cc3

Я !

»0Ч Ъ о а 3С» о

С4Х о х

y»d cD X cd

à3o-хх ад -о о o4х

V О х ох

1- V К Х и ъф

О ф

Д с д 3- Х Х

Х-ХОХ333д

Л\Одфффс съ» Х К О

m O m dj c» fф j ааоах

Ок х ахИ

»Х О О Х О о0 х х » к

434662 о \ ЛЪ (Ф й. ° .о

3»4,» К Р

3»! 333

О) Кс

, Ф . 3, 4 d.-Q

3-

-е ф („ ф

О»! 4. > Х Ьд» В О

Ъ 3 Ъс, ) 3 ф

333 ф о

4 3 f» м

3 хф хсо

3:(3» х о с»

ccj

ЪХ

° к

Ри

ccj х

О

И

»! с:3

С4 с-! " о аа ф к - и

t) О 1 к я с

1 С»

СО

О 1!

Г.и х аО

О Х

Е!, О

3- с » Ъ л ф <О

f- o

Оа щ

Ф к ф < о о о,. д

o" °

3О О съ» х

cD х х

3" ч

СО 3»

3-С

О

3 х

». ххл

О

О О .6 »3

3» 333

О Ъ « ф 333

- о

vа ф

О к

m cd ф

ОФЙ о с„х

0 а

ОО

1 О х х х > ак m o ооох (» л аО

3 л! д

3-Х М

О ф O

y m cD 3

Йхх

cd л х к о

„o.

f ф v х х гб хх о

f» с» о

О х х оъ

О

Г4 !»Ъ! к» а,g

o o

33»

cd a

Х 3

kf х х

K *.*

33(cd х

О х сб » (,ф

w f»Q а

v.. о

Х 33 са о у а

+ cd х к

О 1

ыд с с»

00 О!

Ссс «-c Ъ

Q, Р«

Е» х

О I I °

dS О ила ф

-ф х о хф1 о

СС(СР х х

О Р(Р

О (» к» х

+Cd VV

X c; O cd д

ООО асо фд

Р(ахО х о о х с. Х„

О Х и сс«Х( РХ2 ф Х Р«(- О .Р со охх ф (О«Х

Оф СОХ

СР CIS Cd Х (02л» о а

O cd dS dS +

Оххфх

dS cD 0 cD

v аМ! м

cv с с

С! х х

cD d« (О я «х о ф о х со

3 х (- Сс!

CI х Х о

О ох

Е» х

С!

Р

О с(! сб ах (» х

v (д CCI сс(1

О о ф х

2 п

O О

И л (» х (О «х х

-"х (ccl ф

cD х х

О, о

«х

Р

V. х а О о м ф (» х

v сс! а

«х

2 х ах

С!

2 х

«о

f» сс! ф х «

О д са " (- а о cd

-" 0 0 Х Х х

ОООа ф аф д о о 2 сР О о х! о ф

«С

1D (» х а5

И о о

v ф о

Ж с

О Х О

2 (»

cd

oф х

О (Щ о о

v х .Р ф (ф сб cd фа о о ,! 10

Сс«cd о х

С! (cD х"

ä 2о (» ф а5 С! х

Id Р с Р ах хо2 о х («х

Р; ф а О х х х

О 0 о 0 х х сс ао

С!

1 о О

ID х

Р а оо х х д

o < х о и х

О

3 ф о ф х х х

0» о х х д а а

О

Р

& о

1 х л хх

D «х

2 х о

О Р х и о ф

1 с

О

cd

Я сР

СР х

0 о с! о

Р« f» о с

О (- v 0

cD 7 ", СРОЛ оф

О х

cS сС С« (- а сс! О «х

IC! Д о х

1D ф

fQ cd c»«

W cd ф о. х

М х х ,(! х

О ф

М о а

O х х

Й о а о с

О а

»

rt с

О

° в о A

«х х

I ,о

СЧ

° Ч о с« м х а

3

О х о

О

Е» а о„

Cd O ф х о

kS X х Я

Id

1=( а«х

v o

cd ( х Я

lй( х (Ф х

Яг» оД

Ф и « «х (ccl Q сс«О

Хфс с(ф х ф я " х

>д>а о

,ф(о O Е (20 О

СР -СР о охх

CQ cd Х

О. Р(«х

«Х» СРХ

2 ф х хах о л

cd O

О,х 0 Х

» !О х-оф офхо х

ЯЦ О, о

О

1 Д «х

Р! а х о. " ,р, S

Р«

clS 2 ф Cd (- о

О а (- cd

О х ф cd

О О (»

