Способ получения пептидов или их кислотно-аддитивных солей

 

» «»

» ° Щ

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 553929

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту(22) Заявлено27,03.74 (21) 2008489/04 (23) Приоритет - (32) 28.03.73 (31) 4454/73 (33) Швейцария (51) М. Кл.

С07С 103/52//

//А 61К 37/02

Государстаенный комитет

Соната Министреа СССР ао делам изобретений и открытий (43) Опубликовано05.04.77. Бюллетень № 13 (53) УДК 547.964.4.

,07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 16.07.77

Иностранцы

Бернхард Рииикер и Вернер Риттель (Швейцария) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

Циба-Гейги АГ." (Швейцария) - (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ

KHCIIOTHO ÙÄÈÒÈBHÜ1X СОЛЕЙ

»

Изобретение относится к способу получения новых гипокальцемически действующих цептидов и их производных, которые могут найти применение в медицине.

Основанный на известном способе получения пептидов путем снятия защитных групп, например ацидолизом или гидрированием Ц, предлагаемый способ пол„чения пеп-. тид в общей лы

3 4 5 6 78

R -Cfj-СО-Гли-Асн-ЛейСер-Тре-1Лис-Х9 10 11 12 13 14 15 16 17.

-Чей- Гли-Тре=Ти р-Тре-Глн-А сп-Фен-Асй18, 19 2021 22 23 24 25 26 И

Лиз-Фен-Гио-Тре-Фен-Про-Глй-".Гре-Ала27 28 29 30 31 32

-Иле-Гли-Ва,-Гли-Ала-Про - М Н л где R - водород или свободная йли ацилированная аминогруапа; Х - остаток 20 ь -метионина, L -валина, Ь -норвалина, лейцина, 4 -изолейцина, L -норлейцина или L - а -амнномасляной кислоты и аб где L -аланин заменен L -аспарагином и/или; -изолейцин заменен L -треони»

1 RP ном и где в соответствующем - случае одна аминокислота или несколько " аминокислот заменены в положениях 11, 12, 16, 19, 22 и 24 другой аминокислотой, а именно f, -треоиин

И

4 лизином L «тирозин Q. Йейцшому

1 -фенилаланин а

)„-лейпином, Ь

-фенилаланин - .4 -лейцином, 1, 19

-фенилаланин - j, - pQ3HHoM H is -глюи тамии I -аргинином, или их кислотно-адZ4 дитивных солей, заключается в том, что от соединения формулы 1, где R и Х имеют выщ указанные значения и L -алании, заменен

4 -аспарагином и/или 4 -изолейцин за2т менен L -треонннсм и где в соответству» ющем случае одна аминокислота или нес колько аминокислот заменены в положениях

11, 12, 16, 19, 22 и 24 вышеуказанны« ми аминокислотами, в которых по меньшей мере одна аминогруппа нли одна карбокснль ная группа защищена отщепляемой ацидолизом защитной группой, например тЕ -трет

-бутнлокснкарбонильной или 0-трет-бутидьной, отщепляют защитную группу или защитные группы с последующим выделением це553929

45 з леваго продукта известным способом в виде оснований или их кислотно-адди тивных солей.

B качестве защитных групп применяют известные при синтезе пептидов с длинными це5 пями защитные группы, которые можно лег ко отщеплятьй например, путем гидролиэа, восстановления, аминолиэа или гидрогенолиэа.

Во всех примерах, кроме специально оговоренных случаев, для тонкослойной хроматографии используют пластины из силикаге- ® ля 64 254 (фирмы Лтйес Bi efe6den ), Для тонкослойной хроматографии применяют системы трет амиловый спирт-изопропанол-вода, 51:21:28 (N 1), втор-бутанол-3

-abdal водный аммиак, 70:30 (% 2); н-бутаноп-ледяная уксусная кислота-вода, 75:

:7,5:21 (% 3); н-бутанол-ледяная уксусная кислот -вода, 67:10:23 (N 4); этилацетат

«пиридин-вода, 40:20:40 (N 5); этялацетатацетон-вода, 72:24:4 (N 6}; втор-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода, 67:

:10:23 (¹ 7); этилацетатпиридин-ледяная уксусная кислота-вода, 62:21:6:11 (¹ 8); н-бутанол-пиридин-ледяная уксусная кислота-вода, 42:24:4:30 (No 9); ледяная уксус- 5 ная кислота-метилэ тилкетон-муравьиная кислота-вода, 50:30:10:10 (% 10); этилацетатпиридин-вода, 49:24;27 (Ж 11); н-бутанол-пиридин-муравьиная кислота-вода, 44:24:2:20, (М 12); иэопропанол-25%-ный йо водный аммиак-вода, 70:10:20, (М 13); изоцропаноп-25%-ный водный аммиак-вода

85:5:10 (% 14)", хлороформ-метанол, 9:1 (И 15); хлороформ-метанол, 8:2 (l4 16); хлороформ-метанол, 7:3 (N 17). м

Сокращения, принятые в примерах:

Бок - третбутилоксикарбонил

Е - карбобензокси

ОтБу - сложный третбутиловый эфир

Онп - сложный и-нитрофениловый эфир.

Оме - сложный метиловый эфир

Осу — сложный оксисукцинимидовый эфир тБу - простой трет бутиловый эфир

Бмп - P -меркаптопропионип

ДМФА - диметил мамид.

П ри м е р 1. -Вне.рлн-Асн-Лей-Сер-Тре-Ци Мег-Пей Гл мТре-Тир-Тре-Гш

-Асп-Фен-Асн-Лиз-Фен-Гис-Тре-Фен-П ро-Глн-Тре-А си-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про2Ь 2и

-NH гидрохлорид. (Асн -Тре- -кальци- 5О тонйн М)., 50 мг Бок-Цис-Гли-А си-Лей-Сер-(тБу-1 ре-(еБ у-Ыи6-Мет 4)ей-Глн-Тре(еБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу )-Гйж-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиэ(Бок)-Фен-Гио-Тре(тБу)-Фен-Прс-Глн-Тре(rEy)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Прсг. NH растворяют нри 0 С в 1,2 мл 12 н, соляной,кислоты высокой чистоты (в течение 1-2 мин), продувают в течение короткого времени азотом, выдер- 60

4 живают 10 мин при 0 С, охлаждают сухим льдом, концентрируют в высоком вакууме, постепенно повышая температуру, до сиропообраэного сесте ния, растворяют в

2 мл воды, лиофилизируют, добавляют к остатку 2 мл воды, еще раз лиофилиэи- руют и получают аморфный водораствори-. мый порошок, Ц 0,45; Я 0,53;

И 0,39 (тойкослойная хроматография на целлюлозе фирмы iver ck Юа пе аД )

Тонкослойный электрофореэ (пластины иэ целлюлозы, рН 1,9, 16 в/см, 1,5 час)пройденное расстояние 3,7 см по направлению к катоду. Защищенный дотриаконтапептидамид получают, например, следующим образом. а) Z -Tpe (тБу)-Гли Оме

22,3г 2, -Тре(тБу)-Осу и 8,29г HC8$ Н-Гли Оме растворяют или суспендируют в

100 мл ДМФАй прибавляют 7;49 мл й»ме-. тилмор олинай перемешивают в течение дня при 22 С, упаривают досуха в вакууме, растворяют остаток в ацетоуксусном эфире, промывают последовательно 5%-ной лимонной кислотой, 5% ным бикарбонатом калия и водой, сушат над сульфатом натрия, упаривают досухай маслянистый от&ток выдерживают в течение ночи при 0 С и получают хроматографически однородный дипептид, т.пл.

48оМ, который используют без дополнитеш ной очистки и 0,77; R< . 0,70. б) Н»Тре(тБу)-Гли-Оме. НС

5,0 г Й -Тре(тБу)-Гли-Оме растворяют в 200 мл метанола и после прибавления

13,2 мл 1 н. соляной кислоты и 0,5 r

10%-ного палладин на угле гидрируют при поглощении углекислого газа до насыщения. Катализатор отфильтровывают, фильт» рат упаривают досуха и получают белую пену, Р 0,64; Rg, 0,41; Rf Ой42. в) 2 -Асн-Tpe(rby)-Гли-Оме

18,9 г Е «Асн-Онп и 12,5r Н-Тре(тБу)

-Гли-Оме НС1 растворяют в 95 мл ДМФА, прибавляют 4,6 мл N -метилморфолина, выдерживают 15 час при комнатной температуре„растворитель удаляют в высоком вакууме, остаток растирают,в сложном ук» сусном эфире, фильтруют, кристаллизуют из смесиметанол-хлороформ,- петролейный эфир и этанол - вода. Т. пл. 165 С, R

Ой68е Rg, 0,38; Rfç Ой70. г) Н-Асн-Тре(тБу)-Гли-Оме

8,5 r 2-Асн-Тре(тБу)-Глч-Оме гидрируют в 210 мл метанола в присутствии

10%-ного пелладия на угле и получают аморфную пену, т.пл. 60 С; Я 0,42;

R 0,27. д) K -Тре(тБу)-Аен-Тре(тБу)-Гли-Оме

Раствор 7,51 г 2 -Тре(тБу)-Осу и

5,55 г Н-Асн-Тре(тБу)-Гли-Оме в 50 мл

5539

ДМФА выд:-1>жцв. >к>т в т

° »о, (, уп»Г>ивакэг в высоком вдк улле qocyxa > pa<:тво1>я><>т <уст» г<>к в см" си сложный ух<.усный эфир — н-бутанол (1:.1 ), промыГ О> ва>от,>,. íîII лимонной кислотой, 5" ным бикарбонатом калия и водой, упаривают досуха и криста<ишзуют твердый остаток из смеси метанод- днэтиловый эфир, т.пп.

