"способ получения гидроокиси ангидро-4-карбамоил-5-окси- 1рибофуранозилимидазола (брединина)
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) 3аявлено 24 05 73 (21) 1928145/13 (23) Приоритет — (32) Союз Советских
Социалистических
Республик (11) 574162 (51) М. 1(п, С 12 п 13т00
Государственный квинтет
Совета Министров СССР по делам нзооретений н открытий (43) Опубликовано 25.09-77. Бюллетень 1че 35 (45) Дата опубликования описания 05.0S.77 (53) уДК е15 37 c>lc имя (088.?31
Иностранцы
Кимио Мизуно, Такудзи Андо, Масаки Такада, Мицуо Хайяси, Масатоси Цудзино, Минетоси Иесизава и Тецуо Мацуда (Япония) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Тойо Иозо Кабусики Кайся" (Япония) (71) Заявитель
{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРООКИСИ АНГИДРО-4"КАР БОМО ИЛ-5- О КСИ- 1- РИБОФУ РАН ОЗ ИЛ И МИДА ЗО (Б РЕДИН ИН А) Изобретение относится к области медицины.
В извеспюй специальной и патентной литературе прототипа способа получения гидроокиси ангидро - 4 . карбамоип - 5 - окси - 1 - рибофуранозилимидазопа не обнаружено.
Целью изобретения является получение гидроокиси ангидро - 4 - карбамоил - 5 - окси - 1рибофуранозилимидазопа.
Это достигается тем, что культуру Eupetticillium Brefedianum NRRL" 5734 выращивают в гэробных условия х на ср еде, содержащей ис точники углерода, азота, минеральные соли, и выделяют целевой продукт из фильтрата культурной жидкости известными приемами.
В качестве микроорганизма — продуцента брединина используют Eupenici 1 I ium Brefedianum, в качестве среды — обычную питательную для выращивания микроорганизмов среду, в качестве источника углерода — глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, крахмал, декстрин, мелассу, глицерин, в качестве источника азота — кукурузную замочную жидкость, спорошкованные соевые бобы, сиорошкованные семена хлопчатника, пшеничную клейковину, иситон, . мясной экстракт, дрожжевой экс|рак., гиш >пизат казеина, аммонийные соли, нитраты п г.п. Используют минеральные сопи: фосфан ы магния, кагтьция, калия, натрия, ииггка, непе:ta (двух- или трехвапенгного) марганца.
Температура выращивания може" изменяться в интервале 26-30 (. Продолжительность культивациии зависит от условий и составляет 40--70 ча .
Способ получения брепинина осуигеснвпянл Jlcдующим образом.
Доводят рН фипьтрата культуральной среды
l0 Eupenici! iium Brefedianum NRRL-5734 до 9,0 и пропускают через сильно щелочную анионообменную смолу в гидроксидной форме для аб:орбции брединина. Элюируюг 2% ной водной уксусной кислотой v. элюент обрабатыванл сильно щелочной
15 анионообменной смолой, элюат уиаривают иод вакуумом, в остатке иопучанл масло, которое распыляют добавлением метанола и ацетона в виде серовато- белого порошка.
Этот порошок растворянл в небольшом коли2{) честве воды для проявления через колонку с сипикагелем и получают активные фракции, которые сушат под вакуумом. Порошок растворянгг в воде, затем насыщают газообразным сероводородом дпя выделения (осажде ния) хелатируняцих металлов.
Дальнейшую очистку осугцествлянгг растворением неочищенного порошкообразного брединина в буферном растворе 0,1 моля пиридина-уксусной ки лоты и пропускают полученный раствор через колонку с сефадексом ЧАЕ А — 25. Брединин герекристаллизовываюг иэ активного элюата с добавлением метанола, получают его в виде белых кристаллов.
П р и и е р 1. 100 мл среды, содержащей, вес.%:
2 глюкозы, 10 картофельного экстракта, 0,5 измельченного семени хлопчатника, 0,5 КНа РО4 и
0,25 Mg S0q /Н, О, вносят в 500 мл колбу, стерили. жют 15 мин при 120 С. Среду инокулипуют спора<я 300об, ми«при 26" С. Через 48час культуральную среду перс«о,:ят в 20 мл подобной жс среды в 30 л о фермент ре и выращивают при 26 С, при перемешивании (ЖО об/мин) и аэрировании (20 и/мин) в тсчени<. 49 <ас. Полу н<ннук< культуральную среду переносят в 00 л: аранес простерилизованной среды (рН вЂ” 6,5), с<щсржа«<ей, вес.%: 2 глюкозы, 1 пелтона, 1 замочной ку<:ypy» ° 7На О и О,! пр<гтивовспенивающего средства в :(Ю л фсрмситерс, и выращиванл при 26 С. при псрсмешииании (350 об/мин) и аэрации (200 л/мин в течение 55 час. 1олучают культуральный бульон (p!15,9), содср <<щий 50 мкг/мл бредшгина. Доводят pl! до 9,0 добавлением 50% ного водного раствора едкого HdTpa и фильтруют, получают !70 л прозрачн<чo фильграта. Фильтрат пропускают «. Påç колонку, содержащую 20 л амберлита 1ЯА — 4! . о скоростью подачи 300 мл/мин е цсльк> абсорбции вещества и промываюг 50 мл воды. Элн>ирова«ие осуществляитг 2%-ной водной уксусной кислогой и фракционирукл (злюат) на 5 л фракции. Активные фракции !
