Способ получения полипетидов, содержащих аспарагил- глициновую последовательность

 

Сава Советских

Социалистических (1) 565352

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 14.05.73 (21) 1924054/23-4

{51) Л1. Кл."- С 07С 103 52

С 07С 102, 00

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий (32) Приоритет 15.05.72 (31) Р1-465 (33) ВНР

Опубликовано 28.02.76. Бюллетень № 8 (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) Дата опубликования описания 29.06.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Лайош Кишфалудь, Миклош Лев, Иштван Ц1ен, Тамаш Сиртеш, Мария C. Шаркези, 1Иандор Вайюс, Андраш Туран, Рожа Беке, Аттила Юхас, Кальман Медзихрадски, Ласло Спорни и Ласло Граф (BHP) Иностранное предприятие

«Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр РТ» (BHP) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ

АС ПАРА ГИЛ ГЛ И ЦИ НОВУЮ ПОСЛ ЕДО ВАТЕЛЬ НОСТЬ

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения полипептидов, содержа|щих аспарагилглициновую последовательность, Предлагаемый способ может быть приме- 5 нен при синтезе большого числа важных природных полипептидов, содержащих вышеуказанную последовательность, а также для синтеза пе птидов, содержащих остатки аспарагина. 10

Известен способ .получения пептидов, содержащих аспарагилглигциновую последовательность, заключающийся в том, что N-защищенный пептид, содержащий на С-конце остаток аспарагина и С-защищенный пептид, содер- 15 жащий на N-конце остаток глицина, конденсируют методом активированных эфиров, используя в качестве активированного эфира и-нитрофениловый эфир.

Недостатком известного способа является 20 необходимость применения защиты для амидной группы аспарагина и наличие стооочных реакций, в результате которых происходит либо перегруппировка а-аспарагил-глицина в р-аспарагилглицин, либо образуется сукцини- 25 мидопроизводное, что приводит к очень низкому выходу целевого продукта (10% ) .

Недостатки устраняются путем использования в процессе создания пептидной связи в качестве активированного эфира пептафторфепилового эфира соответствующсго N-защищенного пептида.

Предлои:ен способ полу ения полипег.тпдов, содержащих аспарагинилглиц:.новую последовательность, путем конденсация соответствующих защищенных пептидов методом «итивирован ых эфиров и последующего отгцспления защитных групп, причем карбок : пая группа М-защищенного поптида а ктпвируется путем превра щения ее в пентарфорфс иловый эфир обработкой пептафторфепо,г . в присутствии N,N -дициклогсксилкарбодпи: гида и полученный активирова иный эфир коп -.с.:.сируют с С-защищенным пептпдом при эквпмолокулярном соотноше ип реагирующих веществ.

Использованные в примерах сокращения приняты Л1РАС вЂ” JUB. Кроме указанных сокращений введены следующие: пспользуc .tûé симгол указывает на часть последоватс..ьпости с числами и далее N-термтшальные и Стерминальные защитные группы. Защптптяе группы боковых цепей содержатся в действующем заглавном слове. Используются за505352 тем следующие сокращения: DCC-дициклогексилкарбодиимпд, PFPOH - пептафторфенол, РСРОН-пептахлорфенол, DCHA - дициклоге кснл а мин.

Определение темпeðàòyð плавления проводилось с помощью прибора доктора Tottoli

Bu eh).

Тонкослойная хроматография проводилась на силчкагеле на стали при использовании следующих систем растворителей.

