Способ получения противовирусного комплекса

 

рр 4865I4

ОП И

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 13.09.73 (21) 1957518/28-13 (51) М. Кл. С 12d 13/00 (32) Приоритет 14.09.72 (31) 42694/72 (33) Великобритания

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Опубликовано 30.09.75. Бюллетень № 36 по делам изобретений (53) УДК 596.809.7 (088.8) и открытий

Дата опубликования описания 19.04.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дуглас Бродбент, Гарольд Джордж Хемминг и Барри Хесп (Великобритания) Иностранная фирма

«Империал Кемикал Индастриз Лимитед» (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к медицинской промышленности.

Способ получения противовирусного комплекса из культуры грибка штамма Sirodesmiшп diversum С. М. 1.102519 является новым и состоит в том, что культуру грибка штамма

Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешивающимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.

Штамм грибка Sirodesmium diversum (Кук), получаемый из Государственного микологического института, находящегося в

Ферри Лейн, Кью, Англия, по каталогу значится как С. М. 1.102519.

Культура хорошо произрастает на обычной микологической агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуется центральный участок спорообразующего мицелия, окруженный зоной гиф, которая может быть как воздушной, так и погруженной или первично погруженной. Эта зона неокрашена. Спорообразующая область обычно темно-коричневого цвета с несущими споры клетками, возникающими при росте на агаре или на воздухе. Рост может быть довольно энергичным, например, на солодовом агаре или неравномерным, например, на агаре Чапек — Докс.

5 Споры, образующиеся из ветвей конидиофор, видны в длинных, редко разветвленных цепях. Они представляют собой амероспоры и дидимоспоры (фрагмоспоры встречаются редко), развивающиеся от вершины к основанию.

1р Зрелые споры довольно толстые, но местами тонкие. Амероспоры шарообразные диаметром

10 (9 — 11) мм, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки 18 (15—

22) )(10 (9 — 15) мм.

15 Источником усвояемого углерода являются, например, многоатомные спирты — сахароза, глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углевода, например крахмал; природные или синтетические масла или жиры. Источник углерода содержится обычно в среде в количестве от 0,1 до 30 по весу.

Источниками усвояемого азота являются вещества органического или неорганического происхождения. Они могут быть в форме нитрата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата - Ф Ф ° .,,4 4%514

ОН

ХСН

ОНА СН

65 натрия, калия, кальция или аммония, тартрата аммония, сульфата аммония или фосфата аммония. Они могут быть также в форме аминокислоты, например глицина, в форме муки, например муки из семян хлопчатника, или жидкости моченой кукурузы, пептона, мочевины, дрожжевого экстракта или мясного экстракта. Можпо использовать смеси двух или более указанных выше веществ. Обычно источник азота содержится в среде в количестве

0,001 — 1,0%.

Среда содержит меньшие количества таких элементов, как фосфор (например, в виде первичного кислого фосфата калия или вторичного кислого фосфата аммония), магний (например, в виде сульфата или карбоната магния), сера (например, в виде сульфата) и калий (например, в виде хлорида или карбоната калия), и ничтожные количества, следы железа, марганца, цинка, молибдена или меди.

В качестве водной питательной среды используют среду под названием Чапек — Докс.

Выращивание ведут при температуре 15—

35 С, предпочтительно при — 25 С.

В качестве не смешивающегося с водой органического растворителя используют, например, хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир, из которых предпочтительным является хлороформ.

Антивирусный комплекс состоит из восьми соединений, обладающих способностью задерживать рост вирусов, Это — Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G и Н.

Сиродесмин А имеет структурную формулу1, где К, — ацетил, R2 — водород и Н=2:

Сиродесмин В имеет также структурную формулу 1, íî R> — ацетил, R2 — водород, а

Н=4; у Сиродесмина С К1 — ацетил, К2— водород, а Н=З.

При обработке комплекса, задерживающего рост вирусов, двуокисью серы образуется другое соединение, обладающее тем же свойством — Сиродесмин 1.

Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, Н и 1 имеют следующие характеристики.

Сиродесмин А

Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 12,8.

С201 26« «2 - 8$2

Вычислено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.

