Способ получения орготеина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 578836

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 22.05.73 (21) 1929363/13 (23) Приоритет — (32) 19.07.72 (31) 273277 (33) США (43) Опубликовано 30.10.77, Бюллетень _#_- 40 (51) М. Кл А61 К 37/04

Тосудврстеенный комитет

Совете й!ннистров СССР по делам изобретений и открытий (5-1) У, -.Я 615.45:612. .111 (088.81 (45) Дата опубликования описания 26,12.7I (72) Авторы изобретения

Ин острая цьг

Вольфганг Хьюбер, Марк Гари Сейфер и Силвер Хьюнт Чоу (США) Иностранная фирма

"Диагностик, дэйта Инк". (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

Изобретение относится к области гематологии н касается получения орготеина из эритроцитов.

Известен способ получения орготеина из эритроцнтов путем лизирования эритроцитов, осаждения гемоглобина, например этиловым алкоголем температуры -15 С, прибавления холодного 0,15 М раствора NaCI, удаления преципитата центрифугированием при -10 С в течение 10 мил, последующего растворения преципитата и его прогревания при

65 С в течение 15 мин, охлаждения, повторного удаления преципитата центрнфугированнем и лиофилизаггггей верхнего слоя жидкости, содержащей орготеин (!).

Однако известный способ является трудоемким.

С целью упрощения технологиии производства по предлагаемому способу гемоглобин осаждают путем нагревания зритропитов при температуре

60 — 80 С лри рН раствора от 6,7 до 7,5.

Способ осуществляют следующим образом.

Разбавляют цельную кровь примерно втрое, например 0,5 — 1,5 об.ч. воды, нагревают до 65 — 75 С в течение 1 — 8 ч, затем охлажлают нагретую смесь до температуры не менее 40 С, предпочтительно до комн. ной или более низкой. Отделяют осажденные белки центрифугированием, вьщеляют из верхнего слоя жидкости орготеин посредством хроматографии с применением ионообменных смол.

В другом варианте получают орготенн следующим образом, На первой стадии эритроциты, не содержащие сыворотки крови, суспендированные с 1 — 3 об ч. воды, используют в качестве исходного материала для нагревания. Нагревание проводят при 60 С в !

О течение 3 — х или более часов и прн более высокой температуре, например, 80 С вЂ” от 30 мин до i ч.

Значение рН при нагревании -7.

Охлаждают нагретую смесь после отделения осажденных белков или одновременно с осажде15 нием, орготеин выделяют из верхнего слоя жидкости осаждением ацетоном или другим органическим растворителем, смешивающимся с водой, и ультрафиль грованием или лиофольной сушкой.

Часть воды удаляют из верхнего слоя жидкости

20 перед выделением орготеина вакуумной перегонкой, налример, при температуре 20 — 60 С.

Поскольку нагреванию подвергают цельную кровь, то устраняется необходимость в стадии удаления сыворотки и промьгвания консервированных . 25 эритроцитов. Эту стадию можно осуществлять г

578836 применением эритроцитов, не содержащих сыворотки, но предпочтительным исходным материалом является цельная кровь.

Цельную кровь и особенно эритроциты, не со держащие сыворотки, смешивают с водой (например, 1 — 2 об.ч.) перед нагреванием. Вода может содержать буфер или ионы двухвалентного металла, например меди или цинка, при небольших концентрациях, например, ниже 0,5 М. При использовании цельной крови добавляют тринатрийцитрат или другой ингибчтор свертывания для предотвращения свертывания крови перед лиэисом гемоглобина. . Значение рН при нагревании равно 7. При более низких значениях рН, например ниже 5, гемоглобин денатурируется, осаждается лишь частично. Значение рН эритроцитов регулируют добавлением под ходящего количества кислоты или основания.

Стадию нагревания ведут при температуре

-60 — 80 С, прецпочтительно 70 — 75 С, до осаждения всего или почти всего гемоглобина. Повышение температуры и более длительное нагревание способствуют снижению общего выхода орготеина.

Более низкая температура и короткое нагревание приводят к получению менее чистого орготеина.

При 75 C нагревание ведут 1 — 2 ч. Стадию нагревания можно осуществлять периодически или непрерывно.

