Перхлорат 1,3-диметил-5-ацетоксибен-зимидазолия как субсрат ферментов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 509596 (61) Дополнительное к авт, свид-ву— (22) Заввлеио 29.05-74 (21) 2930483/23.4 е присоединением .лавки,!! ив (23) приоритето†(53) N. Кл. С 070 235/04

С 076 7/02

1асударстаа!!ной иаиитет йвата Иинистрав NN па далин иаааратаний и атирьпий (43) О!!!у -Яккэввв" "" " 04 Д 6&!!т етевт,% 13 (53) УДК 547 781 785 (088.8) (45) Дата овубяиковаиии оиисакнв О4.06.76 (72) Авторы изобретении

В. И., Вакуленко, К., В. Векслер, В. Г. Жуковский. Л. П. Кузнецова, Г. Ы. Трахнова и H. Г. Чернова (71) Заявитель

{54) ПЕРХДОРЛТ 1,3-ДИМЕТИЛ-5-ЛЦ ЕТОКСИБЕНЗИМИДАЗОАИЯ

КЛК СУБСГРЛТ ФЕРМЕНТОВ

Ci04

Изобретение относится к производству бензимидазола, которое можно использовать в ка- честве флуорогенного субстрата холи»эстераз.

Известно применение в качестве флуорогенных субстратов холинэстераз сложных эфирсв различных оксисоединений.

Однако избирательными субстратами холин- эстераз являются только те вещества, молекулы которых содержат катионный центр, как это имеет место у природного субстрата холинэстераз-ацетилхолина. Лучшим флуороген- ным субстратом этого типа является 1-метил-

-7-ацетоксихинолиний (субстрат 1!.

Недостатками известного субстрата 1 являются высокая скорость спонтанного га<дролиза (ни аая гидролитнческая стойкость), относительно сложные методы получения !ромежуточиого продукта B синтезе субстрата 1 !7-оксихиноли !!!!, котора!е включают трудноконтролиоу(!к! j сакц!!ю hp<)у lhl, К1!оме того для про!!!. д".!!!!3! . т!!, (:и!и!- .зов !юсбход!!."!о игпольч)!!. т; ° л!!(< < з". !1!аль!(ю !!1!!

2 ты под давлением, либо относительно дефицит, ное и дорогое сырье — м-анизидин, Целью изобрете!сия является создание флуорогенных субстратов для определения каталитической активности ферметов, например холинэстераз, более устойчивых к спонтанному гидролизу, чем субстрат 1, и синтезируемых ! более простым путем, чем этот субстрат.

Поставленная цель достигается применением

19 в качестве флуорогенного субстрата перхлората 1„3-дни>етил-5-ацетоксибензимидазолия фор- му лы с;(1r -<-1(>

Формула изобретения

Н,СО10

} сн как субстрат ферь(нтов.

Составитель 1.)жукова

Редактор З.Горбунова Техред A.Камышникова Корректор T,Ïoëùõîâcxàû

Изд. М Я »

Заказ 54Я

Тн раж," 29

Е(НИИПИ Государственного комитета Совета Ив<<ветров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 113035, Раушекав наб, 4

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з

ИСХОДНЫМ ВЕ!!Н (Т!ЭОМ ll (.ИНТСЗ(! ПР< ;(,!!!! <<с!к!О го субстрата является менее дефицитныи, ч<.ы м-анизидин, и б лее дешевый - п-анизидин.

Промежуточные продукты в синтезе предлагао. мого флуорогенного субстрата (1-нлкил-5-оксибен.эимидазолы) получают простым способом, который требует специальной. аппаратуры и не включает трудно контролируемых реакций, Предлагаемое соединение получают общеиз- вестным способом, а именно соль 1,3-диметил10

-5-бксибензимидазолия!Обрабатывак!т ..нгидридо . или галоидангидридом карбоновой кисло-(ГЫ. I

Пример. К раствору 5 г (0,03 моль)

1-метил-5-оксибензимидазола- в 150 мл диметил- 15 формамида приливают 7,5 мл диметилсульфата и реакционную смесь нагревают при. 120-13ÎОС

4 час, Затем отгоняют в вакууме раствори-.тель, остаток рас гворяют в 50 мл воды и добавляют 2,5 мл хлорной кислоты. На холоду выпадают белые кристаллы перхлората

1,3-диметил-5-оксибензимидазолия. Выход 6,6 г (72%); т. пл. 172-173ОС (спирт). Спектр флуоросценции (вода): Я,акс возоуждения 303 нм, 25

/, флуоресценции 480 нм.

5 г перхлората 1,3*диметил-5-оксибензимидазолия в 70 мл уксусного ангидрида нагрева-

<(п 2 час на водяной бане, раствор охлаждают ЗО перхлорат 1,3-диметил-5-ацетоксибензимидазолия (субстрат 2) осаждают эфиром. Выход 40 r (70 ) т. пл. 200-201ОС (очищают переосаждени м из уксусного ангидрида эфирам).

Найдено,",, . С 43,3; Н 4,3> . Cl 11,3; N 9,4;

11Н13 2О6

Вычислено, %: С 43,2; Н 4,3; Cl 11,6; N 9,2.

Спектр флуоресценции: X макс возбуждения

260 «м, (,„ флуоресценции 340 нм.

Предлагаемый субстрат 2 превосходит изве- стный субстрат 1 по устойчивости к спонтан, ному гидролизу, проводимому в течение 1час при 50ОС в буферном растваре (рН 7,5) при

45 исходной концентрации субстрата 1,10-4М, что видно иэ следующих данных количество гид- роли !Она ни Ого <:уо< тратl! 1 «:

1! р и M е р. Исполь Гаванне предлог<и мого субстрата для определения каталитиче<:кой ак- тишкэс; и фермента — холинэстеразы.

В термостатированную прн 25ОС кварцевую кювету (толщина внутреннего слоя 1 см);!риливают и переыешип(!ют 0,6 мл фосфатного буферного ра<:твора (1/15 11, рН 7,5), 0,3 мл

1<т1 раствора хлористого калия, 0,3 мл рас ;вора фермента — холинэстеразы и 1,5 мл п( ды (или водного раствора эффект;ра: активатОра или ингибитора). Затем смесь инк„оируют в течение зада!а!Ого времени и добавляют 0,3 ылк 10 3

Так, свежеприготовленный вод!;(!й раствор субстрата 2 можно использовать в течение всего рабочего дня (не менее 6 час), а раствор субстрата 1 уже через 2-3 час не пригоден

ДЛЯ ТОЧНЫХ ИЗМЕРЕНИЙ фЕРМЕНтатнвзсой аКТИВности. Значительный спонтан!!ый гидролиэ субстрата 1 вызывает постоян<<ое монотонное изменение фона флуоресценции, что снижает точность аналитического определения активнссти фермента.

Перхлорат 1,3-диметил-б-ацетоксибензимидазолия формулы