Способ получения полипептидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскии

Социалистических

Республик (11) 559653 (61) Дополнительный к патенту (22) ЗаЯвлЕно 27.12.73 (21) )У83856/13 (23) Приоритет — (32) 28,12.72 (31) 59742/72 (33) Великобритания (43) Опубликовано 25 05.77. Бюллетень № 19 (45) Дата опубликования описания 08.12.77 (5l) М. Кл. С07 6 7/026

Гасударственный sawer

Совета Иииистрвв СССР ие делам изобретений и аткрытий (53) УДК 547.466,1 (088.8) Иностранцы

Гарольд Грегори и Питер Лесли Волтон (Великобритания) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Империал Кемикал Индастриз Лимитед" (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

Изобретение относится к получению лекарственных препаратов, которые могут быть использованы при лечении диабета.

Известен способ получения полипептида дес Ала э Π— свиного инсулина, заключающийся в том, что свиной инсулин подвергают действию энзима карбоксипентидазы с последующим выделением целевого продукта 111.

Однако введение инсулина, полученного таким способом, вызывает антигенную реакцию у больных 1в диабетом.

Целью изобретения является снижение образования антител в организме пациента.

Это достигается тем, что обработку свиного или 15 бычьего инсулина осуществляют ферментами

АМ вЂ” протеаэой из грибка Armful 1 àr à mel lee или

Миксобактер Z — 1 протеазой ТГ из штамма Myxobacter AZ — 1.

Свиной или бычий инсулин подвергают действию специфической амино — эндопептидаэы лизина с помощью фермента, растворенного в волной среде, или с помощью энэина, нрисоединенног0 к носителю, который может быть растворим или не растворим в водной среде. 25

Скорость и степень реакции зависит от соотношения фермент — субстрат, рН и температуры инкубационной среды, концентрации инсулина и времени инкубации.

Протекание реакции регулируют с помощью проверочных отборов проб реакционной среды или с помощью электрофореэа или отделением на автоматическом аминокислотном анализаторе и легко определяют окончательное отщепление лнзил — аленина и влияние любого видоизменения условий реакции.

При использовании фермента АМ вЂ” протеазы реакция протекает при широком многообразии соотношений энэим — субстрат и можно использовать

1 ч энзима на 10000 ч субстрата. Реакция протекает при рН среды 3 — 10 и температуре 10 — 60 С.

Предпочтительными условиями реакции для полного отщепления лнзил — аланина, например, за

3 — 12 час являются: использование концентраций инсулина, близких к их растворимости в инкубационной среде, рН 7 — 9, температура 30 — 50 С н низкое соотношение энэима-субстрата (1:1000 или менее) . В инкубационную среду включают ионы металлов, например, кальция или магния н

S0 виде их хлоридов при концентрации 10 — 10 (молярной) .

При использовивн фермента Миксобактер

А1 — 1 протеазой 1f условия реакции псрти такие же, которые используют с АМ вЂ” протеазой. Соотношение энзим — субстрат. 1:10000 прн рН 1 — 10 и температуре 25-75 C.

Предпочтительными условиями являются следующие: концентрация инсулина, близкая к его растворимости в инкубаторной среде, рН б — 9, температура 30 — 50 С и низкое соотношение энэим— субстрат, например 1: 1000 или менее.

В инкубационную среду включают металлические ионы, например, кальция или магния.

Реакцию осуществляют при использовании энзима, связанного ковалентно с подложкой. Одним. нз способов присоединения AM — протеазы к подложке является активирование шариков агарозногр геля цианогенбромидом с пространственными группами (или без них), происходящими, например, иэ мксиламина или гексановой кислоты. Затем активированнув агарозу подвергают взаимодействию с

AM — nротеазой.

Если реакцию с энзимом осуществляют при помощи знзима, растворенного в водной среде, необходимый дес — Лиэ" — Алаэо — свиной (или бычий) инсулин можно отделять от других компонентов инкубационной смеси при помощи любого общепринятого технологического приема разделения полипептндов, например техники молекулярных сит. Водную среду, оставшуюся после того как весь нсходныи инсулин деградировал, фильтруют

@раз колонку иэ попергчно-связанного декстраноаого геля или полиакриламидного геля, подходящих для фракционирования соединений с мол.в.