Масс-спектр. Отсутствует исходный ион, но имеется сильный пик при (М вЂ” S2)+. Найдено м/е 422, 1731; С20Н26К208, требует м/е 422, 1689. При обработке триметилсилилимидазо5

ЗО

4 лом (бензол, 60 С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное, в масс-спектре которого отсутствует исходный ион, но виден слабый пик. Соответствующие (М вЂ” СН8)+ при м/е 615, 1689; C8H89N208$2$12j требует 615, 1686.

Ацетилирование. При обработке уксусным ангидридом в пиридине в течение недели при температуре 22 С получается бис-ацетат с температурой плавления 186 — 189 С.

Найдено, %: С 50,5; Н 5,3; N 4,9.

С24Н30Х2010$2.

Вычислено, %: С 50,7; Н 5,2; N 4,9.

Наибольший пик масс-спектра (М вЂ” $2)+ при м/е 506, 1871, С24Н80Х20 0 требует м/е 506, 1901.

При обработке Сиродесмина А уксусным ангидридом в течение 1 час при температуре

22 С получается моноацетат.

Найдено, %: С 49,9; Н 5,3; N 5,3; S 11,7.

С22Н27Х209$2.

Вычислено, %: С 50,0; Н 5,2; N 5,2; S 12,1.

На масс-спектре виден небольшой пик для (М вЂ” S2)+ при м/е 496 и сильный пик для (М вЂ” S2)+ при м/е 464.

При гидролизе Сиродесмина Л 0,1 н. раствором НС! в метаноле получается дезацетилсиродесмин Л с температурой плавления

198 †2 С.

Найдено, %: С 48,4; Н 5,6; N 6,0; S 14,3.

С181 «24 2О7$2.

Вычислено, %: С 48,8; Н 5,6; N 6,3; S 14,4.

В масс-спектре отсутствует ион, но виден сильный пик для (М вЂ” S2)+ при м/е 380.

При обработке Сиродесмина Л трифенилфосфином в хлороформе получается моносульфид.

Найдено, %: С 52,7; Н 5,7; N 5,8; $7,1.

С201 I26N2O8.

Вычислено, %: С 52,9; Н 5,8; N 6,2; $7,0.

Молекулярный ион виден при и/е 454.

Сиродесмин В

Найдено, %; С 43,4; Н 4,9; N 4,9; $22,8.

С20Н26Х208$4.

Вычислено,%; С 43,6; Н 4,8; N 5,1; $23,3.

Масс-спектр: исходного иона не видно, но виден сильный пик для (М вЂ” $8)+ при м/е 422.

Спектр практически идентичен спектру Сиродесмина А.

При обработке бис-триметилсилилтрифторацетамидом (бензол, 50 С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное. На масс-спектре исходный ион отсутствует, но виден слабый пик, соответствующий (М вЂ” СН8)+ при м/е 647, 1445; С26Н39Х208$3$12 требует м/е

647, 1407.

Сиродесмин С

Найдено, %: С 46,3; Н 5,1; N 5,1; S 18,0.

C20H26N2O8S3.

Вычислено, %: С 463; Н 50; N 54; S 185.

Масс-спектр. Сильный пик, соответствующий (М вЂ” S8)+ при м/е 422.

Сиродесмин 0

Молекулярная формула С20Н26ЩЭ8$„где х=4, 486514

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S,-)+ при м/е 422.

Сиродесмин Е

Молекулярная формула С20Н26Ь408Ь„где х равен, вероятно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S,,-)+ при м/е 422.

Сиродесмин F

Молекулярная формула С20Н26И208S„где х равен, вероятно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S,)+ при м/е 422.

Сиродесмин G

Найдено, /0.. С 49,7; Н 5,4; N 5,7; S 12,6.

C20H26N2O8S2.

Вычислено, /0.. С 49,4; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S2)+ при м/е 422.

Гидролиз. При обработке Сиродесмина С

0 1 н, раствором НС1 в метаноле образуется дезацетилсиродесмин С; температура плавления 195 — 196,5 С.

Найдено, /0. С 48,4; Н 5,5; N 6,5; S 14,6.

С I8H24N2OIS2.

Вычислено, /0. С 48,8; Н 5,5; N 6,3; S 14,4.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S2)+ при м/e 380.

Ацетилирование. При обработке Сиродесмина С уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при комнатной температуре образуется бисацетат Сиродесмина С с температурой плавления 159 — 159,5 С.