46оГ, К. 0,73; К, 0,75 ° е) II-Тре(тБ>у 1-Асн-Тре(тБу)-Гли-Оме

2,0 r 2. -Тре(тБу)-Асн-Тре(тБу)-ГлиОм» гидрируют известным способолл в 20 мл метанола до насьпцеппя и получают аморфный (пенистый) продукт> Rg 0 >41 °

R< 0,34. 15 з ж) 2. -Гпц-Тре(тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Ол1е

Раствор 5,33 r 11-Тре (тБу)-Лс> Тре. (тБу)-Гли-Оме и 4,95r g -Глн Онпв80мл

ДМФЛ выдермквают в течение ночи при ><>

22 С> прибавляют 500 мп воды, фильтруют при О С, сушат, взмучивают остаток в смеси ацетон — ацетонитрип (1:1) и отделяют кристаллический продукт, т.пл. 220 С; Г<>

0,65; Р „О >35; Rg, 0,58. 25 з) 2. -Глн-Тре(тГ>у)-Асн- ре(тЕ- у)-ГлиОН

6,42 г полученного выше сложного метилового эфира пентапентида растворяют при нагревании в 58 мл трифторэтано- 30 па, при колола тной температуре прибавляют 25 мл 1 н. едкого патра, пере.ллешивают 6 час при 22 С, добавляют о °

25 мл 1 н. соляной кислоты, концепт рируют до 50 ллл, фильтруют и промывают водой до полного удаления хлора,К 0,46;

R< 0,29. в и) Z -Гпн-Тре(тБу)-Асн-Тра(тБу)-Гли-Ваа-Гли-Апа-Про- Н H >

500 мг Х, -Глн-Тре (тБу)-А сн-Тре (тБу)- 4

-Гли-ОН, 335 мг H-Вап-Гли-Ала-Прсь- NH и 105 мг М-оксисукцинимида растворяют при нагревании в.4 мл ДМФА; добавляют

202 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 4 час при 40оС>разбавляют 100 45 мл диэтилового эфира и 100 мп петролейного эфира, отфильтровывают студень, рас вворяют его в смеси метанол - вода (85:15), осаждают днэтиловым эфиром и растворение и осаждение повторяют еше раз т.пп. 198- 50

199 С; Rf 0,41; Rf 0>50; Rg„0>35. й) Н-Глн-Тре(тБу)-А си-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гпи-Ала-Про- < <11

3,1 г синтезированного 2, -производного гидрируют в 120 ллл 80","-ного трифторэтанопа в присутствии 310 мг 10Тного паппадия на угле до насышения. Фипьтрат концентрируют до 5 мл, прибавляют 40 мл воды, выл<>1акц»аюг в течеш<е ночи при

ОоС и от<Ел<патрон»в:»<,< ><оп.<п<>пг>цl,, r. пп, 60

29

240 С (раз,ц)ф Я 0>20ф R 0,32>

0,18 ° к) Z Tpå(тБу)-Фен-Прс -Глн-Тре (тБу)А си- y1« (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-П ро- 1<ОН

51 7 мг L -Тре(тБу)-Фен-Про-ОН, 410 мг полученного нонапептида и 74 мг H-оксисукципимида растворяют или суспендируют при слабом нагревании в 4 мл смеси о трифторэтанол - хлороформ (6:4), при 22 С прибавляют 177 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 20 час, упаривают досуха, переосаждают остаток из смеси хлороформ-петролейный эфир и распределяют остаток по Крайгу в системе метанол-буфер- хлороформ-теграхлорметан (10: 3: 5:

: 4) (во всех примерах, кроме специально оговоренных, буфер состоит из 28,6 мл

>ледяной уксусной кислоты, 19,25 г ацетата аммония и 960 мл воды) с объемом фаз по 5 мп через 420 ступеней. Чистый додекапептид получают в виде аморфного о порошка, т.пл, 195 С (разл.), путем упаривания фракций ¹ 135-184 (г макс 160, К 0,61) досуха и удаления ацетата аммония сублимацией в высоком вакууме при

5оС Rl 0 44 R(0 51 Г 0,38.

f л) H- Tpe- (тГ>у)-Фен-Про-Глн-+Гре(тБу)-А сн-Тре(тБу)-Гпи-Вал-Гли-Ала-Про- N H>

504 мг синтезированного 7. -додекапеп тпда рас творяю т при нагревании в 30 мл ллетанопа, прибавляют 100 мг палпадия на угле, гидрируют известным образом, от депяют катализатор, упаривают фильтрат досуха и получают аморфный белый порошок, Rg 025, Rg 035; Rg, Оч20а м) 2, -Ас>л-Лпз(Бок)-Фен-Гис-Тре (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре-(тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гпи-A,ã"а-П рс NH 2

К раствору 479 мг 2, -Асн-Лиз (Бок)-Фен-Гис- NII NH в 4,5 мл ДМФА при

-20 С прибавляют 378 мл 3,2 н. раствора хлористого водорода в диоксане и 90 мл трет бутипнитрита, перемешивают .15 мин о при -10 С, прибавляют 410 мг Н-Тре (тБ у) -Фен-l I po-Глн-Тре (тБу) -А сн-Тре (тБу)-Гпи-Вал-Гли-Лла-Про- NH, растворенного в 6 мп ДМФА, и 2 60 мл этилдиизопропилаллина, выдерживают в течени ноо чи при 0 С, реакционную массу прибавляют по каплям к 100 мл диэтилового эфира, распределяют осадок по Крайгу в системе метанол- буфер- хлороформ- тетрахпорметан (10: 5: 10:5) через 200 ступеней с объемом фаз по 3 мл, фракции N - 18-37 (> w >

К 0,20; Р 0,58.

553929 н) НАсн- Низ{Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)—

Фен-Про-Гпн-Тре (тБу}-Асн-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Прс NH . ацетат „

270 мг вышеуказанного Ж -гексадекапептида гидрируют в 27 мп 80%-ной уксусн ой кислоты в присутствии 50 мг палладиа на угле в течение 2 часу отфильтровывают катализатор, концентриp)п(зт фильтрат ! до 3 мп и пиофт)лизи)зуют. Ь» 0„07;

R 0,28; В: „(0,65, )о

o) X Тре (тБу)-Тир (тБу) — ре (тБу).

Глн,Асп(ОТБу)-Фен Асн-Лиз (Бок) -Фен,-Гис-Тре (тБу)-Фен-Про-Глн -Тре (тБу)-А сн -Тре(тБу)-Гпи-Вал-Гпи-Апа-П po-- g Н - . )5

К» pàoòâopó 165 мг 7 — «ре(тБу)-Тир(тБУ)+

Тре (тБу )е ГпиАсп (О ГББу)фен ИН МН в 2 пйп

ДМФА при -20 С прибавляют 117 мл3,24н. раствора хлористого водорода в диоксане и

21 мл трет-бутилжттрита;- перемешивают 15 м и при -10 С, прибавпыот охлажденный до

О С раствор 198 мг Н-Асн=Лиз(Бок}-Фе4Гис-Тре (тБу)-Фене-П)зо-Гл;=.=Тре (тБу „-АснТ е(тБу)-Г).*и-Вал-Глн-Ала=Про- ИН2 (апетат) в 4 мл ДМФА и 80 мкл этилдиизопропи) амиьи, выдерх:.ивают в течение ночи при О С получетп)ътй аствор приливают по каплям K смеси 40 мп IIIIeTII)IoBGI o эфира и

20 мл петролейного эфира, распредел пот осадок но Кфайгу в системе метанол- буфер- о

«хлороформ етраху)(орметапр) (20: 5: 1),): 10} через 300 ступеней с объемом фаз по 3 мп, упаривают досуха, буфер удаля)от субпимаци(" при 40 С в высоком вакууме и получают yg хроматографически чисть-й аморфный порошок докозапептида, g . 0, »9; g О,ЗО,Rq, 0Ä48. и) Н аТре(тБу c= 1 ир(тБу) ) pe(тБу}» лн

Асп(ОтБу)-Фен-Ací-Лиз(Бок, -Фен-Гис-Тре (тБу)-Фен-П ре-Глн-Тpe (тБу) =Асн-Тре (тБу)-М

Гпи-Вал-Гпи-Ала-Про- И Н2

260 мг 2: -докозапеп тица гидрируют в течение 15час в 26 мл 80у нойуксуснойкиолоты в присутствии 50 мг папладия на ух ле, катализатор отфильтровывают, фильтрат концентрируют до85 мл и пиофилизируют.

Для удаления уксуснои кислоты остаток два раза переосаждают из смеси метанолраствор бикарбоната натрия, Р п 0,31;

R - O29, и

) Бокдис-Гли-.г,,си"-Лей-Сев(тБу}- Тре (ТБу)-Цио-Мет-Лей -Гли-Тре (тБу}-Тир(тБу)- .

-Tpe-(тБу)-Глн-А cl) (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок )

-Фен-Гис-Т ре (тБу)-Ф еч-П ро-Глн-Т ре (тБу)-Асн-Тре (тБу)-Гли-Вап-Гли-Ала-Про- )(Н SS

1 70 мг полученного гидрированного доко- запептида и 101 мг Бок-Бис-Гпи-А сн-Лей-Сер(тБу) Tpe (тБу}-Цис-Мет-Лей-Гпи-ОН растворяют при нагревании в 1,2 мл ДМФА, прибавляют 15,8 мг N -оксисукцинимида )бО

21,3 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 3,5;ас в токе азота при 45оС, приливают реакционную смесь по каплям и

20 мл диэтилового эфира, свободного oY li . -„ рекисей, ра ..)1))»сделяют продукт по Крайгу в системе мета)(сн- буфер-хлороформ - тет рахлорметан (11:Э:5:6) через 450 ступеней с объемом фаз по 3 мп,фракции № 190"210 (),,, с200; К 0,8), упаривают досуха, удаляют буфер сублимацией и получают амоРфный IioPoUIQKp R Ой53й R 0p35)

Р 0,29.