О, л о с-» с! м ох

О О (- о х х ал (О х t

О хо х

О О

1=(х « о д х о ф С« о о ( а

1 (» х о

И х х

ОО х Ъ

L С! о

О к о

cD Х

N л

О С! х х х сс! о о л

Cd o х о о O

c«S 1 (- 0

) 0, ",„ОС0

0 с ) сР 1 « ч« сп и С(с с с

0 (!1 1

40СХ с- ф

>«Р«

1\ Чс ч. Р«0 («

0 С«М ф о (. о

» х ад (» с»

О х ( х

CS х о х

О о

Р

,х о О

Р о

\, о х ( ф ф О ж х а ". о о хд о

D„O о о

РСО о ф (» ф

РР (х

»

« лх о д о ао

«х х х

СС

434662 х

О

Р« о

f о

М а= ! з

» «с х Ъ ( ч О

Р«

С!С О

c1S о уо ч v с(.

2 х

1 I

ОО ф

Р О х х

D,х о х а о ох, 2

<хо ф х

1 о ф х

СР сс! с» х х д (»

Д о ф ххх

О

8 х о „

0, 0 о (1D ф

О 0(О 0(0 ох ф о о

2 ф о

О О хоД х х

О Х

О. О

° » х

cD O cd со с. Cd о ах «

«.с х к

О <О

ХОО !

С И с! а

«О О фхф

Х Х со

Ф

Р(ао хх»х (» (СЧ

С!

Р-. (с. о о

0 о

О с«

0 о х х с«4

О ас х (О

«Р с, Рсы хо о

ХО

cc«С!

С! р (ОО С (= cd

Р!,х

„, а

Cd х х! хсзр с»

cD с О о (cu a

О (С

С! о ф

v ( о

СР О,, 1

Р(СС сс Сх х" с« с««

СР Х Ъ» х > с:( gz с

О СС О

О X

Охх ф I»

Ьс! о

С«

С. о (Q с«

O ISIS . («

«0«

434662

Источники углерода

Использование

Источники азота

Использование

D рибоза

D — ксилоза

Положительное

NO,Ыа

NO,Na (NH4) SO4 (NH,),НР О, Аденин

Аденозин

Мочевина

Положительное

L — а рабиноза

L — рамноза

D — глюкоза

D — галактоза

D — фруктов а

0 -маниоза

1=сарбоза

Лактоза

L аспаргин

Гликоколль

Отрицательное

Положител ь ное

Саркозин

DL — алании

Отрицатечьное

Положительное

Мальтоза

Сахароза

Трегалоза

DL — валин

Положительное

Положительное

DL — аспарагиновая кислота

Целлобиоза

1 — глутаминовая кислота

Рафиноза

Декстрин

Инулин

Амидон

Гликоген

Отрицательное

Положительное

Отрицательное

Положительное

Глицерин

Эритриол

Адонитол

Дул ьцит

D — маннит

D — сорбитол

Инозитол

Отрицательное

Положительное

Отрицательное

Положительное

Отрицательное

Положительное

Салицин

Положительное, но медленное

Кроме того, в описании, приводимом Гозом и др., следует отметить, что S. viridochromogenes производит также растительный мицелий, принимающий темно-зеленый оттенок на молоке, на агаре с амидоном, на картофеле, на агаре с амидонминеральным азотом Гоза и не производит в последней среде растворимого пигмента. По сравнению с ним S. venetus DS

24288 не дает никакого растительного мицелия темно-зеленого цвета в указанных средах и производит растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на агаре с амидонминеральным азотом Гоза. Образование растворимого пигмента темно-зеленого цвета на желатине, которое приводится Гозом для S. viridochromogenes, отсутствует для S. venetus DS 24288.

S. venetus DS 24288 не может быть отождествлен с S. cocruleofuscus, который в противоположность ему не восстанавливает нитраты и не использует целлюлозу. Кроме того, S. cocП р и мер 1. Получение фермента.

