Способ получения (-) (цис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты(фосфономицина)

 

ОП ИСАЙ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (и) 446977

Ооез Советских

Социалистических

Республик

К йАТЕИТУ (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 12d 9!14 (22) Заявлено 25.10.68 (21) 1281148/31-16 (32) Приоритет — (31) (33) США

Опубликовано 15.10.74. Бюллетень № 38

Государственный комитет

Совета в1инистров СССР (53) УДК 615.779.931 (088.8) по делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 11.11.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дэвид Хендлин и Эдвард Олли Стейпли (США), Джусто Мартинес Мата и Саграрио Мокалес Дел Вал (Испания) Иностранная фирма

«Мерк энд Ко, ИНК» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (— ) (Ц И С-1,2-Э ПО КС И П Р О П ИЛ )<1>ОСФОНОВОИ КИСЛОТЫ (ФОСФОНОМИЦИ НА) Н Н О

ОН

Н,С вЂ” С вЂ” С вЂ” Р

4 ОН

20

Изобретение относится к производству антибиотиков, Предложенный способ получения (— ) (цис1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты (фосфономицина), ранее в патентной литературе 5 не описанный, заключается в том, что культуру — продуцент вида Streptomyces fradiae или

Streptomyces viridochromogenes или Streptomyces wedmorensis выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники уг- 10 лерода, азота и минеральные соли при

25 — 38 С и рН 5,5 — 7,5 с последующим выделением целевого продукта известными приемами.

Предлагаемый антибиотик, представляет 1 собой l-цис-1,2-эпокси- l-пропилфосфоновую кислоту формулы

Это кислое вещество, которое более точно можно назвать (— ) (цис-l,2-эпоксипропил) - 25 фосфоновая кислота в соответствии с употребляемой в настоящее время номенклатурой; (— ) указывает, как и буква 1, что это фосфоновая кислота вращает поляризованный свет в направлении против часовой стрелки (влево по отношению к наблюдателю) при измерении ее двунатриевой соли в воде (концентрация

5%) при 405 ммк.

Свободная кислота в кристаллической форме представляет собой белый кристаллический порошок с т, пл. выше 94 C при помещении в баню с такой или более высокой температурой. (— ) (цис - 1,2 - эпоксипропил)-фосфоновая кислота и ее соли являются ценными противомикробными агентами, ингибирующими рост как грам-положительных, так и грам-отрицательных патогенных бактерий. Этот антибиотик и особенно его соли являются активными против Bacillus, Escherichia, Staphylococci, Salmonella u Proteus патогенов и их устойчивых к антибиотикам штаммов. (— ) (цис - 1,2 - эпоксипропил)-фосфоновая кислота и ее соли могут применяться как антисептические препараты для удаления вредных микроорганизмов с фармацевтического, зубоврачебного и медицинского оборудования и других предметов, зараженных этими микробами. Они могут применяться и для выделения некоторых микроорганизмов из смесей микроорганизмов. Соли (— ) (цис-1,2446977

65 эпоксипропил) -фосфоновой кислоты могут также применяться для лечения заболеваний, вызванных б актер иальными инфекциями, у людей и животных. Они являются особенно ценными в этом отношении, так как они активны против патогенных стойких штаммов. Эти соли особенно ценные и потому, что их можно вводить через рот, но они могут быть введены и инъекциями.

Пример 1. Лиофилизированную культуру Srteptomyces fradiae МА-2898 (АТСС .21096) используют для инокулирования 50 мл стерилизованной среды следующего состава, г/л:

Дрожжевой экстракт 10

Глюкоза 10

Мдзо,.7Н,О 0,5

Фосфатный буфер " 2 мл

Дистиллированная вода Остальное

Инокулированную колбу помещают на роторную качалку при 220 об/мин и инкубируют

48 ч при 28 С. Из полученной культуральной жидкости берут 10 мл инокулума для инокулирования колбы Эрленмейера на 2 л, содержащей 500 мл стерилизованной среды такого же состава, как выше. Инокулированную колбу вновь помещают на качалку при

220 об/мин и инкубируют 48 ч при 28 С. Полученную культуральную жидкость используют для инокулирования ферментатора на

189,25 л из нержавеющей стали, содержащего 160 л, стерилизованной среды вышеуказанного состава. Инокулированную среду инкубируют при 28 С при перемешивании и подаче тока воздуха 0,8496 м /мин. Во время ферментации добавляют небольшое количество полигликоля с молекулярным весом

2000 для борьбы со вспениванием. Затем используют 25 л полученного ферментационного бульона для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали на 200 галл, содержащего 510 л стерильной среды следующего состава, г/л:

Молотый овес 20

Барда 10

Соевая мука 20

Цитрат натрия 2,0

Аскорбинат натрия 0,5

Дистиллированная вода Остальное.

До стерилизации рН ферментационной среды 6,5. Инокулированную среду инкубируют при перемешивании при 28 С с пропусканием воздуха 0,28317 м /мин в течение 3 дней.

Во время ферментации добавляют небольшое количество противовспенивающего вещества полигликоля с молекулярным весом 2000. Затем культуральную жидкость фильтруют через диатомную землю. 100 галлонов отфильтрованной культуральной жидкости с рН 7 пропускают через колонку, содержащую сильноосновную анионнообменную смолу типа четвертичного аммония на стирол-дивинилбен91 г КН Р04 и 95 г NaqHPO4 доводят до 1 л дистиллированной водой.