Сиродесмин Н

Молекулярная формула C20H26N208S., Массспектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М вЂ” S,)+ при м/е 422.

Сиродесмин 1

Найдено, 0/0. С 49,8; Н 5,5; N 5,5.

С20Н26М20882.

Вычислено, 0/0. С 49,4; Н 5,4; N 5,8.

Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден си.пьный пик для (М вЂ” S)+ при м/е 422 и слабый пик для (М вЂ” S)+ при м/е 454.

Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, Н и 1 и их производные разделяются методом хроматографии в тонком слое на силикагеле.

Сиродесмины, кроме I, выделяют из комплекса, задерживающего рост вирусов, например, при сочетании колонной хроматографии и препаративной хроматографии в тонком слое.

Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, выделяемые из него Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, I, дезацетилпроизводные Сиродесминов А и G, моноацетат и моносульфид Сиродесмина А обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хозяина, в частности они обладают активностью в отношении реновирусов в присутствии эмбриональных легочных клеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.

Активность в отношении реновирусов измеряют следующим образом. Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обыч5

65 ным способом на минимальной специфической среде Игла с добавлением 10/0 телячьей сыворотки в стеклянных трубках при температуре

33 С. Восемь групп (по три в каждой) таких трубок обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде. содержащей

200, 50, 12,5, 3,1. 0,8, 0,2, 0.05 и 0,00 мг испытуемого соединения в 1 мл раствора. Инкубацию производят прп 33 С, и через 24 час в каждую трубку помещают доз риновируса, например, типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культупbI, вызывающей 500/0 инфекции.

После дополнительной пнкубации в течение

2 дней при 33 С каждую трубку исследуют визуально пля определения наличия цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединения, которая характеризуется цитопатическим эффектом на весь слой клеток, а также,пля определения наличия цитопатического эффекта. обусловленного ростом вируса и который является характерным, фокальным цитопатическим эффектом, легко отличимым от токсичности сое.пинсний. «Активной дозой» испытуемого соединения называется концентрация соединения, которая защищяе 500/0 клеток от цптопатического эффекта, вызываемого ростом вируса. «Токсичной дозой» называют концентрацию испытуемого соединения, которая обусловливает токсичность соединения . 500/0 кпеток культур, обработанных при такой концентрации соединения.

Комплекс и соединения задерживают рост реновируса типа 2 при концентрации, равной или меньшей 0.25 мгlмл, HO в то же впемя не оказывают заметного токсического эффекта на клетки ткани ку льтуры при дозах, в 10 раз бо,пьших наименьшей активной дозы.

Сиподесмин А вводили через нос самкам и сампям крыс в позе 0,25 мг/мл в день в течение 14 дней, Rce крысы выжили и после их смерти не было обнаружено никаких гистологических ненормальностей, При применении с целью достижения антивирусного эффекта в присутствии клеток хозяина комплекс пли соепинение павали хозяиHv в концентпяцип, близкой к концентрации вируса. от 0.003 до 0.25 мг/мл. Дон стимоппименение через нос или горло в дозах от 0.02 до 0.1 мг 3 — 6 раз в день. Для взрослых людей это эквивалентно дневной внутренней дозе от 2 до 20 мг.

Фармацевтические препараты могут быть изготовлены в Форме таблеток, лепешек, капсул. носовых капель, жидкостей для впрыскивания в нос или горло, аэрозолей или жидкостей для ингаляции; их можно приготовлять обычными способами с добавкой обычных индифферентных компонентов.

Предпочтительными являются композиции, обеспечивающие антивирусн ю концентрацию комплекса или соединения в тех органах хозяина, в которых обычно произрастают риновир сы. FIHTIpITMpp на слизистой оболочке носа или горла, при непосредственном нанесе486514

1,00 второстепенных нии па указанные места или косвенно путем образования достаточно высокой концентрации комплекса илп соединения в крови после приема внутрь.

К таким предпочтительным композициям для непосредственного нанесения (например, в форме лепешки, которая медленно растворяется во рту и смачивает рот и связанные с ним пути раствором активного ингредиента) относятся композиции для ингаляции носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединения в фармацевтически допустимой жидкости, котор ая при ингаляции отлагается в носовых проходах и горле, а также композиции для приема внутрь, например, таблетки.