1. Этилацетат — (пиридин — уксусная кислота — вода=20: 6:! 1) =95,5;

2. Этила етат — (пиридин — уксусная кислота — вода= — 20: 6: 11) =9,1;

3. Зтилацетат — (пиридин — уксусная кислота — вода= — 20: б: 11) =4: 1;

4. Этилацетат — (пиридин †уксусн кислота — вода=20: 6: 11) =3: 2;

5. Этилацетат — пиридин — уксусная кислота — вода = 240: 20: 6: 1 1; б. Этилацетат — пиридин — уксусная 1кислота — вода=120: 20: б: 11;

7. Этилацетат — пиридин — уксусная кислота — всда=бО: 20: 6: 11;

8. Зтилацетат — пиридип- †уксус сная кислота — вода=ЗО: 20: G: 11;

9. Этилацетат — пирндин — уксусная кислота — вода=480: 20: 6: 11;

10. Хлороформ — гексан — уксусная кислота=8: 1: 1;

11. Хлороформ — м ет а пол = 98: 2;

12. Хлороформ — |метанол=95: 5;

13. Хлороформ — метанол =9: 1;

14. Хлороформ — метанол = 85: 5;

15. и-Вутанол — пиридин — уксуснчя кислота — вода=30: 20: 6: 24;

16. Хлороформ — метанол — уксусная кислота=8: 1: 1, Для проявления применяется нингидрин и (или) хлор-, -толидин.

Пример 1. Синтез человеческого ACTHI зь

С т у п е н ь 1. L Arg (NO,) — Arg(NOq) Pro—

OPFP (е 17 19 OPFP)

3,26 г (5 ммоль) 1 — Arg(NO>) — Arg(NO>)—

PIo — ОН растворяют в 30 мл диметилформамида и к раствору добавляют 5,31 г (7 ммоль) DCC — PFPOH-комплекса. Реакционную смесь 5 час перемешивают при комнатной температjpe, затем отфильтровывают выпавший в осадок DCC и фильтрат упаривают до сухого остатка. Маслянистый остаток обрабатывают эфиром, отфильтровывают и промыва|от ";dIIIpoì. Сырой продукт растворяют в

11 мл тетрагидрофурана и высаживают с помощью 60;мл эфира. Выход 3,42 г (83,6%) — 17 — 19 — ОРГР; R 6 0,55.

С 1Нз601оИ 1Р5 (817,9) .

Вычислено, %: С 45,5; Н 4,4; N 18,8; F 11,6.

Найдено, % . .С 46,0; Н 4,7; N 18,7; F 11,8.

С т у п е н ь 2. 1 — Arg(NO ) — Arg(NO2)—

„— Val — Lys (ВОС) — Val — Tyr — (trBu) Pro—

ОН (L 17 — 24 — ОН).

2,22 r (2,92 ммоль) Н вЂ” Val — Lys (BOC)—

Val — Tyr — (trBu) — Pro — ОН суопендируют в

25 мл диметилформамида и при перемешивапии добавляют 1,64 r (3,22 ммоль) 1 — 17—

19 — OPFP.

Через 2,5 час получают прозрачный рас5 твор, который перемешивают еще 2,5 час и затем упаривают до сухого остатка, Остаток суспендируют в тетрагидрсфуране, отфильтроaûâãIoò и промывают тетрагидрофураном. Сырой продукт растворяют в 15 мл метанола и

10 высажигают с помощью 100 мл этила цетата.

Осадок отфильтровывают и сушат. Выход

3,55 г (87,2%) I — 17 — 24 — OH; R40,7.

С, Н99018М7 (1394,61) .

Бы нслено, %: С 55,1; Н 7,2; )) 17,1.

Найдено, oc, .С 55,0; Н 7,0; N 17,2.

Ступень 3. Н вЂ” Arg — Arg — Pro — Val—

I уз (ВОС) — Ча) — Туг (trBu) — Pro — ОН ЗНС1 (H — 17 — 24 — -ОН. ЗНС1) .

-30

36

4э

Г,.

0,4 г (0,29 смоль) 1 — 17 — 24 — ОН растворяют в 8 мл уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 0,1 r Pd/C. Прохождение реакции контролируют с помощью тонкослойной хромaroãðàôèè. По окончании реакции отфильтровывают катализатор и фильтрат выпаривают до сухого остатка. Маслянистый остаток растворяют в З.мл метанола и при охлаждении доводят рН до 4 с помощью НС1. 3атем раствор упарива ст до сухо го остатка, остаток суспендируют в этилацетате и отфильтровывaloT. Получают 0,26 г (70,2%) Н вЂ” 17—

24ОН 3HC). Р4 0 )

С т у п е н ь 4. L — Lys(ВОС) — Arg — Arg—

Pro — Ча) — )л з (ВОС) — Val — Tyr (trBu)—

Pro- — ОН 2НС1 (1 — 16 — 24 — ОН 2НС1).

