Способ получения человеческого адренокортикотропного гормона или его фрагментов

 

О П И Е п! 483827

ИЗОБРЕТЕНИЯ

РеВл1!блик

К ГЗАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 07,09.67 (21) 1182412/23-4 (32) Приоритет 10.09.66 (31) Р 1-306

28.03.67 Р 1-317 (33) ВНР

Опубликовано 05.09.75. Бюллетень № ЗЗ (51) М. Кл. С 07с 103/52

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.964.4.07. .577.17.07 (088.8) Дата опубликования описания 26,05.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Жозо Брюкнер, Калман Меджирадски, Шандор Баюж, Лайош Кисфалуди, Миклош Лов, Золтан Паулау, Ласло Жпорни.

Георги Хайош и Жужанна Ланг (ВНР) Иностранная фирма

«Рихтер Гедеон Ведьежети Дьяр» (ВНР) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТОВ

Изобретение относится к способу получения

39-членного пептида, являющегося синтетическим аналогом человеческого адренокортикотропного гормона (АКТГ), а также 28- и 32членных пептидов — фрагментов АКТГ, которые могут найти широкое применение в медицине.

Известен способ получения многочленных пептидов, например 39-членного АКТГ свиньи, имеющего сходное, хотя и не идентичное строение с АКТГ человека, который состоит в том, что защищенный декапептид 1 — !0 конденсируют с защигцен ы нонакозапептидом

1! — 39 в присутствии дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента с последующим снятием защитных групп и выделением целевого продукта известными приемами. Для получения продукта с достаточно высоким выходом применяют трехкратный избыток декапептида 1 — 10 и 8-кратный избыток дициклогексилкарбодиимида. Конденсацию проводят при относительно высокой температуре (50 С) в течение длительного времени (90 — 100 час) .

Предлагается спосоо получения адренокортикотропного гормона человека, имеющего следующее строение:

Н - сер - тир-сер-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лизll 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал-тир - про-асп-ала-гли-глу-асп-глн-сер-ала22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

5 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН (1 — 39)

33 34 35 36 37 38 39 или его фрагментов со строением 1 — 28 и 1—

32 конденсацией защищенного тетрадекапептида 1 — 14 с защищенным пентакозапептидом

10 15 — 39 в присутствии двух конденсирующих агентов — дициклогексилкарбодиимида и пентахлорфенола — с последующим снятием защитных групп. При этом указанные пептиды берут в эквимолекулярном соотношении, ди15 циклогексилкарбодиимид — в двух- трехкратном молярном избытке, а пентахлорфенол— в 2 — 6-кратном молярном избытке. Реакцию ведут при комнатной температуре в течение

48 — 96 час.

20 Аналогично получают пептидные фрагменты

1 — 28 и 1 — 32, конденсируя исходный пептид

1 — 14 с пептидами 15 — 28 и 15 — 32 соответственно.

Применение пептида 1 — 14 в качестве аци25 лирующей компоненты реакции и дополнительное введение в реакционную среду пентахлорфенола позволяет получить новый продукт—

АКТГ человека — в мягких условиях. с высо-. ким выходом и в довольно чистом виде. Кро483827 защищенного АКТГ

50

Заказ 981/6

1," Тираж 529

ЦНИИПИ

Изд.

Подписное

Типография, пр. Сапуноаа, 2 ме того, предлагаемый способ обеспечивает минимальные затраты труднодоступных исход пых пептидов. Так, пептид 1 — 14 берут в соотношении 1: 1 к пептиду 15 — 39, в то время как в известном способе пептид 1 — 10 используют в трехкратном избытке по отношению к пептиду 11 — 39.

Пример 1. Синтез человека (1 — 39).

118 мг (0,06 ммоль) защищенного тетрадекапептида 1 — 14, 202 мг (0,055 ммоль) защищенного тригидрохлорида пентакозапептида

15 — 39, 38 мг (0,144 ммоль) пентахлорфенола и 30 мг (0,145 ммоль) дициклогексилкарбодиимида растворяют в 0,6 мл диметилформамида, содержащего 0,077 мл (0,055 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь оставляют на 4 дня при комнатной температуре и затем разбавляют эфиром, не содержащим перекисей. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Полученный продукт хроматографируют па колонке с силпкагелем в системе этилацетат — пиридин — муравьиная кислота — вода (60: 20: 6: 5,6). Фракции, содержащие основной продукт, собирают и высушивают. Выход защищечного нонатриаконтапептида 1 — 39 136 мг (44% от теории) .