Эти таблетки или лепешки содержат от

0,05 до 5 мг ангивирусного соединения; для профила ктики или лечения вирусной инфекции таблетки принимают от 3 до 6 раз в день.

СосТВВ для впрыскивания в нос или горло содержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединения в 1 мл раствора, и для профилактики или лечения риновирусной инфекции 0,1 мл такого раствора впрыскивают в нос ичи горло

3 — 6 раз в день.

Комплекс, соединения или композиции можно применять профилактически для людей, которые могут соприкасаться с носителями риновирусной инфекции.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (г):

Нитрат натрия 2,00

Первичньш кислый фосфат калия 1,00

Семиводный сульфат магния 0,50

Хлорид калия 0,50

Семиводный сульфат железа 0,01

Декстроза («Церелоза») 50,00

Дрожжевой экстракт («Оксоид») 1,00

Концентрат второстепенных элементов

Затем готовят концентрат элементов, содержащий (г):

Семиводный сульфат железа 1,00

Пятиводный сульфат меди 0,15

Семиводный сульфат цинка 1,00

Четырехводный сульфат марганца 0,10

Молибдат калия 0,10

Его растворяют в дистиллированной воде с добавлением концентрированной соляной кислоты в количестве, достаточном для получения прозрачного раствора, и разбавляют дистиллированной водой до 1 л.

К питательной среде добавляют 10н. раствор гидроокиси калия до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.

Sirodesmium diversum С.М. 1.102519 выращивают при 25 С в поверхностной культуре в

90 бутылках Томпсона, каждая из которых содержит 1 л питательной среды. Продукт сооирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН 6,5) экстрагируют толуолом (2 раза по 14 л) . Объединенные экстракты высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают при 60 С/20 мм. Остаток (7,1 г) промыб0 бб

8 вают петролейным эфиром (т. кип. 60 — 80 С, 4 раза по 25 мл), промывную воду отбрасывают и получают антивирусный комплекс.

Пример 2. Антивирусный комплекс двух опытов примера 1 объединяют (6,52 r) и разделяют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хроматографических колонках.

Через верх колонки добавляют экстракт в минимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3: 2), и колонку проявляют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет основания колонн.

Каждую колонку разрезают на шесть равных секций, объединяют равноценные секции двух колонн и элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) 3 раза по 500 мл.

При выпаривании растворителей получают

6 фракций; 1-я фракция наименее полярная и 6-я фракция наиболее полярная. Фракции

1 — 3 отбрасывают, фракция 4 содержит Сиродесмины А и С совместно с менее полярным продуктом, фракция 5 содержит Сиродесмины

А, В и С совместно с нежелательным продуктом; фракция 6 содержит Сиродесмины В совместно с основным продуктом.

Фракции 4 — 6 дополнительно разделяют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле G, F. Для проявления используют следующие смеси растворителей: 1 — этилацетат и толуол (2: 1), П вЂ” муравьиная кислота, метанол и хлороформ (1: 4: 95). Разделенные продукты выделяют при элюировании полос смесью этилацетата и метанола (97: 3).

При разделении хроматографией в тонком слое фракции 4 сухой колонки (780 мг, 8 пластин, растворитель I) получают фракцию (а)

92 мг (главным образом Сиродесмин А) и фракцию (б) 165 мг (главным образом Сиродесмины А и С). При дополнительном разделении фракции (а) тем же методом (одну пластину проявляют дважды, растворитель II) получают фракцию (в) (43 мг, Сиродесмин

А). При дополнительном разделении фракции (б) (2 пластины проявляют дважды, растворитель II) получают фракцию (г) (36,4 мг, Сиродесмин А и следы Сиродесмина С) и фракцию (д) (65 мг, Сиродесмин С. загрязненный следами Сиродесминов А и В).

При разделении тем же методсм фракции 5 сухой колонки (716 мг, 8 пластин, растворитель E) получают фракцию (е) (296 мг, главным образом Сиродесмины А и С). при дополнительном разделении которой (6 пластин, растворитель П) получают фракцию (ж) (63,4 мг, главным образом Сиродесмин А) и фракцию (з) (146 мг, главным образом Сиродесмин С) .