Пример 2. Бмп-Гпк-АсНПей-Сер-ТраЛисМет-Лей-Гпи-Тре-Тир Тре-Гш

-Асп-Фен-Асн-Лиз-Фен-Гио-Тре-Фен-Прс-Глн-Тре-А сн-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-П ро2б 27

ЯН, гидрохлорид (дезамино -Асн -Tpe—

-кальцитонин М)

50 мг Бмп-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу)-Тре (тБу)-Лис-Мет Лей-Гпн Tpe(тБу)-Тир(тБу)

-Тре (тБу)-Гпн-Асп (ОтБу)-Фен-А си-Лиз (Бок)-:

-Фен-Гис-Tpe(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-

-Асн-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-А«-Про И Н 2 переводят путем ацидолиза при ОоС в при сутствии 12 и. соляной кислоты в пептид, как в примере 1, Я 0,50; R<

0„59; IR 0,43 (пластины йз целлюпозй фирмы ))it(- %k ).)()((Г)(й()(с ). Тонкослойный электрофорез (pI- 1,9, 16 в/смй 1,5 час)тпройденное расстояние 2,4 см по направлению к катоду. Защищенный дотриаконтапептидамид получают след ющим образом. 61 мг Бмп-Гпи-Асн-Лей-Сер(Тбу)-Тре(тБу)-Пис-Мет-Лей Гпи-OH 113 мг

H-Tpe (тБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок)-Фен-Гис Тре (тБу }-Фен-Про-Глн-Т ре (тБу)-Асн -Тре (тБу)-Гли-Вa)i-Гли-Ала-Про- Й Н < (пример 1, пункт II) и 10,5 мг М -оксисукцинимида растворяют в 0,9 мл ДМФА, прибавляют 14 мг дицикпогексилкарбодиимида, продувают азотом, закрывают сосуд и перемешивают смесь

3,5 час при 45 С. К реакционной смеси о добавляют 15 мл диэтилового эфира, свободного от перекисей, распределяют продукт по Крайгу в системе метанол- буфер. хлороформ- тетрахлорметан (11:3:6:7) через 240 ступеней с объемом фаз по 3 мл, упаривают в вакууме фракции № 108-129 (Г„„„„с 118е К 0,97), удаляют буфер сублимацией и получают аморфный порошок, R

0,29; R . 0,65; R< в Ой38 °

Il р и м е р 3. мп-Гпи-Асн-Лей-Сер»

-Tpe ((ис-БалЛей-Гпи-(!из-Лей-Тре-Гпн-А сп-Фен-А сн-Лиз-Фен-Гис-Тре-Тир-П роМ

-Глн-Тре-А сн-Тра-Гли-Вал-Гпи-Ада-Про- NH гидрохпорид (дезаминс -Вал -Лиз

2б..Л-Лей -Тир""-Асн -Т -кальцитонин М), 50 мт Бмп-Гпи-Асн-ЛейСер(тБу)-Тре

I тБу)-Бис-Бап-Лей-Гпи-Лип (Бек)- left-Tpe

553929

10 (тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок)-Фен-Гис-Тре (тБу)-Тир(тБу)-П ро-Глн-Тре (тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Пров и К> переводят в целевой пептид путем ацидолиза,каквпримере2. Р 0,51; R,g 0 45

)2 (пластины иэ целлюлозы фирмы М е c lc

Ьау rnst0))dt). Тонкослойный электрофорез (рН 1,9, 16 в/см, 1,5 час) — пройденное расстояние 3,7 см по направлению к катоду. Зашищениый дотриаконталептидамид можно с получить -, например, следующим образом. а) Е - -Лей-Тре(тБу).-Глн-Асп)(ОтБу) Фен

-Оме

) к р L

;4,15 г Н-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен е растворяют в 40 мл ДМФА, прйбав 15 ля)от 3,26 r Z -Лей-Онп н реакционную смесь оставляют на ночь при 22 С. Полу ченный пентапептид высаживают водой и кристаллизуют иэ смеси метанол-хлороформ, из петролейного эфира и иэ смеси метанол 2о о

-вода, т. пл. 204 С, К . 0,39; R . 0,52.

6) Н-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу) Фен Оме

4,8 г Е -пентапептида гидрируют извест- 25 ным образом в 100 мл метанола до насыщения, отделяют катализатор, упаривают фильтрат досуха и получают аморфную бе,лую пену, Rg 0,14; Ry 0,29. ь и) g -Листок)-Леи-Тре(тБу)-Гпн-Асп 30 (ОтБу)-Фен-Оме

4 г Н-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Оме и 3,5 r K -Лиэ(Бок)-Онп раст воряют в 25 мл ДМФА оставляют на ночь при 22 С. Полученный гексапептид выса .З5 живают диэтиловым эфиром в виде студня, который кристаллизуют из смеси метанол.сложный уксусный эфир» петропейный эфир, т, пл, 211 212 С; R 050; и 0,55 гД;-Лиэ(Бок)-Лей- Хре(тБу) Глн-Асп 4) (ОтБу)-Фен-М Н)) Н . 5 r вышеуказанного сложного метилового эфира растворяют при нагревании в 50 мл ДМФА, прибавляют 5 мл гидразингид рата и выдерживают в течение 5 час при 4 22 С. Продукт осаждают добавлением .

250 мл воды, Мелкокристаллический oca. док отфильтровывают и промывают водой до отрицательной реакции Фопина, т.пл, 220 С (разл,);.,Rj, 0,24е Rg 01,27. 50 д) Z -Тре(тБу)» Гир(тБу)-Аро-Глн-Тре (тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли Ала Про

° «ЯК

393 мг 2-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Про-Ой и 66 мкл Я -метилфорфолина растворяют в 5 мл тетрагчдрофурана, охлаждают до

-20 С в течение 1 мин прибавляют 82 м) изобутилхлоркарбонатау перемешивают 10 мин пори -15 С, прибавляют охлажденный до 0 С раствор 300 мг Н-Глн-Тре(тБу)-, -Асн Тре(тБу) Гли-Вал Гли-Ала-Про "N H

6 в 6 мл смеси трифторэтанол- хлороформ (6:4), перемешивают 1 час при 0 С,,вь- ю держивают в течение ночи при 22 С, кон» центрируют образующуюся студенистую массу, переосикдают из смеси тетрахлорметан-петролейный эфир, распределяют по

Крайгу в системе метанол- буфер- хлоро форм» тетрахлормвтан (10:3:5:4) 1через

400 ступеней с объемом фаэ по 3 мл, фракг ции М 118-143 (t „ 130; К 0,48) концентрируют, буфер удаш от субпимацией в высоком вакууме при 40 С и попучаот хроматографически чистый аморфный поро» шок додекапептида, R 0,42; Д 0,37;

1Е 0,65. е) Н-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Про-Глн-Тре (тБу) -Асн-Тре(тБу) Гли-Вал Гли Ала-Про-

-ВК,.

g,56 г полученного додекапептида растворяют при нагревании в 80 мп мета нопа и гидрируют известным образом. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаря вают досуха и получают аморфный продукт, т,лщ

-160 С; R 0,30; R 0,21; В 0 56 °: ж) Я -Асн-Лиэ(Бок) -Фен-Гис-Тре(тБу)-.

-Тир(тБу)-Про-Глн-Тре(тБу) -Асн-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли»Ала-Про- hf Н

445 мг K. -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис- NH

ЯК растворяют I при нагревании в 4 мл, ДМФА, охлаждают и при -20 С прибавляют последовательно 350 мл 3,2 н. раствора хлористого водорода в диоксане и 83 мл третмбутилнитрита, перемешивают 15 мин о при -10 С, прибавляют раствор 400 мг гидрированного додекапептида (пункт е) в 5 мл этипдииэопропиламина, перемешивают.

2) час.при О С, прибавляют 48 мл этилдииэо пропиламина и выдерживают в течение ночи о при 0 С. Реакционную смесь йрикапывают к 100 мл диэтилового эфира, распределяют по Крайгу в системе метанол-буфер-хлороформ» тетрахлорметан (10:3:7:4) через 650 ступеней с объемом фаэ по 3 мл, фракции

М 230-275 (t 255; К 0,65) обраба тывают известным образом и получают чис) тый гексадекапептид в виде амоо)Ыого ло рошка Р 0,37; Я 0,27; Rg 0,63. э) Н-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис- Тре(тБу)-, -Тир(тБу)-Про-Глн-Тре (тБу)-Асн-Тре(тЬу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-й Н, ацетат

250 мг гвксадекапептида (пункт ж) гид рируют;известным образом в 30 мл 80Ъ

-ной уксусной кислоты, катализатор отфнльт ровывают, фильтрат концентрируют до 4 мл и лиофилизируютЛЕ, 0,24; R 0,14; R

0,34. и) X -Лиэ(Бок)-Лей-Трв(тБу)-Глн-Асп. (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис-Тре(тБу)Ф

553929

Тир(тБу) Про-Глн Тре(тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли Вал-Гли-Ала«Про-Н Н

274 мг Е -Лиэ(Бок)Лей««Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен- И Н и H растворяют при нагревании в 2 мл ДЕФА, охлаждают и при

20 С прибавляют последовательно 154 мл

3,2 н. раствора хлористого водорода в диоксане и 37 мл третбутилнитрита, перемешивают 15 мин при -10оС, прибавляют раствор 275 мг ацетата гексадекапептида (0 (пункт з) в 2 мл ДМФА, охлажденный до

О С,и 85 мкл этилдиизопропиламина и перемешивают 2 час при О С. Затем добавляют о

2 1 мл этилдиизопропиламина, выдерживают

15 час при О С, добавляют смесь диэтиловь и эфир-петролейный эфир (7:3) отделяют осадок, распределяют его по Крайгу в системе метанол- буфер- хлороформ — тетрахлорметан (lO:3:5:5) через 345 ступеней с объемом фаз по 3 мл и из фракций N- 98-132 („115; К 0,5) выделяют известным образом хроматографически чистый докозапептид, Яс Ой39« Зс, Ой29; Ag Ой48 й) Н-Лиз(Бок)-Лей-Тре(тБу) -Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре 25 (тБу)-Тир(тБу ) -Про-Глн-Тре (тБу ) -Асн-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Aëà-Про- М Н z

173 мг докозапептида (пункт к) гидрируют в 30 мл 80%-ной уксусной кислоты в присутствии 50 мг палладия на угле в течение 15 час, катализатор отфильтровывают, фильтрат концентрируют до-3-4 мл и лиофилизируют. Для удаления уксусной кислоты лиофилизат переосаждают из смеси трифторэтанол - 5%-ный раствор бикарбоната 55

0,17 ии к) Бмп-Гли-АснЛей -Сер(тБу) -Тре (тБу)

Гис-Вал Лей-Гли-Лиз(Бок) Лей-Тре(. By)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн Лиз(Бок)-Фен-Гис.- ф0

-Тре (тБу ) -Тир (тБу ) -Про-Гли-Тре (тБу) -АснТре (тБу) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про- N Н

127 мг докозапептида (пункт й), 65 мг

Бмп-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу) -Tpe (тБу) -Цис-Вал-Лей-Гли-ОН, 12 мг I((-оксисукциними- й5 да и 1 7,5 мг дициклогексилкарбодиимида растворяют или суспендируют в 0,5 мл

ДМФА, перемешивают 3,5 час при 45 С, прибавля ют 50 мл диэтилового эфира, распределяют осадок по Крайгу в системе метанол-буфер - хлоро(орм- тетрахлорметан (10:3:5:4) через 250 ступеней с объемом фаз по 3 мл и из фракции Nc 88-11( ((„„,100; К 0,67) известным образом выделяют хроматографически однородный про- 55 дукт в виде аморфного порошка, Я 0,28;

Р, 0,65; R 0,27, Пример 4. Бмп-Гли-Асн-Лей-Сер-Tpe-1Лис-М ет-Лей-Гли-Лиз-Лей-Тре-Глн-Асп-Х(ей-Асн-Лиз-Лей-Гис-Òðå-Тир-Про-Глн- 60 р(Ас) () (. и l3-) ((ли ! й,!б тР, Гидрохлорид (д(зами)(О-Лиэ - IeA - ГирХф -27.