Пример " . Снятие защитных групп и получение свободного ЛКТГ человека.

100 мг защигценного нонатриакоптапептида, полученного в примере 1, растворяют в 2 мл трифторуксусной KIIc. .îòû, полученный раствор выдерживают 15 мин и затем упаривают B вакууме. Остаток растворяют в 2 мл воды и снова упаривают. Зту операцию повторяют еще раз и сухой остаток растворяют в 5 мл воды.

Полученный раствор хроматографируют на колонке со смолой Лмберлит 1КА=400. Фракции, содержащие свободный ЛКТГ, собирают и лиофильно высушивают. Выход 80 мг (80% от теории) .

П р и и е р 3. Синтез фрагмента 1 — 28 ЛКТГ человека.

0,69 r (0,305 ммоль) защищенного тетрадекапептида 1- —;4, 0,69 г (0,305 .<моль) тригидрохлорида тетрадекапептидного эфира 15 — 28 и 0,48 г (1,8 ммоль) пептахлорфенола растворя1от в 2 мл диметилформамида, добавляют

0,124 г (0,06 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и оставляют на ночь при комнатной температуре. Далее реакционную смесь нейтрализуют раствором 0,3 мл (0,125 ммоль) триэтиламина в 1,5 мл диметилформамида и оставляют при комнатной температуре еще на сутки.

После этого смесь разбавляют эфиром, не содержащим перекисей, и выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат.

Полученный продукт (1,45 г) хроматографируют на колонке с силикагелем в смеси этилаце10

I5

40 тат — пиридинмуравьиная кислота — вода (60:

: 20: 6: 5,6) . Фракции, содержащие свободный октакозапептид 1 — 28, объединяют и упаривают. Выход 0,171 r (13% от теории), Снятие защитных групп проводят по примеру 2.

Лналогично получ..:от фрагмент 1--32.

Предмет изобретения

1. Способ получения человеческого адренокортикотропного гормона, имеющего строение

Н - сер - тир-сер-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лиз11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал - тир - npo-асп-ала-гли-глу.-acr>-глн-сер-ала22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН (1 — 39), или

33 34 35 36 37 38 39 его фрагментов 1 — 28 и 1 — 32, о т л и ч а юшийся тем, что защищенный пептид 1 — 14 конденсируют с одним из защищенных пептидов 15 — 39, 15 — 28 или 15 — 32 соответственно с последующим снятием защитных групп и выделениеМ целевого продукта известными приемами.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что указанные пептиды вводят в реакцию в эквимолекулярпых количествах.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конденсацию проводят при одновременном присутствии 2 — 3 молекулярных эквивалентов дициклогексилкарбодиимида и 2 — 6 молекулярных эквивалентов пентахлорфенола.

Приоритет по признакам

10.09.66 по признаку:

Способ получения фрагмента 1 — 28 кортикотропина общей формулы: сер - тир - сер - мет-глу-гис-фен-арг-три-гли-лизпро-вал-г..и-Я, где Q-лиз-лиз-арг-арг-про-валл из-в"..ë-тир-про-а си-гл и- ал а-глу.

28.03.67 по признаку:

Способ получения кортикотропина человека общей формулы:

Н-сер-тир-сер-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 лиз - про - вал-гли-лиз-лиз-арг-арг-про-вал-лиз11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 вал - тир - про-асп-ала-гли-глу-асп-глн-сер-ала22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 глу-ала-фен-про-лей-глу-фен-ОН

33 34 35 36 37 38 39 отличающийся тем, что защищенный пептид 1 — 14 конденсируют с защищенным пептидом 15 — 39 в присутствии карбодиимида и пентахлорфенола с последующим снятием защитных групп и выделением целевого продукта в свобсдчом виде или в виде соли, или комплекса известным способом.