Фракции (г) и (ж) объединяют и дополнительно разделяют (2 пластины проявляют дважды, растворитель П) и получают фракцию (u) (37 мг, Сиродесмин Л) . Фракции (в) и (u) объединяют и растворяют в бензоле (2 мл), а затем по каплям добавля,от

486514

9 к перемешиваемому раствору для осаждения твердого Сиродесмина А (68 мг).

Фракцию (з) дополнительно разделяют (1 пластину проявляют дважды, растворитель I I) и получают фракцию (к) (68 мг, Сиродесмин

С, загрязненный небольшими следами Сиродесминов А и В). Фракции (д) и (к) объединяют, растворяют в этилацетате (2 мл) и выделяют твердый Сиродесмин С (60 мг) при осаждении петролейным эфиром.

При разделении тем же методом фракции 6 сухой колонки (6 пластин, растворитель II) получают фракцию (л) (193 мг, масло, Сиродесмин В ), из которой при обработке смесью бензола и петролейного эфира получают твердый Сиродесмин В (113 мг) .

Пример 3. Антивирусный комплекс (2,5 г), полученный из 90 л сброженного продукта, обрабатывают в безводном пиридине (50 мл) хлористым тионилом (5,0 мл) 15 мин при 0 С.

Затем добавляют к смеси льда с водой (500 мл) и выдерживают дополнительно

15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН 2 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 500 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (1,43 г), которое высушивают в «сухую колонку» силикагеля (430 r), приготовленную следующим образом: колбу емкостью 2 л. содержащую силикагель (1 кг, силикагель M.Г.С. фирмы Хопкин и

Виллиам) и воду (120 мл), вращают при комнатной температуре 2 час. Затем добавляют смесь этилацетата и толуола (2: 1) 112,5 мл, и колбу вращают еще 3 час. Колонку проявляют смесью винилацетата и толуола (2: 1) и разделяют на 9 частей, каждую из которых элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) — 3 раза по 500 мл. Фракции, содержащие Сиродесмин А, объединяют и разделяют методом хроматографии в тонком слое (силикагель С.F., этилацетат: толуол=2: 1) и получают чистый Сиродесмин А в виде масла (218 г).

Вторую партию промытого петролейным эфиром толуольного экстракта из 90 л перебродившего бульона обрабатывают таким же способом, и два образца Сиродесмина А (всего 505 мг1 объединяют и растворяют в бензоле (5 мл). Твердый Сиродесмин Л (358 мг) выпадает в осадок из раствора при добавлении по каплям петролейного эфира (т. кип.

60 — 80 С) .

Пример 4. Сиродесмин В (50 мг) в безводном пиридине (1,0 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,1 мг) в течение 12 мин при 0 С, добавляют смесь льда с водой (25 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2 н. сепной кислоты устанавливают рН 2 раствора, который затем экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют до получения масла (29,4 мг), состоящего в основном из Сиродесмина А, но содержащего .леды Сиродесминов В и С. Сырой продукт очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.F. (растворитель муравьиная кислота — метанол — хлороформ

1: 4: 95) и получают Сиродссмин Л в виде масла (12,5 мг).

П р имер 5. Сиродесмин С (50 мг) в безводном пиридине (0,1 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,01 мл) в течение 10 мин при O С, добавляют к смеси льда с водой

10 (5 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН4 и экстрагиру|от хлороформом (3 раза по

5 мл1. Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют и получают Сиродес15 мин А в виде масла (4,3 мг).

Пример 6. Проводят реакцию Сиродесмипа А (250 мг) с уксусным ангидридом (6,25 мл) в безводном пиридине при комнатной температуре в отсутствии света в течение

20 1 недели, а зятем реакционную массу обрабатывают водой (1,25 мл) в течение 1 час при температуре 5 С. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (4 раза по

25 50 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (280 мг), которое очищают на силикагеле методом хроматографии в тонком слое (растворитель муравьиная кислота — мета30 нол — хлороформ 1: 4: 95).

Полученный основной компонент дважды перекр исталлизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина А в форме игл светло-желз того цвета (127 мг 1; т. пл. 186 — 189 С.

Пример 7. Раствор Сиродесмина А (50 мг) и серы (15 мг) в пиридине (2 мл) выдержи вяют при комнатной температуре в темноте

24 час, а затем выпаривают досуха при тем40 пературе 35 С. Сиродесмины А, В и С получают при хроматографии — в тонком слое остатка (1 пластина силикагеля С.F., 40+20+

;",1 см, растворитель этилацетат — толуол

2: 1).