0.65 " (0,49 ммоль) Н вЂ” 17 — 24 — ОН ЗНС1 суспендируют в 7 мл диметилформамида и ,.",обавляют 0,07,мл триэтиламина и 0,3 г (0,6 ммоль) I — Lys (ВОС) — ONP. Реа(кционцую смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 час и затем упаривают до су::.ого остатка. Остаток суспендируют в этилацетате, отфильтровывают и промывают небольшим количеством воды.

Выход 0,6 г (76,3%) 1 — 16 — 24 — ОН 2НС1;

Я4 045

С т у и е н ь 5. I — Lys (BOC) — Lys — (ВОС)—

Ar g — -Лго. — Pro — Val — Lys (ВОС) — Val—

Туr(trBu) — -Pro — ОН 2НСl (I — 15 — 24 — ОН. .0НС)).

0,5 г (0,3 ммоль) 1 — 16 — 24 — ОН.2НС1 растворяют в 20 мл метанола и гидрируют в присутствии Pd/С, По окончании реакции катализатор отфильтровывают и фильтрат уларивают до сухого остатка. Остаток обрабатывают этилацетатом, сушат в вакууме. Выход

0,42 г (97,3% ) Н вЂ” 16 — 24 — ОН. 2НС); R4 0,15

0,33 г (0,23 ммоль) этого продукта суопендируoT а 3 мл диметилформамида и смешивают с 0,14 г (0,25 ммоль) 1 — Lys (ВОС)—

OPFP. После 10-минутного перемешивания получают 1прозрачный раствор, который перемешивают еще 3 час и затем упаривают до с хсго остатка. Остаток растирают с этилаце505352

10 15

Составитель Л. Фонина

Техрсд Е. Подурушина

Редактор JI. Герасимова

1<орректо;> E.; ìåëåâà

Заказ 1162/12 Изд. № 1165 Тираж 576 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр, Сапунова, 2

aaxI м. Вь!хол 0,;6 г (85,4/о) 1 — 15 — 24 — ОН

2 Н С! Ã . 0 !;-1

С т у и е и ь 6. 1 — Lys(BOC) — Lys(BOC)—

Arg Arg- — Pro — Val — Lys (ВОС) — Val—

Туг (tBu) — Pro — Arg — Gly — А)а — Glu (OtrBu)—

Asp (OtBu) — Glu (OtrBu) — Ser (tBu) OtrBu .2HCl (1 — 15 — 31 — OtrBu 2НС1).

0,18,г (0,1 ммоль) L 15 — 24 — ОН 2НС1 и

0,10 г (О,l,ммоль) Н вЂ” 25 — 31 — OtrBu растворяют в 1 мл диметилформамида и к раствору добавляют 0 091 т (О 12 ммоль) DCC—

РГРОН-комплекса. Реакционную смесь перемешивают 5 час и затем разбавляют этилацетатом. Вы павший DCC отфильтровывя1от и фильтрат упаривают,до сухого остатка. Остаток растирают с эфиром. Получают 0,25 г

88 8о/в) L — 15 — 31 — OtrBu 2НСl; Я .0,5.

С т у и е н ь 7. Н вЂ” Ser — Туг — Ser — Met—

Glu — His — Phe — Arg — Trp — 61у — Lys — Pro—

Val — Gly — Lys — Arg Arg — Pro — Val — Lys—

Va1 — Tyr — P ro — Asп — 01у — Аl а — Gl у — As— р — Glu — Ser — ОН ЗСН,СОН (Н вЂ” 1 — 31 — ОН. 3НСЗСООН) .