«Асн -Тре -) альцитонии М)

50 мг Бмп-Гли-Асн-Лей- :ер(тБу)- (ре (тБу)-(()(c-Aiет-Лей-Гли 1)ие(Бок) Лей Т; (тБу)-Глн-Асц(ОтБу)-Лей-АснЛиэ(Бок)-Лей-Гис-Тре(тБу)-Tир(тБу)-Г(ро-Гr í Тре (тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-(((Н й. обрабатывают 1 2 н. соляной кислотой при

0 Си, каквпримере 1, получаютсвободныйпептид: R 0,47; А 0,50; 3< 0,42 (пластины иэ целлюлозы фирмы k(er(:k Da(rnatadt ) ..

Тонкослойный электрофорез (рН 1,9, 16 в/ см, 1,5 час) - пройденное расстояние 3,7 см по направлению к катоду, Защищенный дотриаконтапептидамид можно получить, например, следующим образом. а) Н-Лей-Тре(тБу) -Глн-Асп(От Бу) -Лей-Оме

3,6 r 3 -Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)Лей-Оме гидрируют в 90 мл метанола в присутствии 360 мг палладия на угле при поглощении углекислого газа до насыщения; катализатор отфильтровывают, фильтрат концентрируют досуха и выделяют продукт, Е 0,15; Rg< 0,32. б) Z, -Лиз(Бок) Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу ) -Лей-Оме

840 мг Н-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Лей-Оме растворяют в 5 мл ДМФА прибавляют 765 мг Z -Лиз(Бок)-Онп, выдерживают в течение ночи при 22оС, концентрируют в высоком вакууме до сиропообраэного состояния, прибавляют 30 мл диэтилавого эфира и переосаждают полученньгй студень иэ смеси метанол- сложный уксусный эфир- петролейный эфир, т.цл.

218 220оС. Я О 41. Rg 0 61 в)Z Ëие(Бок(-Лей-ТPe(тБУ)-1 ли Асс (ОтБу) Лей К Н N Н

720 мг метилового эфира гексапептида (пункт б) растворяют в 40 мл абсолютного метанола, прибавляют 3,6 мл гидраэингидрата, выдерживают 5 час при 22 С, приливают 75 мл воды, отфильтровывают осадок, хорошо промывают его водой и сушат, т,пл.

215-218 С; h, 0,55; R 0,29; г) 2, -Асн-Лиэ(Бок)-Лей-Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Г(ро-Глн-Тре(тБу)«Асн-Тре(гБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-П ро- 1(Н z

636 мг и -Асн-Лиэ(Бок)-Л "й-Гис- I((IINI( растворяют при нагревании в 10 мл

ДМФА, охлаждают до -20 С и прибавляют о последовательно 525 мкл 3,2 и. раствора хлористого водорода в диоксоне и 119 мл трет-бутилнитрита, перемешивают 15 мин при -15, вводят охлажденный до ОоС раствор 600 мг Н-Тре(тБу)-Тир(тБу)-ПроГлн-Тре (тБу)-Асн- 1 ре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-Ф(Н в 4,5 мл йМФА и 230 мку(l. 3

5" < 1 9

Я -метилмOl+0:п1на, перемешиваюT 2 час при

О С, прибавляют 46 мл N -метилмор олина о, и выдерживают в течение ночи при O С.

Продукт-сырец осаждак r 100 мл диэтиловс го эфира, распределяют по Крайгу в системе ацетонитрил,-буфер- хлороформ - метанол (1;1:1:1) через 500 ступеней с объемом фаз по 3 мл, из фаз ¹ 38-62 (t „ 50;

К 0,11) путем концентрирования и удаления буфера сублимацией в высоком вакууме при

40оС получают аморфный порошок гексадекапептида, R 0,38; Я» 0,28; R< 0,51.

4" ° 5 д) H-Асн-Лиз(Бок)-Лей-Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу) -Про-Глн-Тре(т Бу) -Асн-Тре(т Бу)- 5

-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- М Н>, ацетат

) 380 мг гексадекапептида (пункт г) гидрируют в 45 мл 80 /-ной уксусной кислоты над 50 мг палладия на угле до исчезновения исходного продукта (контроль тонкослой-2о ной хроматографией), катализатор отфильтровывают, фильтрат концентрируют до 4 мл и лиофилизируЫт, Q 0,29; 3» 0,40; е) 2, Лиз(Бок)-Лей-Тре (тБу)-Глн-Асп (ОтБу) Лей-Асн-Лиз(Бок)-Лей-Гис-Тре (тБу)-Тир(тБу)-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Тре . (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- КН

230.мг Е -Лиз(Бок) Лей-Тре(тБу)-Глн

-Асп(ОтБу)-Лей-ЙНЙН. растворяют в 2 мл о

ДМФА, охлаждают до -20 С и при -20 С . зо прибавляют госледовательно 134 мкл 2,3н раствора хлористого водорода в диоксане и

32 мкл трет«бутилнитрита, перемешивают о

15 мин при -10 С, прибавляют раствор:

306 мг ацетата гексапептида (пункт д) з5 в 3 мл ДМФА и 63 мкл К -метилморфолина, перемешивают 2 час при ОоС, добавляют

15 мкп N -метилморфолина и выдерживают в течение ночи при ОоС, Продукт-сырец осаждают 60 мл диэтилового эфира и,30 мл 4о пвтролейного эфира, распределяют по Крайгу в системе метанол- буфер- хлороформтетрахлорметан (10:3:5:5) через 240 ступеней и из фракций № 83-107 (г „ 95;

К 0,65) выделяют известным образом о5 аморфный порошок чистого докозапептида, Р» 0,27; Я» 0,59; R» 0,41, ж) Н-Лиз(Бок)-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Лей-Асн-Лиз(Бок)-Лей-Гис-Тре (гБу)-Тир(тБу) -Про-Глн-Тре (тБу )-Асн-Тре 5о (тБу)-Гли Вал-Гли-Ала-Про-NH

lOO мг докозапептида (пункт е) гидрируют в l6 мл 80%ной уксусной кислоты в присутствии 15 мг папладия на угле в течение ночи, катализатор от ильтровывают, 55 фильтрат концентрируют до "2 мл и .иофилизируют. Для удаления уксусной кислоты лиофилизат растворяют в О,F> мл трифторэтанола, добавляют раствор по каплям к

5 мл 5 г-ного раствора бикарбоната нат- ьо рия и получают продукт, Q» 0,18; Я» а s

O5О; Р, 0 20. з) Бмп-Гли-Асн-Лей ер тБу - ре тБу "

-Цис-Мет-Лей-Гли-Лиз(Бок)-Лей-Тре(тБу)-Гпн-Асп(ОтБу)-Лей-Р.сн-Лиз(Бок)-Лей-Гис-Тре(т Бу) -Тир(т Бу) -Про-Глн-Трв(тБу)-Асн-Тре(тБу) -Гпи-Вал-Гли-Ала-Про- К Н .

43 мг Бм

-Tpe(Бу)-U с-ХетЛей-Гли-ОН, 80 мг гидрированного докозапептида (пункт ж), 7,5 мл N -оксисукцинимида и 10 мгдициклогексилкарбодиимида растворяют в 0,6 мл ДМФА, перемешивают 3,5 час в токе азота при 45оС, добавляют 15 мд диэтилового эфира и распределяют по Крайгу в системе метанол-буфер- хлороформтетрахпорметан (11:3:6:7) через 200 ступеней с объемом фаз по 3 мл» Чис тое вещество выделяют известным абразом из фракций ¹ 90-115 (г «100;

К 1,0) в виде аморфного порошка, Р<

0,27; R» 0,66; 3» 0,31,, „,, .. II-

-Сер-Тре-Бис-Мет Лей-Гли-Лиз-Лвй-Трв

-Глн-Асп-Лей-А си-Лиз-Лей-Гис-Тре-Тир-Про-Глн-Тре-Асн-Т ре-Гли-Вал Гли-Ала-Прои а,а,в М .NH<, гидрохлорид (Лиз -Лей «Тир аь rr, -Асн -Тре кап тонин М, 50 мг Бок-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу— ,> Т с-Ме r-Л ей-Гли-Лиз (Бок ) Лей-Тре(тБу) -Глн-Асп(ОтБу)-Лей-Асн-Лиз(Бок)-Лей-Гис-Тре(тБу)-Тир(1Бу)-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Тре(тБу)-Гпи-Вал-Гпи-Ала-Про- N H обоабатывают 12 н. со2 о ляной кислотой при О С, как в примере 1, и получают свободный пептид, К 0,43; х

Ry 0,43> В f 0,38.

Тойкослойный электрофорез (pH 1,9, 16 в/см, 1, 5 час ) — пройденное расстояние 4,9 см по направлению к катоду.