Термолабильные белки, в том числе ферменты, удаляют из эритроцитов путем термоденатурации вместе с гемоглобином. Основным компонентом таких термолабильных белков является карбоангидраэа. Эритроциты нагревают до инактивирования карбоангидразы.

При осаждении гемоглобина карбоангидраза и большинство других термолабильных ферментов и белков неферментного происхождения в верхнем слое жидкости также осаждаются, ввиду того, что гемоглобин более стоек.

Полноту осаждения гемоглобина устанавливают по окрашиванию верхнего слоя жидкости, которая, становится бледно-розовой, При использовании старой крови возможны случаи, когда все окрашенные вещества гемоглоби на могут не осадиться, если стадию нагревания

1 осуществляют в кислой среде. Если это происходит перед или после удаления гемоглобина, осажденного на стадии нагревания; то любые остаточные окрашивающие вещества можно осадить доведением значения рН до 7 или до 7,5 перед осаждением орготеина. Осажденные вещества красного цвета удаляют таким же образом, как при осаждении гемоглобина на стадии нагревания. После нагревания эритроциты охлаждают до температуры ниже

50 С, предпочтительно до .комнатной температуры, пропусканием через теплообменник. Гемоглобин и другие белки, осажденные на стадии нагревания, удаляют центрифугировалием и отбрасывают (можНо также использовать отстаивание или фильтро. вание).

После удаления осажденного гемоглобина выделяют орготеин из верхнего слоя жидкости, например, добавлением ацетона к охлажденному раствору, лиофилиэацией, ультрафильтрованием или же

5 адсорбцией на колонке с ионообменной смолой с последующим элюированием. Предпочтительнее всего выделять орготеин ионообменной хроматографией.

Выделять орготеин можно пропусканием верхнего слоя жидкости, полученного на стадии нагревания, через ДЭАЭ-целлюлозу. Верхний слой жидкости можно также подвергать очистке с использованием молекулярноситовой хроматографии, например, пропусканием через колонку, заполненную декстрановой смолой, сшитой эпихлоргидрином.

Неочищенный.орготеин, содержащийся в верхнем слое жидкости, подвергают очистке путем избирательного выпаривания инородных белков, предпочтительно с протеиназой, Strep. griseus c панкреатином, субтилизином, попаином или бромелиаином при весовом соотношении фермента и белков в верхнем слое жидкости примерно от 1:2 цо 1:1000, в зависимости от выбранного фермента и соотношения инородных белков и орготеина в смеси. Чистый орготеин выделяют из смеси, например, ультрафильтрованием. Остатки белков и избыток ионов удаляют из варочной смеси диализом перед выделением из этой смеси орготеина.

После удаления осажденных посторонних белков орготеин осаждают остаточным количеством ацетона — от 3/4 до 1,5 об.ч. в расчете на водный раствор.

Предварительное осаждение посторонних белков и орготеина проводят на холоду, например при

0 — 5 С, но можно его проводить и при комнатной температуре до точки кипения ацетона. Осажденный орготеин отделяют от остаточного количества растворителя и влаги, например, сушкой, вымораживанием или лиофилиэацией или же повторным раство40 рением в водном связующем для последующей очистки во избежание потерь орготеина.

П р.и м е р 1. Промытые эритроциты быков лизируют двукратным объемом воды, содержащей

1 мг двухвалентной меди и 1 мг двухвалентного

45 цинка на 5 мг орготеина, находящегося в эритроцитах, и нагревают до 70 — 75 С в течение 1 — 2 ч при значении рН-7, т.е. при изоэлектрической точке гемоглобина. Разбавляют в 2 — 3 раза, охлаждают и центрифугируют полученный шлам при температуре

5о 4 С. Верхний слой жидкости, полученный после центрифугирования и содержащий в значительной степени очищенный орготеин, подвергают дналиэу и лиофилизируют. Выход орготеина 70%.

Пример 2, Суспендируют промытые консервированные зритроциты, замороженные и не содержащие сыворотки, в двойном (по объему) количестве воды. Подкисляют до рН 5,5 уксусной кислотой. Суспензию нагревают 15 мин при 65 С. Полученную жидкость охлаждают цо температуры ок60 ружаюшей среды (или более низкой температуры) 578836

Сосзави гель С. Малютина

Техред М. 1евицкая

Редактор Н. Х1бларова

Коррекзор Н. Яцемирскяя

Заказ 3815/705

Тираж 677 Подписное

ЙНИИПИ 1 осуцврственного комитета Совета Министров СССР по целям изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., 4/5

Филиал П11П "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и удаляют осажденные белки 11ентрифугированием, Доводят рН до 7,5 с целью осаждения веществ, окрашенных в красный цвет, и центрифутируют.