5000 — 10000 при любом удобном значении рН, предпочтительно удаленных от полипептидов и предпочтительно с бс;з.". низкой изоэлектрической точкой.

Колонку элюирувт буферной смесью, состоящей иэ компонентов, которые являются летучими при сушке вымораживанием под высоким вакуумом, например водной уксусной кислоты, карбоната аммония или ацетата аммония, давая требуемый проЛукт, который отделяют прн сушке вымораживанием элвата, о

Если реакцию с энзимом осуществляют с помощью энзима, присоединенного к подложке, то отделение требуемого полипептида от энзима осуществляют фильтрованием, если подложка являет. ся нерастворимой, илн используют фильтр для высших полимеров, если подложка является растворимой в водной среде.

Даже в кристаллизоаанном свином или бычьем инсулине содержатся другие полипептиды в качестве примесей. Зти примеси обычно присутству от в количестве 3-5 весЯ от всего инсулина и состоят из таких веществ, как про-инсулин, фрагменты про- инсулина и глюкатон, которые трудно отделимы or шгсулипа, Под действием специфической амгшоэллонепншаэы лизина примеси разрушаются

29

4О

45 до более мелких полипептидов. Инкубацией свиного или бычьего инсулина со специфической амнноэндопептидазой и отделением продукта, полученного иэ энзима, лизил — аланина и полипептидаз с меньшим молекулярным весом, чем инсулин, т.е. олигопептидов, получают продукт, соде ржащий меньшие количества примесей, чем было в исходном препарате, Примеси, присутствующие в инсулиновом грепарате, способствуют его антигенности.

Продукты и полипептиды, полученные по предлагаемому способу, имеют активность, подобную инсулину, а также вызывают малое количество антител, которые связывают вещества, подобные инсулину при последующем введении в организм, чем исходные вещества.

Полученные полипептиды не обладают каким— либо токсическим действием.

Их используют для лечения диабета, также как прн использовании свиного или бычьего инсулина.

Назначают их парэнтерально, обычно подкожно или в виде раствора, или в виде препаратов, предназначенных для хранения. Препараты оказывают продолжительное действие, например до 24 час. Дозы выбирают в зависимости от требуемого лечения диабета, они могут быть высокими, например

200 ед. ежедневно.

Пример1,,Свиной инсулий, который предварительно был перекристаллизован 10 раз, растворяют в 0,1 М бикарбоната аммония (1,0 мл).

Раствор инкубирувт с AM — протеазой (50 мкг) в течение 1б час при 37 С.

Одну дозу (10 мкг) инкубационной смеси затем анализируют на и - концевые амино — кислоты с помощью приема "дансилирования" при использовании 1 - диметилам нафталин - 5 - сульфонилхлорида.

Вторую дозу проверяют с помощью бумажного электрофореза в смеси уксусной и муравьиной кислот при рН 2,1 (20 мл муравьиной кислоты

80 мл уксусной кислоты, разбавленных до 1 л водой} и показывают присутствие Н вЂ” Лиэ — Ала — ОН и еще одного компонента. Злюирование второго компонента и анализ и - концевых аминокислот обнаруживает глицин и феннлалании.

Общий анализ аминокислот дает общее соотношение аминокислот аспарагиновой кислоты 3, серина 3, траонина 2, глютаминовой кислоты 7, пролина 1, глицина 4, аланина 1, валина 4, иэолейцина 2, лейцина б, фенилаланина 3, тирозина 4, гистидина 2 и аргинина 1 вместе с цистеииом количество которое точно не определено. Соединение отличается от свиного инсулина отсутствием в нем лизина и только одного остатка аланина.

Третью дозу помещают в верхнюю часть колонки из смолы амино-кислотного анализатора Ло0 карта. Колонку из смолы элвирувт при 55 С следующим образом: домин (pH 3,28); 55 мин (рН 4,25), 2 час 15 мин (рН 6 65), на которой инсулин появляется через 3 «ас 54 мин, Лиэ — Ала через 4 час

15 мин и лес — Лиз — Ала свиной инсулин через

559653

3 час 43 мин. Обнаружены только два пика, соответствующие дес — Лиз Ала" — свиному инсулину и

Лиз — Ала.