Защищенный дотриаконтапептидамид мож но получить, например, следующим образом

110 мг Бок-Llvc-Гли-Асн-Лей-Сер т у—

:Ф> "»Т:»: - ° - А

Н-Лиз(Бок )-Лей-Tpe(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)Лей-Асн-Лиз(Бок) Лей-Гис-Тре(тБу)-Тир (тБу)-Про-Гпн Tpe(тБу)-Асн-Тре(тБу)»

;Гли-Вал Гли-Ала-Прсь-ЯН и 17,2 мг 8-оксисукцинимида растворяют при нагревании в 1,5 мл ЛМФА, прибавляют 23 мг дипиклогексилкарбодиимида, пеоемешивают 3,5 час в токе азота при 45 С, добавляют 30 мл диэтилового эфира, свободного от первкисей, распределяют по Крайгу через 350 ступеней в системе метанол- буфер- хлоро форм- тетрахлорметан (11:3:6:7) и из фракций № 140-179 (г „159> К 0,83) путем упаривания досуха и удаления буфера о сублимацией в высоком вакууме при 45 С

553929

Ъыделяют продукт, Йу,. 0,28; p 0,54>

Яу 0 29.

Ър

Тре-Бис-йетЛей Гли-Тре Тир Тре Глн . А ИФен»Асийиз»ФенГис-Тре-Фен Про-Глй«Тре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-П райИ Я (Тре -кальцитонин М).

27

» ьн ) ) )»)) В ).л) ) .)«) .

Лиз(Бок) -Фен«Гис-Тре(тбу)-Фен-Про-ГлнeÒðâ(тБу) Ааа Tpe(тБу) Гли-ВалГли АлаПро-,ЙН® разтворяют в 6 мл 90%ной три фторукоусной кислоты, продувают рас щор азотом, выдерживают 90 мин при 23 С, выливают s 50 мл ледяного диэтилового эфяра+ свободного от перекисей, отфильтровывают осадок, промывают его диэтиловым эфиром, сушат в вакууме при 40 С и полу о чают 185 мг Тре . -кальцитонина i М в;щ

RV виде трифторацетата, который переводят в аЦетат, пропуская через колонку слабоосновного ионообменника в форме ацетата (Мерк

34 11), и лиофилизируют. Выход ацетата

158 мг, .80 мг ацетата растворяют в 5 мл z5 воды, при перемешивании прибавляют 1,2мл слабоосновного ионообменника в форме сво» бодного основания (Мерк hk 11), наблюдая при рН 6,5 выпадение мелкого осадка, перемешивают 2 час, наблюдая повышение зо . рн до 7,1, осадок и ионообменник отфильт ровывают, промывают водой, отделяют пеп-" тид ог ионообменника прибавлением теплой

90%ной уксусной кислоты, отфильтровывают ионообменник, промывают его до» 55 попнительно 90%ной уксусной кислотой и укауснокислые I растворы лиофилизируют, Получают 74 мг Тре -кальцитонина М в виде уксуснокислой соли.

9< дпя полученного продукта и каль- р цвтонийа М 0,49 и 0,55 на алокс-пласти аах (45 г окиси алюминия фирмы Catnap

ММВеиа ., и 3,5 гипса, толщина О,3мм)! и 0,52 и 0,57 на пластинах из целлюлозы фирМы Мбгс Ьа тп51айй j соотаетствеЫ"45 но, Тонкослойный электрофорез (пластины из целлюлозы, рН 1,9, 2 час, 280 в)пройденное расстояние 4,5 см от катода (для кальцитонина М пройденное расстоя- 50 пив 4,5 см).)

При айалиае аминокислоты после полного кждролиза (6 н. соляная кислота, 110 0, 24 час) продукт содержит вычисленное количество аминокислоты.

Исходный материал может быть попу.чен следующим образом. а) 4 -Aira-Тре(тБу)-Гли-Оме

Смесь 18,9 г Z -Ала-Онц, 13,4 r

Н Тре(тБу)-Гли-Оме ° HCP, 100 мл ДМФ4 60

16 и 6,2 мл К -метилморфолина перемешивают 1 7 час при комнатной температуре, удаляют растворите..ль в высоком вакууме, раст» воряют остаток в ацетоуксусном эфире, промывают раствор, сушат, как в примере 1 (пункт а), упаривают и кристаллизуют остаток из смеси диэтиловый эфир - петролейный эфир, т. пл. 104-106 С, Выход

16 г. б) Н а-Тре(тБу)-Гли-Оме

13,3 r полученного продукта гидрируют. в метаноле в присутствии 1,5 г 10%-ного пвлладия на угле и получают 9,4 бесцветной смолы. в) Х «Тре(тБу)-Ала-Тре (тБу)-Гли- -Оме

9,4 r полученной смолы и 13,2 г

;Е -Тре(тБу)-Осу растворяют в 100 мл

ДМФА, выдерживают 17 час при комнат. ной температуре, выливают в 500 мл ледяной воды, фильтруют, сушат осадок и кристаллизуют из смеси ацетон - пет ролейцый эфир с добавкой небольшого ко личества воды, т,пл. 194-195 С; выход

13,6 г. г) Н-Тре (тБу) -Ала-Тре (тБу) -Гли Оме

13,1 г синтезированного продукта гид рируют в 750 мл метанола в присутствии

2,6 г палладия на угле н получают 9,95г .бесцветного масла. д) Z -Глн-Тре (тБу)-Ала-Тре (тБу)-Гли-Оме

Аналогично примеру 1 (пункт ж) по лучают производное пентапецтида, котоРое коисталлизУют из метанола, т.цл, 198

202 С; выход 10,7 г.

e) Н-Глн-Тре (тБу)-Ала-Тре (тБу) -Гли-Оме

10 г полученного продукта (пункт д) гидрируют в 1 л метанола в присуствии

2 г палладия на угле и получают 8,2 r соединения,, которое непосредственно ис» пользуют дальше. ж) Я . -Тре (тБу) -Фен-Про-Глн«Тре (тБу)

-Ала Тре(тБу)-Гли«Оме

К 8,2 r цолученного соединения (пункт е) прибавляют 8,3 г Е -Тре(тБу)-Фен-Про-ОН, добавляют 100 мл ДЕФА, 4,0 г и -оксисукцинимида и 4,2 r дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 17 час при комнатной температуре, отфильтровывают дицнклогексилмочевину, выливают фильтрат в 1,3 л ледяной воды, через 2 час отфильь ровывают осадок, сушат его и смешивают с 120 мл ацетоуксусного эфйра. Нерастворнв шийся порошок отфильтровывают, промыва» ют ацетоуксусным эфиром, сушат и получают

8,5 r продукта, .Р и 0,78; Ag 0,85;

R, 0,71. з) Я -Тре (тБу) «Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу) -Гли-ОН

7,05 r полученного соединения гидрируют в 400 мл 80%-ной уксусной кислоты в присутствии 1 r 10 -ного палладия на угле и получают 6,6 г продукта, Q<

0,35;% 0 72; Й (0,27. м) Я -Тре(тБу)-Гир(тБу)-Тре(тБу)° Глн-Асп(ОтБу } -Фен-Асн-Лиз (Бок) -Фен-Гис-Т ре (тЬу }-Фен-Про-Глн-Тре(тБу } -Ала-Тре (т Бу) -Гли-Вал-Гли-Ала-Прб- М Н <

565 мг Х -Тре(тБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу)

-Ггй-Асп(ОтБу}-Фен-NH -Рй растворяют при

4агревании до 80 С в 4 мл ДМФА ох лаждают до 20 С к охлаждаемому раст о вору прибавляют 0,35 мл 3,7 н, раствора хлористого водорода в диоксане и 0,067 мл, трет -бутилнитрита, перемешивают

10 мин при -15 С, прибавляют по каплям охлажденный до 0 С раствор 600 мг Но

-Асн-Лиз (Бок)-Фен-Гис-Тре (тБу)-Фен-Про-Гпн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- ф Н (ацетат) в 5 мл ДМФА и 0,33 мл Я -этилдиизопропиламина, пв о ремешивают 5 мин при -15 С. нагревают. до 23 (и перемещива от еще 6 час. Реакционную смесь вливыот в 100 мл ледя ной воды, отфильтровывают осадок, про мывают его водой, сушат в вакууме над хлоридом кальция, переосаждают из смеси метанол-вода, сушат, растирают с ацетоном и получают 650 мг продукта К 0,33;

Р, 060. н) Н-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу)-Глн

-Асп(От Бу) -Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис-Тре (тБу}-Фен-Про-Глн- Тре(тБу) -Ала-Тре(тБу)-.

-Гпи-Вал-Гли-Ала-Про- Й Н

610 мг полученного продукта ((пункт м гидрируют в 25 мл 80%-ной уксусной кислоты в присутствии палладия на угле, раса воряют продукт в 50 мл насыщенного во дой н-бутанопа, промывают раствор два раза разбавленным раствором бикарбона та натрия, два раза полунасышенным раство

poN хпорида натрия и ВОДОЙ» бутаношэную фазу отделяют, упаривают и получают 605 мг продукта, сВободного (от уксусной кис« лоты„в виде бесцветной пены Qg 0,20;

О} Бок-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу -Тре (тБу) -Бис -Мет-Лей-Гпи-Тре (тБу)-Тир(тБу)—

-Tp e (тБу }-Глн-Асп (ОтБу )-Фен-Асн-Лиз(Б ок)

"ФО-; -Гис-Tpe(тЬу } -Фен-Про-Глн-Тре (тБу)-!

-Ала Тре(тЬу} Гли-Вал-Гли-Апа-Про-ЙН,.

К смеси 605 мг Н-Тре(тБу)-Тир(тБу}»

- Tpe (тБу) -Гюп -Асп (бтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис- Гре (тБу)-Фен-Про-Глн-Tpe(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-=Вал-Гли-Ала-Про- ЙеН, у есО тп Пекапептпаа Бек-11пс-Гпп-Ас "ууеа-Ce;.. (тБу j-ype i тБу )-lice М1e lee- ee» .ОН, 46 мг 1-Оксибензотриазола и 10 мл

ЙМФА прибавпяс т 75 мг дициклогексилкар17 5539

5,15 r полученного продукта (пункт ж) растворяют при нагревании в 110 мл 90%ного метанола, охлаждают до 23 С и прис . бавляют 13,5 мл 1,0 н. едкого натра. Через 10 мин приливают 45 мл воды, а еще через 5 мин - 25 мл воды, Спустя 20 мин раствор выливают в 270 мл ледяной 0,05 н, соляной кислоты, отфильтровывают осадок, промывают егo ледяной, водой и смесью в ода - ацетонитрип (4: 1 }, сушат "и получают 4,1 г продукта, Ц 0,27; Йц

0,33; Ql, 0,28. и) Н-Тре (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу)Ала Тре(тБу)-Гли-ОН

3,65 r полученного продукта (пункт з) суспендируют в 125 мл ДМФА, гидрируют в присутствии 0,5 r 10%-ного палладия на угле, растирают продукт (2,62 г) с во дой, фильтруют и сушат.. Р» 0,12; Я

0,23.