Верхний слой жидкости после центрифутирования смеищвают. с 3/4 объема ацетона, охлажденного льдом, центрифутируют и осадок отбрасывают. Добавляют вторую порцию 3/4 объема холодного ацетона, центрифутируют и отделяют осадок, содержащий 50% орготеина. Для сохранения неочишенного орготеина осадок подвергают сушке вымораживанием, а затем его лиофилизируют.

Пример 3, Используют эритроциты человека, быков, лошадей, кур, овец или свиней. Методика аналогична примеру 2, но осаждение ацетоном заменяют на ферментативное переваривание белковых примесей, например, добавлением к верхнему слою жидкости после стадии нагревания 1 — 3 мг панкреатина на 1 мл исходных консервированных эритроцитов и выдерживания смеси при 37 С в течение 15 — 48 ч. В результате происходит переваривание почти всех белков, за исключением орготеина, на небольшие днализуемые фрагменты. Из полученной смеси путем ультрафильтрования выделяют в значительной степени очищенный орготеин.

Пример 4. Следуют методике, описанной в примере 1, но в качестве исходного материала применяют цельную кровь, стабилизированную против коагуляции цитратом натрия. Смешивают 2 об.ч. свежей бычьей крови (85 мг/мл общего белка, 20мг/мл орготеина) и 1 об.ч. 3,8% — ного водного раствора тринатрийцитрата с .2 об.ч. воды, содержашей 25 мг/мл двухвалентной. меди и 25 мг/мл двухвалентного цинка. Получают раствор цельной крови, содержащей 1000мг ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка на 100 мл. Раствор нагревают до 75 С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Затем охлаждают до -10 С добавлением

150 мл ледяной воды. Это разбавление устраняет необходимость отдельной стадии промывки после центрифугирования. Центрифугируют и отделяют верхний слой жидкости, содержащий 1,6 мг/мл белка и 12 — 17 мг/мл орготеина, что представляет собой 40 — кратную очистку и извлечение 70% орготеина исходной крови. При использовании непромытых эритроцитов (90 мг/мл общего белка) вместо цельной крови извлекают 9й орготеина.

Очищенный орготеин выделяют иэ верхнего слоя жидкости лиофилизацией, или фильтрованием через молекулярное сито, или хроматографией с применением ДЭ АЭ- целлюлозы.

Для последующей очистки орготеина смешивают 50мл верхнего слоя жидкости после стадии термической очистки, содержащей 12-17 мг/мл орготеина, с 50 — 150 мг панкреатина и 0,1% аэнда натрия (для предотвращения роста бактерий) и выдерживают при температуре 37 С в течение 15 ч, после чего охлаждают. Получают раствор, содержаший 1 мг/мл обшего белка и 12 мг/мл орготеина.

15 Неочишенный орготеин можно выделить.в чистом состоянии путем хроматографии через гель из молекулярного сита пропусканием 2 — 5 г неочишенного орготеина через колонку размером

3,2 ему 38,5 см, заполненную сверхтонким Сефа2о дексом G — 75, представляющим собой декстряновую смолу, сшитую эпнхлоргидрином. Собирают элюат на фракции по 5,4 мл и определяют их поглошение. Начиная примерно с 50 — ой фракции, кривая поглощения круто поднимается, достигая

75 пика примерно на 68 — ой фракции. Фракции 66--73 содержат большую часть всего орготеина в ультрачистом состоянии.

30 Формула изобретения

Способ получения орготеина путем лиэирования эритроцитов, осаждения, прогревания гемоглобина и других термолабильных белков, охлаждения, 35 очистки и выделения целевого продукта иэ верхнего слоя жидкости, отличаюшийся тем, что, с целью упрошения технологии производства, гемоглобин осаждают путем нагревания эритроцитов при температуре 60 — 80 С при рН раствора от 6,7 до

40 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США и 3579495, кл. 260 — 1! 5, 1971.