4„- Пример 8. Культуру, выращенную, как описано в примере 1. собирают через 28 дней и фильтрат (70 л) экстрагируют хлороформом (2 раза по 14 л), высушивают над безводным сульфатом натрия, выпаривают при пониженном давлении и получают антивирусный комплекс. Взболтав толуол, метанол, хлороформ и воду при объемном соотношении

9: 9 4: 4, получают двухфазную систему (верхчюю и нижнюю) . Полученный ранее комплекс (15 г) растворяют в нижней фазе (300 мл), и этот раствор, а затем две дополнительные порции (300 мл) нижней фазы взбалтывают с верхней фазой (2 раза по

100 мл). Объединенные нижние фазы (900 мл)

G0 выпаривают досуха и остаток растворяют в нижней фазе (100 мл) второй двухфазной системы, приготовленной при взбалтывании петролейного эфира (т. кип. 60 — 80 С), толуола, метанола и воды при объемном соотношенин 2: 3: 4: 1. Этот раствор и вторую пор486514

12 цию нижней фазы второй двухфазной системы (100 мл) взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл), и объединенные нижние фазы (200 мл) выпаривают досуха. Остаток (10 r) хроматографируют на дезактивном силикагеле (850 г), и элюированные фракции дополнительно очищают многократной хроматографиei в тонком слое на силикагеле С.F.

Пример 9. К раствору очищенного комплекса (11 г), полученного как описано в примере 8, при разделении растворителями в пиридине (30 мл), добавляют холодный раствор двуокиси серы в гиридине. После выдержки в течение /q час при комнатной температуре реакционную смесь выливают на лед и при добавлении 2 н. соляной кислоты (410 мл) устанавливают рН 2. Смесь экстрагируют хлороформом, экстракт промывают, высушивают и выпаривают. Получают остаток (8,9 г), который хроматографируют на дезактивном силикагеле.

Фракцию 2 очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле С.F., вначале применяя хлороформ — метанол — муравьиную кислоту (95; 4: 1) в качестве растворителя для выделения фракций с высоким и низким Rq.

Фракции с низким Rr дополнительно очищают хромотографией в тонком слое, применяя этилацетат — хлороформ (7: 3) в качестве растворителя, и получают Сиродесмин I.

Фракции с высоким R< очищают хроматографией в тонком слое с применением в ;.ачестве растворителей хлороформа — метанола— муравьиной кислоты (95: 4: 1), а затем толуол — метилацетат (1: 2) для получения Сиродесмина G.

Фракции 5 и 6 объединяют, хроматографируют на колонке дезактивированного силикагеля (288 г) хлороформом и получают Сиродесмин А.

Пример 10. Остаток из хлороформенного экстракта, описанный в примере 9, (4,46 г) растворяют в метаноле (400 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (4 мл), и раствор выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем этот раствор выпаривают до 35 мл и добавляют воду (35 мл). Смесь экстрагируют смесью петролейного эфира (т. кип. 60 — 80 С) и толуола (2: 3, 2 раза по

?0 мл). Экстракты и часть нерастворимого вещества отбрасывают. Остальную водную фазу экстрагируют хлороформом, хлороформ испаряют и остаток разделяют на равные части.

Одну часть (1,15 г) хроматографируют на дезактивированном силикагеле. Остаток 3 фракции перекристаллизовывают из ацетона и получают дезацетилсиродесмин А, т. пл.

199 — 201 С. Другие части сырого продукта кристаллизуют из ацетона и получают дезацетилсиродесмин с температурой плавления

198 †2 С.

П р им ер 11. К питательной среде, приготовленной, как описано в примере 1, добавляют гидроокись калия в виде 10 н. раствора до рН 5,6 и автоклавируют при давлении

0,7 кг/см 25 мин. Sirodesmium diversum

С. М. 1.102519 выращивают при температуре

25 С в конических колбах, содержащих по

5 150 мл среды, на вращающемся устройстве.

Через 4 дня 12 мл бульона используют для инокуляции дополнительного количества колб, содержащих такое же количество той же среды. Через 12 дней роста в указанных условиях

l0 собирают урожай. Установив рН 6,0, фильтрат (50 мл) дважды экстрагируют половинным объемом хлороформа. Объединенные экстракты выпаривают и получают антивирусный комплекс.