20 й) g, j-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен Про-Глн-Tpe(тБу)-Апа-Тре(тБу ) Гли

OH

7,2 г Е -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-gH-ЙН о растворяют при нагревании до 80 С в 30 25 мл ЙМФА, охлаждают до -30 С и прибавля» о ют 7,74 мл 3,7 н. раствора хлористого . водорода в диоксане, при -30ОС добавляют

1,42 мп трет-бутилнитрита, выдерживают о о

10 MHB при -10 С, Охлаждают до 30 С 30 и прибавляют по каплям раствор 6,45 г

НТре (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу }-Ала;Тре (тБу)-Гли-OH и 7,8 мл N -зтилдиизопро пиламина в 70 мл ЛМФА.. Смесь выдеро живают 18 час при О С, выливают в 400мл35 ледяной 1 Ь-ной уксусной кислоты, отфильтровывают осадок, промывают его водой, су-" шат в вакууме над хпоридом кальция, обрабатывкот ацетонитрилом, фильтруют и су шату Ц4 О 33; Рув 0 21. к) Н-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)Фен-Про-Тре (тБу )-Ала-Тре (тБу )-Гли-Вал

-Гли-Ала-Про-Р4Н

К смеси 7,5 r 2 -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Гпн-Тре(тБу)-Ала- 45

Тре(тБу}-Гли-ОН, 0,99 г Я !-oêñècyêönínмида, 1,84 г Н-Вал Гли-Апа-Про-ЙН и 70 мл ЛМФА прибавляют 1,11 г дициклогексипкарбодиимида и перемешивают 5 час при

45 С, вливают в 1,2 л ледяного диетийо- 50 вого эфира, отфильтровывают осадок, с шат, смешивают с 200 мл смеси ацетонитрил - метанол (9:l }, Отфильтровывают, повторяют операцию, собирают Осадок, су« шат и получают 8,5 г соединения, Д . 55

050; Д 046; Д 029; Я

0,80. л} Н-Асн-Чиз(Бок) -Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Т рт(тБу } -Ала- Tpe (тБу) -Гли«

-Ban-Гли-Апа-Про- 8 Н, ацетат

1Г1 Г 5 3 Г) о. бодпимида, перемешивают 90 мин при 40 С о.. и 18 час при 23 С, отфильтровывают осадок, вливают фильтрат в 100 мл ледяного диэйилового эфира, свободного от перекисей, отфильтровывают осадок, промывают его диэтиловым эфиром и сушат. Продукт- "ырец два раза переосаждают из смеси диэтиловый эфир ДМФА и дважды из воды и ДМФА проводят противоточное распределение через 300 ступеней в системе из 3,66 л метанола, 1 л буфера, 2 л хлороформа и 2,32 л

„тетрахлорметана (буфер содержит 29 мл ледяной уксусной кислоты и 19 r ацетать аммония в 1 л воды). Чистое вещество находится в фракциях % 123-137 (К 0>76) °

Я 032; И „041.

Пример 7. Н-ti -Гли-Асл-Лей-Сер

-Трс Пис-Мер-Лей-Гли-Тре-Лей-Тре-Гли-Асп-Фен-Асн-Л из-Фен-Ги -Тре-Фен-П ро-Глн-Тре-Ала-Т рГ=Гли-В MI-Гли-А л а-П ро-Н Н, ацетат (Лей -Тре -кальцитонинМ). !

2 2У

490 мс Бок-Бис-Гли-Аск-Лей-Сер(еБуГ-Тре(тБу)-Цйс-Мет Лей-Гли-Тре(тБу)-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн Лиз(Бок)-Фен-Гио-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу).—, z .Ала-Тре (тБу) -Гли-Вал-Гли-Ада-Про-МН <. вводят в 12 мл ледяной 90%-ной трифторук сусной кислоты, продувают азотом и нагревают до комнатной температуры, Смесь выдерживают 90 мин при комнатной темпера З0 о туре, охлаждают до 0 С, вливают в 150мл ледяного диэтилового эфира, свободного от о перекисей, выдерживают 2 час при 0 С, отфильтровывают осадок, промывают его диэтиловым эфиром, сушат, растворяют в З

15 мл 5%ной уксусной кислоты и фильть йот через колонку со слабоосновным ионообменником в форме ацетата (Мерк % 11), для удаления трифторуксусной кислоты, Ко» лонку промывают 3 х 10 мл 5%-ной ук- 40 сусной кислоты, элюаты объединяют лиоЬ 27 филизируют и получают 432 мг Лей -Тре»кальцитонип М (ацетат) в виде бесцвет ного легкого порошка, Я 0,50 (пластины из целлюлозы), Я 0,45 (алокс-пла- 5 стины), Тонкослойный электрофорез (пластины из целлюлозы, рН 1,9, 2 час, 280 в)— пройденное расстояние 4,5 см от катода, 50

Исходный материал может быть получен следующим образом. а) й- -Тре{ тБу) -Лей-Тре(тБу) -Глн-Асп (ОтБу)-Фен- ЙН- NH 12,7г H-lIeA-Тре(тБу)-Глц-А си(ОтБу) -Феп-O ° растворяют в ls

100 мл ДМФА, 1ибавляют 9,0 г 2. -Тре (тБу)-Осу, выдерживают 17 час при 25оСе добавляют волу, отделяют осадок, сушат, «ристаллцзуют из «цотоуксусного эфира и получают 1 1,? г н1 одукт;1йкоторый поре- Ä 60

39 осаждают из смеси метанол- вона, т. пл. о

197-199 С, Для перевода в гидразнд

13,9 r полученного 7, -Тре(тБу)-- 1ей-Гре (тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Оме растворяют в 700 мл метанола, прибавляют 70 мл гидразингидрата и выдержшвают 45 мнн при комнатной температуре. Раствор коц центрируют в вакууме до 300 мл, добавляют к нему 500 мл ьоды, отфильтровывают осадок, промываю: водой до нейтрального состояния, сушат, 13,5 r полученного гидразида переосаждают из смеси ДМФАвода и кристаллизуют из метанолае Выход 11 г; т, пл, 225-227 С, б) У -Тре(тБу)-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок) -Фен-Гис-Тре (тбу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу ) -Ала«Тре (тБу) -Гли-В ал-1 ли-Ала-Про-ЮН

4,00 r Е -Тре(тБу)-Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу) Фен»%1-ЙН в 25 мл ДМФА

2 о нагревают при перемешивании до 70 С v о образования раствора, охлаждают до -20 С, прибавляют 2,50 мл 3,70 н. раствора хлористого водорода в диоксане, при перемешивании и охлаждении до -20оС прибавляют по каплям Ой48 мл трет-бутилнитрита, нагревают до -10оС и при этой температуре перемешивают 15 мин. Затем по о каплям прибавляют охлажденный до -10 С раствор 4,2 r Н-Асн-Лиз(Бок)-Фен»Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-14 Н2 (ацетат) в

50 мл ДМФА и 1,6 мл М -этилдиизопропиламина, нагревают до 0 С, перемешивают 60 о мин, постепенно прибавляя по каплям 0,8 мл

Й-этилдиизопропиламина, выдерживают 17 час при 23оС, х полученному студенистому осадку прибавляют 500 мл ледяного диэтилового эфира, свободного от перекисей, отфильтровывают осадок, промывают его диэтиловым эфиром, сушат, растирают с

200 мл ледяной воды, фильтруют, сушат и переосаждают трижды из смеси ДМФА— вода и дважды: из смеси ДМФА - ацетоуксусный эфир. Выход 4,98 г, Р< 0,61;

Я 0,38. в) Н-Тре (тБу) -Лей-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок)-Фен-Гис-Тре (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу) -Ала-Тре(тБу).

-Вал-Гли-Ала-Про- N H

3,0 г полученного продукта растворяют в 200 мл 90%-ной уксусной кислоты, гидрируют известным образом в присутствии

0,5 г 109-ного палладия на угле, полученную уксусно-кислую соль растворяют в 200 мл насыщенного водой н-бутанола, промывают несколько раз разбавленным раствором бикарбоната натрия, разбавленным раствором хлорида натрия и водой, 55392 9

Образующиеся эмульсии отделяют центрифугированием., Бутанольный раствор упаривают досуха, получают 2,15 г Н-Тре(тБу)

Лей-Тре(тBy)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок ) -Фен-Гис-Тре (тБу) -Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу) -Гли-Вап-Гли-Лла-Про- NH в виде бесцветной смолы, К 0,37; К 0,19; ! й, r ок-Ilac — 1 ли- сн-Лей-Сер тБу -Тре(тБу)»Бис-Мет-Лей-Гли-Тре(тБу)-Лей-Тре 1о (тБу) -Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн- Лиз (Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ana-Тре (т Бу) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про- 1!1 Н>

,К смеси 2,0 1 г полученного продукта 1,0 г

Бок-11ис-Гли-Асн-Лей-Сер (тБу) -Тре (т Бу)-Цис-Мет-Лей-Гли-ОН, 250 мг 1 -оксисукцинимида и 30 мл ДМФА прибавляют при пер емешивании 400 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 6 час

: при 43оС, в течение 3 час охлажда-. Ю ют до ОоС, отфильтровывают !дицикло, гексилмочевину, вливают фильтрат s 250 мл ледяного диэтилового эфира, свободного от перекисей, отфильтровывают осадок, промы-. вают его диэтиловым эфиром и сушат, Про- д

;дукт трижды переосаждают иэ смеси ДМФАвода и трижды из смеси ИМФА- ацетон, Выйди 1,72; Р, 0,33; Д, О,30;

Я 0,58.