Активные фракции N 13 — 18 собирают, упарчвают под вакуумом, получают 200 мл маслянистого остатка. Остаток перемешивают с 400 мл метанола и 200 мл ацетона и осаждают фугованисм при 3000 об/мин в течение 0 мин. Преципитат промывают ацетоном. сушат под вакуумом и получают 50 r неочищенного брединина (10% чистоты) в виде серовато- белого порошка. Пример 2. Полученный в примере порошок неочищенного брединина растворяют в небольшом количестве воды, суспендируют < в смеси растворителей и загружают в колонку с 500 мл силикагеля и смесью растворителей н.бутанола: уксусной кисло. ты: воды (10: 1:2), после чего проявляют той же смесью растворителей. Элюент фракционируюг на фракции по !00 мл. Активные фракции (!
574162 4 порошка (26% чистоты). Порошок растворяют в 100 мп воды и насыщают сероводородом для выделения хелатирующих металлов в виде их сульфидов. Высушенный материал растворяют в 10 мл буферного раствора 0,1 моля пиридина-уксусной кислоты (рН 6,0) и пропускают через колонку, загруженную 400 мп сефадекса ДЕ АЕ А-25, с тем же буферным раствором. Элюат фракциоиирунг на фракции по 10 мл, активные фракции !
Физико- химические свойства брединина. 15 Элементарный анализ: С 41 70% Н 5 06% N 16 21%. О 34,03%. Мол.в: найдено —.265 (титрованием): теорсг»чески — 259,22 С9Н< зй Оа о Точка плавления выше 200 (при разложении буреет); Оптическое вращение << - 3.»" {c =- 0,8; Н. О! УФ вЂ” спектр поглощения (в H;O) < смаке: 245 ммкм, Е„ см .—: 250 P/о 7<макс 279 ммкм, E< „,„= — 580 Цветные реакции. Положительные: <за хлорное железо, реакцию Молиша, перманганат калия, 11аули и Эрлиха. Отрицательные: на реакцию Толенса, Фелинга. Драгендорфа, Лейдон-Смита, Hd иза|ин, рсакцин» Сакагучи и реакцию с нингидрином. Легко растворим в воде. Слабо рас.<ворим в метаноле. Трудно растворим в ra»o»e. !!ер«сиво. рим в ходовых органических р«с1воритенял. ()Kd. в5 слабокислый (рКа 6,75). Не инактивируе<ся ири рН "-9, при <Ъ <., а течение 30 мин. Биологические свойлва брс/<ини««. Острая токсичность: . !г/K! (««у<рибрнаии«но 40 на мышах). Бредию<н нс оказывает аптибакr р» ального действия, но оказьп<асг сл«б<л. ингибирун» щее действие на Кап/<ида аррика«с. Слабое имму«одепрессивное действие на<л<юдаю< при в«сцспии брединина в тот же день или в 1-ь<й :к«ь (на 45 следующий) после инъекции SRHC. !!ри введении брединина на второй день отмечают наибол<ьц<се иммунодепрессивиое действие и слабое дспрессив. ное действие наблюдакп в 3 день. Брединин облада. ет большим иммунодепрессивным действием. Ои 50 не оказывает ин<ибируюшего действия на размножение вируса герпеса просто< о, вируса полио,в и Руса гемоаглютинацин (Японского), но ингиби руе < вирус вакциниа. Брединин оказывает слабос нротивоопухолевое действие на асцитнь<й тумор Эрли55 ха и лейкемию L— - 1210 у мышей. Формула изиоретения Способ получения гидроокиси ангидроQ} -карбамоил - 5 - окси - - рибофураиозилимилаз<574162 Составитель С. Малютина Техред И. Асталош Корректор А. Кравченко Редактор А. Бер 2412/47 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий 113035, Москва, Ж- 35, Раушскаа наб., д. 4/5 Заказ Филиал ППП "Harem", г. Ужгород, ул. Проектнаа, 4 ла, о тл нч а ющийс я тем, что культуру Eup6I;lire ci1l ium 8refedianum NRRL — 5734 выращивают в азробных условиях на среде, содержацей источники углерода, азота и минеральные соли и выделяют целевой продукт из фильтрата культуральной жидкости известными приемами.