15 Пример 12. Sirodesmium diversum С. М.

1.102519 выращивают при температуре 25 С на вращающемся приспособлении; каждая колба содержит 1 л питательной среды, приготовленной, как описано в примере 11.

20 Через 3 дня 3 л бульона используют для инокуляции 30 л питательной среды следующего состава (г):

Глицерин 40,00

Нитрат натрия 2,21

Первичный кислый фосфат калия 5,00

Семиводный сульфат магния 1,00

Дистиллированная вода До 1,00 (л)

Питательную среду автоклавируют при давлении 1,05 кг/см в течение 25 мин, рН среды не устанавливают; рН стерилизованной среды — 4,9.

Среда содержится в стеклянном и из нержавеющей стали бродильном чане. В последний подают стерильный воздух со скоростью

15 л/мин, и содержимое перемешивают турбинной мешалкой со скоростью 380 об/мин без применения перегородок. При необходимости добавляют противовспениватель пропилея гликоль 750.

4О Через 15 дней устанавливают рН 6,0 (вме— сто бывшего 6.7), фильтрат бульона экстрагируют хлороформом, затем хлороформ испаряют и получают антивирусный комплекс.

Пример 13. Раствор Сиродесмина А

4 (0,083 г) в метаноле (100 мл), содержащий концентрированную соляную кислоту (1 мл), выдерживают в темноте при комнатной температуре 4 дня, а затем выпаривают досуха при температуре ниже 20 С. К остатку добавляют метанол, и раствор выпаривают до удаления следов НС1. Остаток очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле С.F., применяя хлороформ — метанол — муравьиную кислоту (95: 4: 1) в качестве растворителя, и

55 после перекристаллизации из смеси этилацетата и петролейного эфира получают дезацетилсиродесмин А с температурой плавления

198 †2 С.

Пример 14. Раствор Сиродесмина А (0,15 г) и трифенилфосфина (0,078 г) в хлороформе выдерживают 4 час при комнатной температуре и выпаривают досуха. Остаток очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.F., применяя хлороб5 форм — метанол — муравьиную кислоту в

20

500

Предмет изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Спиридонова Техред Т. Миронова

Корректоры. Е Рожкова и Л. Денискина

Заказ 674, 13 Изд. № 1874 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4(5

Типография, пр. Сапунова, 2 качес ве растворителя, и получают моносульфид Сиродссмина в форме геля. При осаждении его из раствора в этилацетате петролейным эфиром получают бесцветный порошок.

Пример 15. Сиродесмин С (0,1 г) растворяют в метаноле (100 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (1 мл), и раствор выдерживают в течение 3 дней при комнатной температуре в темноте. Остаток, полученный после отгонки растворителя, очища- 10 ют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.F., применяя метанол — хлороформ в качестве растворителя для проявления, и после перекристаллизации из ацетона получают дезацетилсиродесмин С с температурой 15 плавления 195 — 196,5 С.

Пример 16. Сиродесмин G (0,044 r) растворяют в смеси пиридина (2 мл) и уксусного ангидрида (1 мл), и раствор выдерживают в темноте при комнатной температуре 9 дней. 20

Затем раствор охлаждают на соленом льду, добавляют холодную воду (0,4 мл), и смесь выдерживают 4 час. После добавления 3 н. серной кислоты (60 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл), и объеди- 2о ненные экстракты промывают водой (50 мл), 5%-ным раствором бикарбоната натрия (2 ра-. за по 50 мл) и снова водой (50 мл). Органический слой выпаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этплацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина G; т. пл. 159 — 159,5 С.

П р им е р 17. Приготавливают раствор для пульверизации в полость носа, содержащий следующие компоненты (мг):

Сиродесмин А 6

Тимерозал 2

Метиловый эфир параоксибензойной кислоты 80

Пропиловый эфир параоксибензойной кислоты

Фосфат натрия

Динатриевая соль ЭДТК

Дистиллированная вода (без пирогенов) До 100 (мл) Способ получения противовирусного комплекса, отличающийся тем, что культуру грибка штамма Sirodesmium diversum С. М.

1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстр агируют фильтрат культуральной жидкости не смешивающимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.