-Тре-!!и «е)ет-!Ie» -Гли-Тре-Лей-Тре-Гли-Алл-Фен-Асн-Лиз-Фен-Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Асн-Тре-Гли -Вал-Гли-Ала-Про-ЫНее (Лей

-Асн -Тре кальцитоний М ) . еь и

170 мг Бок-U с-Гли- сн-Лей Сер тБу - З5

"тй) ))-- л*- - ) ) -Тре(тБу) -Глн-Асп(ОтБу) -Фен-Асн-Лиз (Бок)Фен-Гис-Тре (тБу) -Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про Бе растворяют в 5 мл 90%-ной трифторуксусной 4п кислоты, выдерживактг 90 мин при 25оС, трифторацетат пептида осаждают диэтиловым эфиром, свободным от перекисей, отфильтровывают его, промывают диэтиловым эфиромй сушат и растворяют в 19о-ной ук- 45 сусной кислоте. Раствор фильтруют через колонку, заполненную слабоосновным ионообменником в форме ацетата, элюируют

1%-ной уксусной кислотой и лиофилизируют элюат, получая 116 мг ацетата, который 50 ! растворяют в 5 мл воды (рН 4,2), при пе-l ремешивании прибавляют небольшими порциями 2,8 мл слабоосновного ионообменника в форме основания (Мерк M 11), наблюдая медленное повышение рН раствора 55 и начало осаждения свободчого пептида при рН 6,7. После перемешивания в течение 2 час рН достигает 7,1, Осадок и ионообменник отфильтровывают, промывают водой, растворяют пептид в 90 У-ной уксусной 60

22 кислоте, нагретой до 60оС, фильтруют, промывают на фильтре 90%-ной уксусной кислотой и лиофилизируют. Получают,98 мг Лей0

26. 27

-Асн -Тре - кальцитонина Я(в виде ацетата, Я 0,33 (пластины иэ целлю в лозы); gg 0,47 (алокс-пластины).

Применяемый в качестве исходного матери ала защищенный пептид можно получить сле- дующим образом. а) Е -Tpe (тБу)-Лей -Тре(тБу)-Глн-Асп:, (ОтБу ) -Фен-Асн-Лиэ(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тВу)-Асн-Тре(тБу) Гли-Вал-Гли-Anа-Про11Н, 380 мг 7.-Тре(тБу)-Лей-Тре(тБу) Глн»

-Асп(ОтБу)-Фен-ЯНИН растворяют s 5 мл

ДМФА при перемешивании и нагревании дв

70 С, охлаждают до -20 С, прибавляют о о

0,265 мл 3,71 н. раствора хлористого водорода в диоксане и затем 0,051 мл трет«бутилнитрита, выдерживают 10 мин при -10 С, прибавляют охлажденный до о

-10 С раствор Н-Асн Пиз(Бок)-Фен-Гис»

Ь

-Tpe(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Тре . (тБу)-Гли-Вал;-Гли Ала-Про-ЯН (ацетат) в 5 мл "ДМФА и 0,20 мл К -этилдиизопрро пиламина, перемешивают 1 час цри .0 С, прибавляя при этом еще 0,07 млфэпя » динзопропиламина, Смесь нагревают до комнатной температуры, выдерживают 1 час при 25 С и 20 час при 5 С, к образовав о о шейся студенистой массе добавляют 100 мл; ледяной воды,, через 1 час фильтруют при

О С, промывают осадок водой сушат, рас тирают с диэтиловым эфиром, . фильтруют, сушат, переосаждают иэ смеси ЙЯФА!!вода и дважды из смесиДМФА «ацетон. Выход

440 мг» Я» 0»52 » е2g 0»31» ф - О,4О. б) Н-Тре(тБу) «Лей-Тре(тБу)-Глн-Асж (ОтБу)-Фен АсйЛиз(Бок)-Фен Гис«Тре (тБу) -Фен-П ро-Глн-Тре (тБу) -Аон-Тре (тБу) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про-NH

260 мг полученного продукта растворяют в 25 мл 80%-ной уксусной кислоты, гидрируют известным образом в. присутствии

50 мг 10%-ного палладия на угле, 266 мг полученной смолы растворяют в 20 мл насыщенного водой н-бутанола, промывают раствор несколько раз раствором бикарбо«ната натрия, разбавленным раствором !хло1эида натрия и водой, бутанольйый слой упаривают и получают. 199 мг соединения, Й, о 13; я, 036. в в)Бок II с«ли-AGHq JIeM-Сер тБу -Тре ! тр у Г-Лил-М е тЛ ей-Гли-Т ре тБу -Лей

Тре (тБу)-Глн-Асп(отБу)-Фен-Асн-Лиз (EOK)»

-Фен-Гис-Тре(тБу) -Фен-Про-Глн-Тре(тБУ)-Асн-Тре (тБу } -Гли-Вал-Гли-А П о-NH

К смеси 102 мг Бок-Ци

553929

23 : Сер(тБу) Тре(тБу) -цис-Ме Л ей-Гпи-ОН, 499 мг Н-Тре-(тБу)-Ле&-Тре (тБу)-Глн-Асп (Ото }-Фен-Асн-Лиз (Бок )-Фен-Гио-Тре (тБу)-Фен-Про-Гпн-Тре(тБу)-Асн-Тре(тБу)Гпи-Вап-Гпи-Апа-11poл 1IQ 16 мг . И. -оксисукцинимида и 3 мп ДМФА прибавляют при пе, ремешивании 27 мгдицикпогексипкарбодиимио

:да, перемешивают бчас при 45 С, выливают в . педянойдиэтиповый эфир, через 2 час осадок отфильтровывают при 0оС, промывают нафипьг» 0 ре диэтиповымэфиром, сушат, растворяют при нагревании в 5 мл ДМФА, охлаждают до комна ной температуры, осаждают, 50 мл ацетоуксусного эфира, отфильтровывают, промы-, вают ацетоуксусным эфиром, сушат, раст- 15 воряют при нагревании в 10 мл смеси

ДМФА метанол (1:1), охлаждают. льдом и добавляют ледяную воду выдерживают

17 час, фильтруют при 0 С, отделяют мелкий осадок, промывают его водой и сушат 20. в вакууме над хлоридом кальция. Получают 175 мг продукта, Я 0,60; Qg„0,23;

Я,0,22.

П и м е р 9. Н-Бис-Гли-Асн-Лей-Сер-. е

-Тре-Бис-4Чет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн- д5

Асп Фен-Асн-Лнз-Фен-Гис-Тре-Фен-ПроГлн-Тре-Асн-Иле- Гли-Вал-4 ли-Ала-Про"-йб (-NH g (Асн - капьцитонин М) °

К 2,5 мл ледяйой 90 /-ной трифторук сусной кислоты при перемешивании в токе З0 азота прибавляют 115 мг мелкопорошкового Бок-U с-Асн-Лей-Сер(тБу -Тре тБу-Ыи -Ме ь-Лей-Гли-Тре (тБу)-Тир (тБу)-Тре (тБу)-Глн-Асп (OrBy) Фен-Асн-Лиз (Бок)-феь-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)- з5

-Асн-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- Н Н<, нагре-, вают до 21 С, выдерживают 90 мин при этой температуре, выливают в 50 мл леда ного диэтилового эфира, свободного от пе-! рекисей, отфильтровывают осадок, сушат р и получают 84 мг трифторацетата Асн кальцитонина М, который растворяют в Х%;

- ной уксусной кислоте, фильтруют через ко .лонку со слабоосновным ионообменником ( в форме ацетата (Мерк ¹ 11), эпюат лио» 45 филизируют и получают 75 мг Асн — - кальцитонина М в форме ацетата. После полного ! гидролиэа (6 н. соляная кислота, 24 час, о

110 С) продукт содержит вычисленное ко; личество минокислот. Для полученного пра, 50

- дукта и кальцитонина М Й 0,55 и я

0,60, Д 0,58 и 0,62 соответственно, !

Применяемый в качестве исходного материала защищенный пептид можно получить

I следующим образом. 55 а) K -Асн-Иле-Гли-Оме

Смесь 9,1 г Н-Иле-Гли-Оме НС1, 16,3 г Е -Асн-Оап, 50 мл ДМФА и 4,1 мл и -этилморфопина выдерживают 18 час при комнатной температуре, к образовавшемуся 60 студшо прибавляют 300 мл диэтипового эфира, растирают, отделяют осадок, сушат, гь -.тиоают с 200 мл воды, фильтруют, сушат и кристалпизуют из смеси ацетоуксусный эфир-гексан, выход 15 г; т.пл. 218219 С. б) Н-Асн-Иле-Гли-Ок е

14 г Е -Асн-Иле-Гли-Оме суспендируют в 500 мп ДМФА и гидрируют в присутствии 1 r 10%-ного.палладия на угле, на блюдая растворение исходного продукта, Катализатор отфильтровывают и раствор упаривают досуха, Выход 9,7 r. в) Е -Tpe(тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме

Смесь 9,5 г Н-Асн-Иле-Гли-Оме, 80мл

ДМФА и 13,6 г Я -Тре(тБу)-Осу выдерживают 18 час при 25 С, наблюдая полное о затвердевание раствора, прибавляют 300мл диэтилового эфира, растирают, отделяют оса док фильтрованием, растирают с 200 мл воды, фильтруют, сушат и кристаллизуют, Выход 12,4 г; т. пл. 207-208 С, r) Н-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме

11,0 г 3 г -Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме растворяют при нагревании в 500 мл ДМФА и гидрируют в присутствии 1 r 10%-ного палпадия на угле до прекращения поглощения водорода, катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и получают 8,0г соединения, R< 0,12; 9< 0,28 (хпороА форм- метанол, 70:30). д) 7, -Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме

7,5 Н-Тре (тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме раст воряют в 100 мл ДМФА и прибавляют 7,7 г

z. -Глн-Онп. Реакционная смесь медленно затвердевает. Через 18 час к затвердевшей массе при комнатной температуре прибавляют

375 мл диэтилового эфира, хорошо растирают, фильтруют, сушат осадок, растирают его с 250 мл воды, фильтруют, сушат, пе-, реосаждают иэ смеси трифторэтанол- вода и получают 11 г продукта, т.пп. 275-277 С, о труднорастворимого в обычных органических растворителях, е) Н-Глн-Тре (тБу) -Асн-Иле-Гли-Оме