Остаток инкубационной смеси помещают на колонку из пористого поперечно-связанного декстранового геля, уравновешенного 0,1 моля карбоната. аммония. Колонку проявляют 0,1 М карбонатом аммония при скорости потока 3 мл/час н собирают фракции 30 капель (l мл) . Фракцию анализируют на пептидный материал измерение м УФ вЂ” поглощения при 280 им и фракции 25 — 35, содержащие основной пик, сочетают и лиофилизируют, давая дасЛиз - Ала — свиной инсулин.

Пример 2. Свиной инсулин, перекристаллиэовыванный 10 раз, растворяют в 0,1 М бнкарбона- 15 та аммония, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх10» молярной концентрации. Порции этого раствора затем инкубируют при рН 8,2 при температуре 37 С в течение 40 час с количест- 20 вом AM — протеазы, дающим следующие соотношения энзим — субстрат: 1: 625,. 1: 1250, . i; 2500 и

1:5000. Анализ инкубационных смесей с некоторыми интервалами с помощью приемов, описанных в примере 1, показывает полное расщепление в каждом случае, эа исключением l:5000 реакции, в которой в конце эксперимента получают 88% — ное рас щепление.

Пример 3. Свиной инсулин, перекристаллизованный 10 раз, растворяют в буферных смесях, 30 приготовленных из аммиака и уксусной кислоты с рН 4,0; 6,0; 8,0 и 10, содержащих хлористый кальций, давая 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх10" молярной концентрации. Растворы инкубируют с АМ вЂ” протеазой при соотношении эн- З5 эим — субстрат 1:100 при температуре 37 С в течение

6 час. Анализ показывает, что в каждом случае имеет место расщепление.

Пример 4. Свиной инсулин, предварительно перекристаллизованный 10 раз, растворяют в О,! М 4О буферном растворе бнкарбоната аммония нри рН

8,2, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх10 молярной концентрации. Порции раствора .инкубируют с АМ вЂ” протеазой при соотношении знзим — субстрат 1:1000 в течение 3 час при температуре 23,37,45 и 55 С. Анализ, аналогичный примеру 2, показывает полное расщепление при 37 и

45 С, приблизительно 50%-ное расщепление при

55 С и в небольшой степени расщепление при 23 С.

Пример 5. Раствор свиного инсулина (120 мг— кристаллизованный один раз свиной инсулин, очищенный с помощью гелевой фильтрации в 0,1 М карбоната аммония) в воде (14 мл), доведенный до рН 8,0 и содержащий хлористьп» кальций в Зх104 молярной концентрации, инкубируют при 37 С с

АМ вЂ” протеаэой (120 мкг) в течение 5 час. Во время инкубации рН поддерживают 8,0 с помощью добав. ления 0,005М раствора гидроокиси натрия. 1!олученный раствор помещают иа колонку из пористого поперечно — связанного дек тралов<и о геля и колонку проявляют 0,1М карбонатом аммония при скорости потока 13 мл/час при температуре 4 С. Фракцию по 150 капель (5 мл) собирают и анализируют на пептидный материал измерением их УФ-поглощения при 280 нм. Фракции (22 — 30), содержащие главный пик, собирают и лиофилиэируют, давая де — Лнз -Ала — свиной инсулин (100 мг).

После электрофореза с помощью полиакриламидного геля при рН 8,9 материал представляет собой единственный компонент при окрашиванни амндочерным. Он имеет подвижность по направлению к аноду 1,2 относительно подвижности свиного инсуяна. Он также дает некоторые интегральные амино — кислотные соотношения (найденные в примере 1).

Пример 6. Раствор свиного инсулина (1 мг) в 0,1 М буферной смеси бикарбоната аммония с рН

8,2 (1 мл) помещают на верхнюю часть колонки, содержащей 3 мл 4% — ного агарозного геля, к которому ковалентно присоединяют 5 мг AM-протеазы и уравновешивают в том же самом буферном растворе бикарбоната аммония при 22 С.Колонку элюируют буферным раствором бикарбоната аммония при скорости потока 7 мл/час в течение 1 час и фракцию анализируют на пептидный материал путем измерения УФ вЂ” поглощения при 280 нм. Фракции, содержащие пептидный материал, собирают и лиофилизируют, давая дес — Лиз — Ала — свиной инсулин, имеющий те же физические свойства, что и продукт примера 5.