200 сма культуры Streptomyces venetus DS

24288 высевают в колбу Эрленмейера и осуще твдя@т культивировацид при температуре

16

ruleofuscus не дает растворимого пигмента в агаровой органической среде и на картофеле, в то время как S. venefus DS

24288 регулярно дает на всех испытывае tbIx

5 средах органического происхождения растворимый пигмент коричнево-желтого цвета, а на картофеле дает растворимый пигмент черного цвета.

Способность S. venetus DS 24288 использо10 вать различные источники углерода и азота для обеспечения своего развития определена в соответствии с принципом метода Придхама и Готтлиба («J of Bacf», 56, 107 — 114. 1948).

Степень развития наблюдалась на основной

15 среде, указываемой в предлагаемом изобретении, с заменой глюкозы различными источниками углерода, либо (NH4) SO различными источниками азота.

20 Результаты приводятся ниже.

L — аргинин1

L — лизин

DL — серии

И вЂ” треонин

Таурин

DL — фенилаланин

L — тирозин

DL — пролин

L — гидроксипролин

L — гистидин

L — триптофан бета ин

26 С, перемсшивании и аэрации в течение

28 час.

Выращенную культуру перссевают в ферментер емкостью 170 л, содержащей стериль434662

17 ную охлажденную среду следующего состава, г:

Пептон

Мясной экстракт

Гидратированная ггпокоза

Соевое масло

Хлористый натрий

Вода дополнение до 1!О л

1200 смз

600 с рН 70.

Перед стерилизацией рН среды устанавливают 7,5 добавлением 120 смз 10 н. каустической соды. Стерилизацию среды осуществляют барботированием пара при 122 С в течение

40 мин.

40 л культуры полученной предыдущим выращиванием, вносят в ферментер емкостью

800 л, содержащей среду следующего состава, кг:

Кукурузный экстракт (50% сухого экстракта) 8

Соевое масло б л

Сульфат аммония 0,8

Гексагидратированный хлорид кобальта 0,008

Вода дополнение до 360 л

Перед введением культуры в указанную среду рН среды устанавливают на значении, равным 6,4 добавлением 450 см 10 и. каустической соды, после чего вносят карбонат кальция в количестве 2 кг и стерилизуют бароатированием пара при температуре 122 С в течение 40 мин и охлаждают. После охлаждения объем среды составляет 390 л. Объем среды доводят до 400 л добавлением 10 л водного стерильного раствора, содержащего 4 кг гидратированной глюкозы; рН среды становится 6,6.

Выращивание осуществляют при температуре 26 С, перемешивании центрифугой, аэрации стерильным воздухом в объеме 35 мз/час в течение 116 час. В процессе выращивания рН среды устанавливается 6,8.

Протеолитическая активность культуральной среды составляет 0,4 УК/смз.

Выделение фермента из среды. В 360 л среды ввели фильтрационную добавку, перемешивают и профильтровывают на фильтрпрессе. Полученный осадок промывают 100 л воды. В результате получают 400 л фильтрата с активностью фермента 0,35 УК/см .

Фильтрат концентрируют при 3 С и получают 30 л концентрата с активностью фермента 3,77 УК/см ; рН концентрата устанавливают 4 0 добавлением 450 см 6 н. соляной кислоты и затем вводят 300 г фильтрующей добавки. Отфильтровывают, полученный осадок промывают

2 л воды.

Осветленный концентрат охлаждают до

4 С. продиализовывают через мембран из регенерированной целлюлозы в течение 7 ча: с протнвотоком дистиллированной воды при той же температуре. В приготовленный таким

1збразам растВор медленно добавляют при

18 перемешивании 9.6 кг кристаллического сульфата аммония (количество, вычисленное для получения раствора с 30% -ным насыщением соли), перемешивают в течение 20 мин, затем отделяют осадок центрпфугированием, а в фугат при перемешивании добавляют 5 кг кристаллического сульфата аммония (количество, вычисленное для получения 52% насыщения), перемешивают в течение 15 мин, полученньш раствор выдерживают 15 мин и центрифугируют.

Собирают полученные осадки, добавляют

1 л дистиллированной воды и раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 24 час при 4 С в противотоке с 40 л дистиллированной воды.

