Способ получения инсулина

 

пи 552972

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополиитсльиое к авт. свид-ву (22) Заявлено 12.08.75 (21) 2165298/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 05.04,77. Бюллетень № 13

Дата опубликования описания 26.04.77 (51) М. Кл е А 61К 35/46

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений (53) УДК 615.361.37 (088.8) и открытий (72) Авторы изобрстсния

С. И. Шварц, P. И. Каратеева, О. И. Огарева, А. Б. Замиховский, Е. Б. Нестерчук, В. М. Шведова, Г. К. Фролова и В. М. Царенков

Всесоюзный научно-исследовательский институт технологии кровезаменителей и гормональных препаратов (71) Заявитсль (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно, к получению препаратов антидиабетического действия.

Известен способ получения инсулина путем водно-спиртовой экстракции поджелудочной железы с последующей сорбцией необезбелоченного экстракта на макропористых сульфокатионитах, промывкой спиртом, уксусно-аммонийным раствором, десорбцией соляно-аммонийным буферным раствором и выделением инсулина из элюатов известными приемами.

Известен также способ получения путем водно-спиртовой экстракции поджелудочной железы, депротеинизации инсулинсодержащих экстрактов с последующим выделением целевого продукта.

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода инсулина.

Целью изобретения является повышение выхода инсулина.

Это достигается тем, что полученный после депротеинизации водно-этанольный экстракт подвергают дополнительной депротеинизации при рН 3,6 — 4,2 и охлаждению, при этом дополнительную депротеинизацию инсулинсодержащих экстрактов осуществляют раствором серной кислоты, или едким натром, или аммиаком при температуре 0 —:+6 С.

Способ осуществляют следующим образом.

Поджелудочную железу подвергают водноспиртовой экстракции известным способом, полученный водно-спиртовой экстракт депротеинизируют, после чего проводят дополнительную депротеинизацию, заключающуюся в обработке предварительно депротеинизирован5 ных экстрактов раствором кислоты или щелочи при рН 3,6 — 4,2 (преимущественно 3,6—

3,9) с одновременным охлаждением их до — 5 —:+10 С (преимущественно 0 —:+6 С) .

В результате дополнительной депротеиниза10 ции в экстрактах образуется осадок, который отделяют сепарированием или фильтрацией.

Выделение инсулина из экстрактов, прошедших дополнительную депротеинизацию, можно проводить с помощью концентрирования

15 его в вакууме (до 1 — 2,0% содержания спирта) с последующим высаливанием инсулинасырца или осаждением солями цинка, путем сорбции полученного экстракта на сульфокатионитах с последующей десорбцией инсу20 лина-сырца и очисткой его известными методами. Получают кристаллический инсулин с высоким выходом 3500 — 4500 МЕ/кг.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. К 5,2 л инсулинсодержащего

25 водно-этанольного экстракта с рН 2,8 — 3,1, полученного известным методом с применением ортофосфорной кислоты, прибавляют 55 мл

40%-ното раствора хлористого кальция, затем водным раствором аммиака или 20%-ным рас30 твором щелочи устанавливают рН 3,5 — 3,8.

После отделения осадка в экстракте водным

552972

65 раствором аммиака или щелочи устанавливают рН 4,7 — 5,1. Снова отделяют осадок и полученный экстракт подкисляют 20 /о-ным раствором серной кислоты до рН 3,7 — 3,9 и охлаждают до 0 —;+6 С. Через 2 — 3 час выделившийся осадок отделяют и экстракт пропускают через колонку 50 ;2 см, содержащую 150 r сульфокатионита КУ-23 30/100М, со скоростью

250 мл/час/см . По окончании сорбции смолу промывают 0,45 л 70 -ного спирта, 0,5 л 0,2М ацетатно-аммонийного раствора, доведенного ледяной уксусной кислотой до рН 5,1.

Десорбцию со смолы проводят 0,2М раствором хлористого аммония, доведенного водным аммиаком до рН 9,5 — 9,7 со скоростью

30 мл/час/см .

Элюат (150 мл) подкисляют 13 — 15 /О-ным раствором соляной кислоты до рН 2,5.

Если элюат мутный, его фильтруют.

К фильтрату прибавляют 45 мл ацетона и водным BivlMHBKOM устанавливают рН 4,2 — 4,5.

Через час осадок удаляют фильтрованием.

К фильтрату прибавляют 5 — 6 мл 10 /о-ного раствора уксуснокислого цинка и водным аммиаком устанавливают рН 5,9 — 6,0.

Смесь выдерживают 12 — 20 час при 10—

15 С, Осадок цинк-инсулина отделяют центрифугированием.