8,5 г Е -Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле«Гли-Оме суспендируют в 500 мл ДМФА и гидрируют в присутствии 1,5 г 10%ного палладия на угле, наблюдая образование раствора исходного вещества, отфильтровывают катализатор, упаривают фильтрат и получают 6,5 г смолы, R 0 20; Qg 0 16, ж) Z -Тре тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)

-Асн-Иле-Гли-Оме

6,0 r Н-Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме растворяют в 500 мл ЙМФА, прибавляют

5,8 r Е -Тре(тБу)-Фен-Про-ОН, 2 3 r

Й -оксисукцинимида и 3 г дициклсгексилкар ° бодиимида, перемешивают 1 6 час при комнатной температуре, отфильтровывают ди553929 циклогексилмочевину, концентрируют фильтраг 2i30 мле выливают в 1е5 л диэтиловоо

ro эфира, выдерживают 3 час при . 0 С, огфильтровывают осадок, получая 10 F порошкообразного продукта, который растирают с 200 мл воды, фильтруют, сушат и выделяют 9,6 r продукта-сырца, который растирают с ацетоуксусным эфиром„фильтруют, сушат, суспендируют и ацетоне,фильтруют и сушат. Выход 9,3 г; Р 0,66. з) Z -Тре(тБу) Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-ОН

3,1 r 7, -Ч ре(тБу)-Фен-Про Глн-Тре. (тБу)-Асн-Иле-Гли-Оме растворяют при нагревании в смеси 155 мл метанола, 45 мл диоксана и 55 мл воды, охлаждают по комнатной температуры, прибавляют

8 мл 1,0 н. едкого натра, выдерживают

30 мин при комнатной температуре, охлам о дают до 0 С, прибавляют 150 мл ледяной у

BOgbI H 24 MJI 1 H, COJIHBOII KHCJIOTb3 отфильтровывают осадок, промывают его ледяной водой, сушат и получают 2,56 г однородного порошка, R» 0,21; М 0,19 ° и) Н-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)—

А си-Иле-Гли-OH

2,37 г Е -Тре(тБу)-Фен Про-Глн-Тре (тБу)-Асн-Иле-Гли-ОН растворяют в 60 мл

80 /-ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 200 мг 10%-ного палладия gp на угле, отфильтровывают катализатор, упаривают фильтрат, сушат остаток и получают

2,28 г смолы, % 0,21; Й „0,55, й) Й -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гнс-Тре(тБу)«Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-ОН м

1,41 г 2-Асн«Лиз(Бок)-Фен-Гио- .NH и Н растворяют в 20 мл ЙМФА, охлаждают до о

-30 С, прибавляют 1,5 мл 3,2 н, раствора хлористого водорода в дноксане и 0,29 мл трет-бутилнитрита, нагревают до -12 С, пе-ю о ремешивают 15 мин при -12 С, прибавляют

I о по каплям охлажденный до 0 С раствор

1,65 г Н-Тре(тБу)-Фен-Ilpo-Глн-Тре(тБу}

° Асн-Иле-Гли-ОН, 1,2 мл 40%»ного раствора гидроокиси триметилбензиламмония в метано-35 ле, 30 мл ЙМФА и 6 мл воды, охлаждают льдом, перемешивают 30 мин, прибавляют

1,1 мл N -этилдиизопропиламина, выдерживают 5 час при 0 С, наблюдая образование о студенистого осадка, выливают в ЗСО мл 50

1/-ной уксусной кислоты, перемешивают о

2 час при 0 С и отфильтровывают осадок.

Осадок промывают на фильтре водой, сушат прибавляют 50 мл метанола, перемешивают

2 час при комнатной температуре, фи33ьт Я руют . получают 399 мг продукта, Я

О, 18; % 0,24; М 0,33. к) Z -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тЬу, -Асн-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- К H

26

К смеси 420 мг 7, -Асн-Лиэ(Бок) Фен +Гис-Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Асн-Иле-Гли-ОН, 55 мг И-оксисукцинимида и 7 мл LlMA прибавляют при перемешивании

62 мг дициклогексилкарбодиимида и 103 мт

Н-Вал-Гли-Ала-Про-NH <, нагревают до

45 С, перемешивают 5 час при этой темпе ратуре, охлаждают до 0 С, выливают в 80мл о ледяного диэтилового эфира, отфильтровывают осадок, сушат, переосаждают иэ смеси ДМФА ацетон и затем из смеси ЙМФА ацетонит рил и получают 420 мг соответствующего гексадекапептида, R< 0,25; 3„

0,60. л) Н-Асч-Лиз(Бок)-Фен-Гис Тре(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу)-Асн Иле-Гли-Вал Гли-Ала-Про-ЯН@

; 395 мг полученного продукта растворяют в 25 мл 80 /-ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 100 мг 10%-ного палладия на угле, отфильтровывают ка» тализатор, упаривают фильтрат досуха и,:получают 380 мг продукта, Д 0,30, м) ? -Тре(тБу)-Тир(тБу)-Tpe(тБу)-Глн-Асп 3 ОтБу ) -Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис Тре (т Бу } -Фен-Про-Глн-Тре (т Бу) -Ас н-Иле-Гли-Вал-Гли» Ала- Про-.NH

358 мг Е -Тре(тБу)-Тир(тБу}-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-ЙНИНе растворяют при нагревании в 3 мл йМФА, охлаждают да о

-20 С, прибавляют 0,26 мл 3,2 н. раствора,хлористого водорода в диоксане и 0,045мл н-бутилнитрита, перемешивают 15 мин при о о

-15 С, прибавляют охлажденный до 0 С раствор 380 мг полученного выше (пункт л) продукта в смеси 10 мл ЙМФА, 2 мл воды, 1 мл ацетонитрила, 2 мл диметилсульфоксида и 0,2 мл М -этилдииэопропиламина и перемешивают 18 час при ОоС. Осадок отфильтровывают, дважды переосаждают из смеси

ДЕФА — ацетоуксусный эфир, смешивают с

20 мл метанола, фильтруют, сушат и получают 240 мг целевого пептида, Я

040; R 028; Я 042. ! l н)1Н Тре(тБу) -Тир(тБу)-Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис-Тре (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу)-Асн-Иле- JIII««

-Вал-Гли-Ала-Про-NH

220 мг полученного выше (пункт м) продукта растворяют в 15 мл 80%-ной уксусной кислоты, гидрируют в присутствии

20 мг 10% ного папладия на угле, отфильтровывают катализатор, упаривают .фильтрат досуха, остаток (2 10 мг) растворяют в 15 мл насышенного водой н-бутанола, промывают раствор разбавленным раствором бикарбоната натрия, затем несколько раэ водой, отделяют бутанольный слой, упаривают до- ) 27 суха и получают 202 мг продукта, свободного от уксусной кислоты, 0,40; Rg 0,32. о) Бок-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу)-Тре (тБу)-Цис-ЯетЛей-Гли-Тре (тБу)-Тир(тБу)"

5 «Тре(тБу)-Глн-Асп (ОтБу)-Фен-Асн-Лиз (Бок )— eIe Tðe (тБу)-Фен-Про-Глн-Тре (тБу)-Асн-Илв-Гли-ВалГли-Ала-Про- и Н, К смесите мг Бок-Цис-Гли-Асн-Лей«Сер тБу Тре тБу -ЦисМеэЛей-Гли-ОН, 195 мг синтезированного выше пептида, 16 мг К -оксибензотриазола и 3 мл ДМФА прибавляют 25 мг дициклогексил-, карбодиимида, в токе азота перемешивают

5 час при 45 С; выливают в 50 мл ле о дяного диэтилового эфира, свободного от перекисей, отфильтровывают осадок, дважды переосаждают его из смеси ЙМФА - вода и дважды из смеси ДМФА - апетоуксусиый эфир и получают 120 мг продукта, И

0,31; Р 0,17; Rg,. 0,65.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей форму лы или их кислотно-аддитивных солей 2s и

2 2 3 4 5 6 7 8

В -СК-СО-Гли-Асн-Лей-Сер-Тре-Био-Х9 10 11 12 13 14 15 16 17 зо

-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-фен-Асн18 19 20 21 22 23 24 25 26

-Лиз-Фен-Гио-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала27 28 29 30 3) . 32

-Иле-rJIH«BaJI-Гли-Ала-про-, И Н Р« где М - водород или свободная или апилированная аминогруппа; в

Х вЂ” остаток L -метионина, Ь -валина, L,-норвалина, Li -лейцина, Ь -изолейцина, Q -норлейцина или Ь -фК- аминомасляиой

es кислоты и где L -алании заменен I» -аса« парагином и/или 4 -изолейцин заменен

1. -треонином и где в соответствующем случае одна аминокислота или несколько аминокислот заменены в положениях 11,12, 16,19,22, и 24 другсй аминокислотой

« а именна 1.-треонин - f,-лизином 1.« -тиI«}« б розин -1 -aelIIHHoM,, -фенилаланин

-lëåéIIHíoì, g -фенилуаниЫ» L, eNIP цинам, La -фенилаланин! - 1, -тирозином и,-глютамин f,-аргинином, о т л иф4 ч а ю шийся тем, что от соединения формулы 1, где Я и Х. имеют вышеуказанga ные значения и (. -алании заменен . -ас» парагином и/или . Ь -aao«IeNzvm заменен ат (-треонином и где в соответствующем случае одна аминокислота, или несколько аминокислот заменены в положениях 11,12,16, 19,22 и 24 вышеуказанными аминокисло тами, в которых по меньшей мере одна аминогруппа или одна карбоксильная группа защищена отщепляемой ацидолизом защитной, группой, например Я -трет-бутилоксикарбонипьной или О-третбутильной, отщепляют защитную группу или защитные группы с последующим выделением целевого продукта в виде основания или их кислотно-аддитивных солей. ,Источники информации, принятые во внима-. ние при экспертизе;

1. Патент ФРГ l4 241 31 06, С 07 С 1 03/52, 1 973. аказ 206/40 Тираж 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская }««аб„д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. ЕЕрое..òíàÿ, 4

Редактор Т. Шарганова

Составитель В. 13олкова

Техред 0 Луговая Корректор Н Зол,овская