Диализат лиофильно сушат. Получают 70 г фермента активностью 1200 УК/г. После анализа на электрофорезе установлено, что он содержит около 13% активного фактора.

Очистка фермента. Полученный вышеуказанным методом фермент растворяют в

4100 см дистиллированной воды, рН раствора устанавливают 8.0 введением 66 см каустической cogbI.

В полученный таким образом раствор медленно вводят прп перемешивании 1,25 кг полиэтиленгликоля 1500, перемешивают еще в течение 15 мин. Раствор оставляют на 15 мин, затем центрифугируют при температуре 4 C.

Лктивньш осадок вводят в 700 ем дистиллированной воды и полученный раствор (800 смз) охлаждают до 4 С. При перемешиваHèè в раствор вводят 4 л изопропанола, охлажденного до — 60 С. Собирают активньш осадок центрифугированием, затем сушат при приведенном давлении (0,2 мм рт. ст.) в присутствии Р,О; при температуре, близкой к

20 С.

40 Таким образом, получают 30 7 r продукта с активностью 1600 УК/г, содержащего после проведения анализа на электр офорезе около

20% активного фактора.

10 г продукта, пол ченного при таких же ус4> ловиях. вводят в 400 см дистиллированной воды. и рН раствора устанавливают 8.0 добавлением 3 смз каустической соды. В раствор медленно добавляют при перемешиваHèè

26,6 см водного 6Я -ного раствора лактата диамино-б.9-этокси-2-акридина. После чополнительного перемешивания в течение 15 мин и 1 час отстоя центрифмгируют в течение

10 мин при 12 000 р и температуре 4 С.

Неактивньш осадок, полученный таким образом, удаляют, а фугат концентрируют при давлении 0.2 мм рт, ст. и температуре 25 C до объема 25 см, Затем раствор охлаждают ло 4 C при перемешивании и добавляют

250 см изопропанола, охлажденного до — 60 С. По ах ченный активный осадок собирают пентрифугированием в течение 15 мин при 12 ООО р и температуре — 10 С, затем сушат пои давлении 0,2 мм рт. ст, в присутствии Р О. и 20 C Получают 4,7 r продукта с активностью 2240 УК/г, содержащего после

434662

19 проведения электрофоретического анализа около 37% активного фактора.

200 мг, приготовленного в указанных выше условиях продукта, добавляют в 3 см фосфатного буферного раствора 0,01 М с рН 6,5, 3 смз изопропанола и 4 г целлюлозы в порошке для хроматографического анализа.

Полученную таким образом пасту помещают ровным толстым слоем на верхушку целлюлозной колонки диаметром 3 см, содержащей 80 г целлюлозы в смеси объема к объему изопропанола и буферный фосфатный раствор 0,01 М с рН 6,5 (высота 39 см). Добавляют буферную смесь фосфат — изопропанол, увеличивая линейное содержание буферного раствора в смеси от 50 до 100% в объемах (общий объем элюента с градиентом композиции составляет 1,5 л); расход 35 смз/час.

Элюат собирают фракциями примерно по

20 см и измеряют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора «УВИКОРД Л.К.В.» при 280 нм. Полученная диаграмма имеет первый очень асимметричный пик, затем на расстоянии второй симметричный пик, соответствующий концентрации буферного раствора 78 — 92%. Электрофоретический анализ показывает, что второй пик содержит активный фактор.

Собирают фракции, соответствующие второму пику (фракции 53 — 70 С, около 415 смз), затем удаляют спирт выпариванием при давлении 2 мм рт. ст., затем проводят диализ через мембрану из регенерированной целлюлозы с противотоком 10 л дистиллированной воды в течение 24 час при 4 С и сушат лиофильно.

Таким образом, получают 43 мг продукта с активностью 6200 УК/r и в соответствии с электрофоретическим анализом, содержащим примерно 55% активного фактора, Пример 2. 3 r продукта активностью

1600 УК/r, полученного при условиях, описанных в примере 1, растворяют в 40 сма буферного барбиталового раствора с рН 8.6 мк

0,0375 и этот раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 48 час с противотоком 10 л того же буферного раствора при 4 С.

Раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 12000 g и температуре

4 С, затем наносят на верх колонки для подготовительного электрофореза, содержащей

1,3 кг целлюлозы в барбиталовом буферном растворе с рН 8,6, мк 0,075 (что дает высоту

66 см).

Затем подают напряжение 500 в (анод вверху); сила тока 0,46 а; температура внутри колонки 20 С. Эту температуру поддерживают циркуляцией в двойной стенке охлаждающей жидкости при 4 C. По истечении первого часа электрофореза окрашенные примеси переходят в анодный отсек. Окрашенный буферный раствор отделяют и заменяют свежим раство. ром, Эту одердцр10 првторя1от несколько раз.

15 го

Удаление пигментов достигнуто почти полностью по истечении 6 час электрофореза. Затем напряжение снижают до 400 в (1 0,32 а) и в нижней части колонны проводят элюирование при расходе 250 см /час противотоком.

Элюат собирают фракциями примерно по

50 см и определяют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора при

280 нм. По истечении 15 час такого режима напряжение повышают до 500 в (1 0.40 а) и скорость алюирования противотоком 125 смз/час. Через 10 час после начала операции электрофорез прекращают. Затем в колонку сверху вливают барбиталовый буферный раствор из расчета 210 см /час.

Полученная диаграмма представляет первый маленький пик (к 23 час электрофореза), затем три больших пика, находящихся на значительном расстоянии друг от друга. Электрофоретический анализ показывает, что только в третьем пике содержится активный фактор. Группируют фракции, соответствующие указанному третьему пику (около 1425 смз), концентрируют до 400 см выпапиванием при давлении 2 мм рт. ст., затем трижды диализуют в течение 24 час каждый раз с 50 л дистиллированной воды при температуре 4 С.

Диализованный раствор концентрируют до

10см выпариванием при давлении 2мм рт. ст., затем охлаждают до 4 С. В раствор при перемешивании медленно добавляют 100 смз изопропанола, охлажденного до — 60 С. Собирают активный осадок центрифугированием в течение 10 мин при 12000 q и при — 10 С, затем сушат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии Р О и температупе 20 С.

Таким образом, получают 276 кг продукта с активностью 7000 УК/r и содержащего в соответствии с электрофоретическим анализом около 65% активного фактора.

Продукт содержит углерод. водород. кислород, азот, фосфор и серу. Его состав по элементам близок к следующему, %: С 44,0;

Н 6.5; N 12.5; P 0.35; S 0.65.

Кислый гидролиз позволяет выявить следующие аминокислоты с содержанием на 10 г продукта. ммоль: аспарагиновая кислота 8,5, треонин 7, серии 6.5. глутаминовая кислота 5, пролин 2, глицин 10,5, алании 7.5. валин 5,5, изолейцин 2. лейцин 3, тирозин 3,5, фенилаланин 1, лизин 2, аргинин 2 и гистидин 1,5.

Он обладает следующими физическими свойствами.

Внешний вид — бежевая пудра (после лиофилизации) .

УФ-спектроскопия (определение по 0.02%ному раствору в воде): абсорбция при 210 нм;

Еу см 205; минимальная абсорбция при 250 нм; 1 - 1",„7,8; максимальная абсорбция при 278 нм;

F10/ j4,1

ИК-спектроскопия (определение по тцбдет квм в смеси с $99),.

434662

22 (а) о = — 10,3 0,3, (а) о = — 17,7+0,3 .

Активность продукта на различные вещест5 ва приведена ниже:

Активность (УК(г) Вещество

Казеин азо-Кззеин

Желатин

Реакция

Протеолиз

7,000

15000

1000

Сгусток бычьего фибрина

Сгусток плазмы кролика

Сгусток плазмы сабаки

2500

Фибринолиз

200000

ВАЕЕ

АТЕЕ

500

Эстеролиз

П р и м ер 3. 22,8 г продукта, полученного при условиях по примеру 1 с активностью

2400 УК/г, добавляют в 480 смз дистиллированной воды; рН раствора равен 7,4. Последующие операции проводятся при температу- 10 ре +4 С.

Раствор наносят сверху целлюлозной колонны диаметром 15 см, содержащей целлюлозу, импрегнированную дистиллированной водой на высоте 17 см. Оптическую плотность 15 элюата измеряют непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграмма представляет собой асимметричный пик, содержащий энзим, в то время как следы диамино-6,9-этокси-2-акридина, содержа- 20 щегося в продукте, остаются на целлюлозе.