3,0 г (0,647 ммоль) ВОС 1 — 31 — OtrBu

3HCl растворяют в смеси трифторуксусной кислоты, волы и анизола в соотношении 8: 1:

: 1 и раствор в течение 1 «ас перемешивают при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают и .промывают эфиром.

Полученный трифторацетат (2,89 г) растворяют в воде и раствор фильтруют через колонну Dowex 1+8 (ацетатная форма). После ионообмена раствор наносят на колонку, заполненную 500 мл СМ 23 и выделяют целевой продукт градиентным элюированием.

Фракции, содержащие желаемое вещество, объединяются и лиофилизируются. Выход

1,64 r (70 /о) хроматографичеаки однородного, биологически полностью а ктивного Н вЂ” 1—

31 — ОН.

Аминокислотный анализ. 1.уз 4,08 (4); HIS

1,0 (1); Arg 2,94 (3); Asp 2,01 (2); Met 0,78 (1); Ser 2,78 (3); Glu 3,07 (3); Pro 2,86 (3);

Gly 2,97 (3); Ala 1,09 (1); Val 2,96 (3); Туг

2,1 (2); Phe 1,09 (1), Формула изобретения

Способ получения полипептилов, содержащих яспаратилглициновую последовательность, общей формулы

Ser — Туг — Ser — Met — G1u — His — Phe — Arg — Trp — Gly — Lys — P ro— — Va 1 — Gly — Lys — Lys — Arg — Ага†— Pro — Val — Lys — Val — Туг — Pro— — Asn — G 1 y — А l а — G I u — A sp — G l y —— Я гд A имеет значения:

a) S.ã — ОН; б) S er — А l а — 01-1;

c) Ser — Аlа — Glu — ОН; д) Ser — Аlя — Glu — Ala — ОН; е) Ser — Ala — Glu — Аlа — Phc — ОН; ф) Ser — Аlа — Glu — А!а — Phe — — Pro— — 0H; г) Ser — Ala — Glu — Ala — Phe — Pro— — Leu — OH; ж) Ser — Аlа — Glu — Ala — Phe — Pro— — — Leu — Glu — ОН; и) Ser — Аlа — Glu — Аlа — Phe — Pro— — Leu — Glu — Phe — ОН; путем конденсации соответствующих,защищснных пептидов методом активированных эфиров, последующего отщепле::.пя защитных групп и выделения целевого продукта в свободном виде или в виде соли, или в виде комп"";åêñà известным способом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью, повышения выхода целевого,продукта, карбокспльную труппу

N-защищенного псптила а тивируют путем превращения ее 3 пентафторфени IOBIIA эфир обработкой пентяфто! фснолом в присутствии

N,N -лициклсгексил1кapáoäèèìIIëa при 0 — 20 С и полученный яктивированный эфир копдеп ируют с С-защищенным пептидом при эквимолекулярном соотношении реагирующих веществ.

2. Способ по п. 1, отлич аю.щийся тем, что к реакционной смеси, содержащей соответствующие N- и С-защпщеннь|е пептилы, добавляют раздельно пентафторфенол п дициклогексилкярбодиимид.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к реакционной смеси, содержащей соответствующие N- и С-защищенные пептилы, добавляют комплекс, состоящий из пентяфторфенола и IU,IU -дициклогексилакарболипмила.

4. Способ по п п. 1 — 3, отл ич я ющи йс я тем, что остаток аспарагпна в rponecce всего синтеза находится в свободной каросксамилной форме.

5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что конденсацию N-защищенного пептида, содержащего на С.конце остаток аспарагина с С-защищенньгм чепти„ом, содержащем на N-конце остаток глпциня, проводят прн температуре 0 — 4 С.

6. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что пептилы, которые солержат аспарагин со свободной карбоксильной группой, ацилпруют с помощью выдесленисго пентяфторфенилово го эфира трипептпла 1 — Аго (ХОз)— — Arg (КОз) — Pro — ОН.