Кристаллизуют в водном растворе лимонной кислоты, содержащем ацетон, и получают

170 мг кристаллического инсулина с активностью 26,5 МЕ/мг, что в пересчете на 1 кг поджелудочной железы составляет 4505 МЕ.

П р и и ер 2. 26 л экстракта, полученного и депротеинизирова нного хлористым кальцием и щелочью, как в примере 1, подкисляют

20 /о-ным раствором серной кислоты до рН 3,5, упаривают в вакууме до содержания в нем спирта 20 — 30 /о. Экстракт отделяют от всплывшего жира декантацией, Вследствие концентрации экстракта за счет частичного удаления спирта значение рН самопроизвольно устанавливается 2,5 — 3,0.

Инсулинсодержащий водно-этанольный экстракт 20 /о -ным раствором щелочи или водным аммиаком подщелачивают до рН 3,6 — 3,8 и охлаждают до 0 —:+6 С. Через 2 — 3 час осадок отделяют, а экстракт пропускают через сульфокатионит КУ-23 30/100М и далее, как описано в примере 1.

Получают 800 мг кристаллического инсулина активностью 26 МЕ, что в пересчете на 1 кг поджелудочной железы составляет 4160 МЕ.

Пример 3. 5,2 л инсулинсодержащего водноэтанольного экстракта, полученного и обработанного хлористым кальцием, щелочью, кислотой и охлаждением, как описано в примере 1, концентрируют в вакууме до удаления спирта до 0 — 2 при температуре 27 С.

Нагревают до 42 С, охлаждают водой до

18 — 20 С, отделяют жир, фильтруют через кизельгур и высаливают 27О/о (к объему) хлористого натрия.

Повторное высаливание 18 /о -ного хлорис5

ЗО

4 того натрия н дальнейшую очистку инсулинасырца известными методами отделения проводят, как в прим ер е 1.

Получают 140 мг кристаллического инсулина с активностью 25 МЕ, что в пересчете на

1 кг поджелудочной железы составляет

3500 МЕ.

Пример 4. Экстракт, полученный и обработанный хлористым кальцием, как в примере 1, подщелачивают до рН 3,9 — 4,2 и охлаждают до 0 —:+6 С. После отделения осадка раствор пропускают через сульфокатионит КУ-23

30/100М и далее, как в примере 2, получают

159 мг кристаллического инсулина активностью 25 МЕ, что в пересчете на 1 кг поджелудочной железы составляет 3975 МЕ.

Пример 5. К 5,2 л инсулинсодержащего водно-этанольного экстракта с рН 2,8 — 3,1, полученного известным способом с применением смеси серной и соляной кислот, водным раствором аммиака или 20 /о-ной щелочи устанавливают рН 6,5 — 7,6, прибавляют 10,4 мл

10 /О-ного раствора ацетата цинка. Осадок отделяют. В экстракте устанавливают рН 3,7—

3,9, охлаждают до 0 —:+6=С. Осадок отделяют с кизельгуром. Экстракт разбавляют дистиллированной водой (1: 1), снова охлаждают до

0: +6 С, липиды отделяют фильтрацией с кизельгуром. В надосадочной жидкости устанавливают рН 5,3 — 5,4 и на 1 л добавляют 20 мл/л

10 /о -ного раствора ацетата цинка.

Осадок цинк-инсулина отделяют, обезжиривают спирто-эфирной смесью, высушивают, затем подвергают высаливанию хлористым натрием и очистке, как описано в примере 3.

Получают 146 мг кристаллического инсулина активностью 24 МЕ, что в пересчете на 1 кг поджелудочной железы составляет 3504 МЕ.

Предлагаемый способ позволяет значительно повысить выход инсулина от 2500—

3100 МЕ/кг до 3500 — 4500 ME/кг и получать стабильные (прозрачные) инсулинсодержащие экстракты, наиболее полно освобожденные от балластных примесей, Формула изобретения

1. Способ получения инсулина путем водноспиртовой экстракции поджелудочной железы, депротеинизации инсулинсодержащих экстрактов с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода инсулина, полученный после депротеинизации экстракт подвергают дополнительной депротеинизации при рН 3,6—

4,2 с одновременным охлаждением.

2. Способ по п. 1, отл ича ющийся тем, что дополнительную депротеинизацию инсулин — содержащих экстрактов осуществляют при температуре 0 —:+6 С.

3. Способ по п. 1, о тл и ч а ю щи и ся тем, что дополнительную депротеинизацию инсулинсодержащих экстрактов осуществляют раствором серной кислоты, или едким натром, или аммиаком.