?О

?5

40 зольной матрице (Дауекс 1 к . 2). Смолу элюируют 3%-ным раствором хлористого аммония в 90 /о-ном метаноле, элюаты собирают фракциями по 2 галлона. Фракции 4, 5 и 6 содержат большее количество антибиотика. Фракции 4 и 5 раздельно упаривают при пониженном давлении для удаления метанола до концентрации около 200 мг/мл твердых веществ. Затем 275 мл концентрата фракции

5, содержащего 51 r твердых веществ, пропускают через 8,9 л специального полиакрилоамидного геля, давая разделиться, обессолиться и сконцентрироваться веществам с молекулярным весом от

200 до 2000. Сорбированное на геле вещество элюируют со скоростью 50 мл/мин водой при проверке элюата рефрактометром. Элюат выделяют фракциями, анализируют и соединяют активные фракции, в которых между 5600 и 6320 мл содержится 19,1 мг/мл твердых веществ с активностью 68 ед/мл по Proteus vi1garis на дисках и пластине. Это представляет (— ) (цис-1,2-эпоксипропил) -фосфоновую кислоту с активностью 3,6 ед/мг.

Аналогично получают четыре дополнительные хроматограммы с использованием порций по 275 и 287 мл концентрата фракции 5 и двух порций по 285 мл концентрата фракции 4. Активные фракции из всех пяти хроматограмм соединяют и упаривают при пониженном давлении до 100 мг/мл. 660 мл полученного концентрата имеет активность 4,1 ед/мг.

100 мл этого концентрата пропускают через колонку, содержащую 2480 мл сильно кислой катионнообменной смолы сульфонатного типа со стирол-дивинилбензольной матрицей в водородном цикле. Сорбированное вещество отмывают водой при расходе 19 мл/мин. Собирают фракции по 20,5 мл элюата, который проверяют записывающим рефрактометром.

Фракции 52 — 62 анализируют и соединяют для получения водного раствора антибиотика.

Аналогично еще 5 порций по 100 мл концентрата хроматографируют на сильно кислой смоле. Наиболее активные фракции полученного элюата соединяют с фракция ми 52 — 62 и получают всего 1870 мл. Этот водный раствор (— ) (цис-1,2-эпоксипропил) -фосфоновой кислоты имеет рН 6,8, общее содержание твердых веществ 2,9 мг/мл, активность 70 ед/мл.

Таким образом, активность натриевой соли антибиотика в этом водном растворе составляет 24 ед/мг.

Водный раствор затем упаривают при пониженном давлении и сушат вымораживанием с получением 4,7 r продукта.

Пример 2. Лиофилизованную культуру

Streptomyces viridochromogenes MA-2903 (МЯКИН -,3413) используют для инокулирования 50 мл среды следующего состава, г/л:

Дрожжевой экстракт 10

Глюкоза 10

MgS04 ° 7НиО 0,05

446977

Составитель С. Щенева

Техред Г. Дворина

Редактор Л. Тюрина

Корректор Л, Котова

Заказ 242378 Изд. № 1371 Тираж 456

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Фосфатный буффер ": 2 мл

Дистиллированная вода Ост ал ь н ое.

Инокулированную среду в колбе Эрленмейера на 250 мл инкубируют при 28 С в течение

3 дней на роторной качалке. Колбу с посевом первой генерации используют для инокуляции серии таких же колб. Посев второй генерации используют для инокуляции (с помощью 2,5 -ного инокулума) серии из 10 колб Эрленмейера на 2 л, содержащих по

350 мл среды следующего состава, г/л:

К2НР04 0,7

КН Р04 0,3

Цитрат натрия 2Н20 0,5

MgSO4 7НгО 0,1

Казаминовая кислота 2,0

Декстроза (стерилизованная отдельно) 10

Дистиллированная вода До требуемого объема.

Инокулированные колбы инкубируют при

28 С в течение 5 дней на роторной качалке при 145 об/мин.,Полученные в колбах культуральные жидкости соединяют, фильтруют и анализируют. Дальнейшую обработку ведут известным способом.

Пример 3. Лиофилизированную культуру Strep tomyces wedmorensis МА-3269 (МКК1 -3426) используют для инокулирования 50 мл стерильной среды из примера 2 в колбе на 250 мл. Инкулируют 3 дня при 28 С на роторной качалке при 220 об/мин, Полученный инокулум используют для инокулирования колб Эрленмейера на 250 мл, со" 91 г КН2Р04 и 95 r NaqHPO4 доводят до 1 л дистиллированной водой. держащих по 50 мл стерильной казеин-мясной среды следующего состава, г/л:

Гидролизат казеина (N — Z-амин) 2,5

Мясной экстракт 1,0

NaC1 5

Соевая мука 10

Барда 2

Кукурузная вымочка 5

Декстроза 20

К2НР04 2

CaCO ". 10

Дистиллированная вода До т ебуемог р о

15 объема.

Инокулированные колбы выращивают 4 дня при 28 С на роторной качалке при

220 об/мин. Полученную культуральную жидкость центрифугируют. Зона ингибирования

20 25 мм на бумажных дисках 7 мм по методике анализа по Proteus vulgaris МВ-838.

Дальнейшую обработку ведут известными способами.

Предмет изобретения

Способ получения (†) (цис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты (фосфономицина), о тл и ч а ю шийся тем, что культуру — продуцент вида Streptomyces fradiae

3О или Streptomyces viridochromogenes, или

Streptomyces wedmorensis выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 25 — 38 С и рН 55 — 75 с последующим выделением целевого продукта известными приемами.

Добавляют после доведения рН до 7