Пример 7. Растворы свиного инсулина (кристаллизованные 10 раз), содержащие 1 мг инсулина на 1 мг растворителя, инкубирутот при рН

8,0 н температуре 40 С в течение 2 час с АМ вЂ” протеазой при соотношении энэим-субстрат 1:!000 в присутствии хлористого магния прн концентрациях

lO, 16, 10 и 10 молярных соответственно.

Анализ, как в примере 2, показывает 90% — ное расщепление с 10 молярной концентрацией Мо, 75Яное расщепление с 1б и 10 з молярным

Мо и 65 o íîå расщепление с 10 молярным Мо.

При отсутствии магния имеет место 68 c — ное расщеплениее.

Пример 8. Раствор кристаллического бычьего инсулина (150 мг) в воде (20 мл), доведенной до рН 8,3 и содержащий 10 М хлористый кальций, инкубируют с АМ вЂ” протеазой (240 мкг) в течение 3 час при 37 С.

Во время инкубирования рН поддерживают при

8,3 путем добавления 0,02М раствора гидроокиси натрия. Дозу раствора (10 мкг) проверяют при использовании амино — кислотного анализатора, как описано в примере i, 1 мин (рН 3,28); 1 мин (pH 4,25),60 мин (pH 6,65), затем цикл регенеранни на колонке. Пик инсулина (элюирование в течение

90 мин) отсутствует, тогда как дес — Лиэ — Ала зо зо — бычин инсулин (время элюирования 80 мин1 и

Ала — Ала (элюиров;шле в течение 120 мин) присутствуют. Инкубированный раствор эиел лиофилизи559653

Составитель С, Малютина

Техред М. Левицкая Корректор M. Демч„, Вдактор А. Бер

Тираж 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий! 13035, Москва, Ж-35. Раушская наб., д. 4/6

Заказ 1426/}!6

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 руют н твердое вещество растворяют в М уксусной кислоте (2 мл). Этот раствор подвергают гелевой фильтрации при 4 С с М уксусной кислотой в качестве растворителя. Фракции, включанйцие главньй пик, нзмеренкьй с помощью адсорбции УФ при

280 нм, объединяют н модифицируют, давая дес — Диэ -Aaaaa-6smN инсулин (113 мг}.

После полиакриламнд-гелевого электро форе за (pH 8,9) материал выглядит как единственный компонент, когда окрашивается амидо-черным. Он имеет подвижность 1-2-кратную подвижности бычьего инсулина по направлению к аноду, Обший амино — кислотный анализ дает те же самые интегральные соотношения аминокислот, что и бычий инсулин, за исключением того, что отсут. ствует лизин и только два остатка аланина.

Глицин и фенилаланин обнаруживыотся как Йконцевые аминокислоты при приеме "дансилирова. ния", описанном в примере 1.

Пример 9. Один раз кристаллизованньй свиной инсулин (150 мг) растворяют в воде при добавлении И гидроокиси аммония и раствор разбавляют до 3,0 мл 0,1 М бнкарбонатом аммония.

Добавляют раствор AM — нротеаэы (150 мкг, 0,5 мл) и раствор выдерживают при температуре

37 С в течение 31час. Анализ дозы перевара с помощью приема, описанного в примере 8, показывает, что переваривание завершилось, Раствор разбавляют 40 об %/об водной уксусной кислоты (3 мл) и полученньй раствор помещают на колонку "Сефадекс" Ю вЂ” 50. Колонку элюируют 20об %/об водной уксусной кислотой и элюат проверяют прн измерении абсорбции 2Ф при 280 нм. Собирают фракцию иэ 800 капель со скоростью потока

15 мл/час. Инсулиновьй пик появляется между фракциями 45-56, эти фракции объединяют и сушат, получают дес — Лизав — Ала о — свиной инсулин (135 мг) . При этих условиях АМ вЂ” протеаза, меченая

1 — 125, появляется между фракциями 36 — 43.

Формула изобретения

Способ получения полипептндов из инсулина путем его обработки пентидазой с последующим выделением целевого продукта, отличаю щий20 с я тем, что, с целью повышения качества пренарата, обработку .осуществляют ферментами АМ вЂ” протеазой иэ грибка Armillaria Mellea или Миксобак-! тер 2 1 лротеазой 11 иэ штамма Myxobacter

А2-1, Источники информации, нринятые- so внимание при экспертизе:

1. Патент США И 3,364.116, кл. 424 — 378, 1968.