Элюат, соответствующий абсорбируюшим фракциям, собирают (например, 6,9 л) и концентрируют при температуре, не превышающей 25 С, при давлении 2 мм рт. ст. до 25

480 смз

475 смз предыдущего концентрата разбавляют 205 смз изопропанола, охлажденного до — 10 С, и полученный раствор наносят сверху колонны из целлюлозы, импрегнированной 30 смесью изопропанола и воды, содержащей

30 об. /О спирта. Колонна диаметром 15 см содержит 600 г сухой целлюлозы (высота целлюлозы 7 см). Добавляют ту же смесь из расчета 450 см /час и измеряют непрерывно 35 оптическую плотность элюата на 280 нм.

Элюат собирают фракциями по 20 смз. Полученная диаграмма представляет собой асимметрические пики. После прохождения второго пика (около 10 л элюата) пропорция во- 40 ды линейно возрастает до 100 /о в смеси (общий объем элюента с градиентом композиции примерно 22,5 л), затем разбавляют дистиллированной водой до получения фракций, поглощающих не более 280 нм (например, около 45

16 л). Последний абсорбирующий пик, разбавленный водой, находится между фракциями 950 и 1150.

Эти фракции собирают (примерно 1,6 л), концентрируют при давлении 2 мм рт, ст, до 50 объемд 150 см, затем сушат лиофильно, 21

Ниже даются основные полосы ИК-абсорбции для продукта.

Вращательная способность: определение по раствору концентрацией 0,5 /О в воде;

Таким образом, получают 4,5 г продукта с активностью 6400 УК/г и содержащего по электрофоретическому анализу около 60О/о активного фактора. 1,5 г продукта, полученного при вышеописанных условиях и с

6400 УК/r, растворяют в 15 смз раствора хлорида натрия 2 10 — 4М, охлажденного до +4 С.

Раствор наносят сверху колонны биогеля

P 60, диаметром 7.5 см, уравновешенной тем же растворителем при +4 С и содержащей набухший гель на высоте 122 см (что соответствует примерно 280 г сухого геля). Элюируют тем же растворителем из расчета

120 смз/час. Элюат собирают фракциями примерно по 35 смз и измеряют его оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграмма представляет собой симметричный пик с выступом в основной части при начале элюирования, что доказывает наличие абсорбирующей примеси.

Абсорбирующие фракции соединяют, удаляя примеси соответствующие элюированной до элюирования основного проди кта, т. е. фракции 65 — 80 (например 580 см ); концентрируют при давлении 2 мм рт. ст. до объема

100 см и лиофилизируют.

Таким образом, получают 387 г продукта с активностью 11 000 УК(r и содержащего по электрофоретическому анализу только белковый препарат (более 95 /и активного фактора).

Предмет изобретения

Способ получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов, на питательной среде, содержащей источник.. углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из полученной культуральной жидкости, отличающийй си тем, что, с целью повышения активности Фермента. в качестве продуцента используют Streptomyce venetus DS 24388 (ЩЯ1 3987), 434662 мк 25

О2

500 см зааа

2ааа

/5ОО

Фиг.1 ааа пааааа 00000 таа

)оаа

m0 ое

О,В

1,5

ОООО

° 22750 ЯР

+ рипсин о Химал рипсин

6 7 8 1 1Р

/5 20 50 5О

434662

15 20 50 50 ) а Я а а,z

0,4

,0

1,5

i)000

2000

Ы00

Составитель T. Полянская

Редактор Л. Герасимова

Техред P. Юсипова

Корректоры: А. Николаева и Л. Корогод

Заказ 33! 1)3 Изд. М 1828 Тираж 456 Подписное

LlÍÈÈÏÈ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 мк

1заа

Фиг. 5

Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента Способ получения фибринолитическогофермента 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в фармацевтической промышленности для очистки смесей природного происхождения, содержащих плазминоген и фибриноген, от плазминогена

Изобретение относится к получению высокоочищенных высокоактивных ферментных препаратов-активаторов плазминогена, которые могут быть использованы в биохимии и медицине

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения плазминогена или плазмина
Наверх