-инозилцистеин (5- )-2-амино-2карбокси-этил (-5-тиоинозин), проявляющий регенерирующее действие на живые ткани

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н И Я

Со:оз Сове"екик

Со@иалкоти iBcKRx

Реодублик (!!) 649723

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 22.08.75 (21) 2167224/23-04 (23) Приоритет — (32) 22,08.74 (31) 49-95527,(33) Япония (43) Опубликовано 28.02.79. Бюллетень № 8 (45) Дата опубликования описания 23.05.79 (51) М. Кл. С 07 Н 19/04,, А 61 К 31/71

Гооударстееииый комитет по делам изобретеиий и открытий (53) УДК 547.83.6.07 (088.8) (72) Авторы изобретен!ия

Иностранцы

Еити Сакакибара, Ивао Хасимото и Мицуру Хирохаси (Япония) Иностранная фирма

«Фунаи Фармасьютикал Индастриз, Лтд» (Япония) (71) Заявитель (54) S-ИНОЗИЛЦИСТЕИ Н (5 -S-(2-АМИ HO-2КАРБОКСИ-ЭТИЛ)-5 -ТИОИНОЗИН), ПРОЯВЛЯ!ОЩИЙ

РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА ЖИВЫЕ ТКАНИ

1 2 хн.,с н 8cHcHq314 с сооп

О 0 о о х

-;"6

H Я-HC — СН SHKC 0

СООН

НО OE

Изобретение относится к синтезу новых соединений — S-инозилцистеин (5 -S - (2амино-2-карбокси-этил) -5 -тиоинозину), проявляющему регенерирующее действие на живые ткани.

Предлагаемое соединение обладает лучшими свойствами, чем известные структурные аналоги, например производные аденозина, подобного действия (1).

Найдено, что полученный S-инозилцистеин (5 -S- (2-а мино-2 - карбоксиэтил) -5 тиоинозин) формулы проявляет заметное действие по ускорению развития и является очень полезным при обработке повреждений тканей, язв и т. п.

S-инозилцистеин формулы 1 получают путем взаимодействия производных 2,3 -0защищенного инозина (формулы II) с цистеиновыми соля мии щелочных металлов (формулы Ш) до получения S-(2,3 -0-защищенного инозилцистеина (формулы IV) с последующим удалением защитной группы по следующей схеме: н,иенам,зи 0! ""«Р » — — " "Ж - — " ".,>

0 н нснсн2зн.с /О 1 сооп

НО 0Н где R и R — водород, низшая алкильная или арильная группа, за. исключением случая, когда R и R вместе являются атомами водорода, М вЂ” щелочным металлом и Х вЂ” атомом галогена или группой 1 — 0 —, где 1 — арилсульфонильная или низшая алкилсульфонильная группа.

Методика получения S- (2,3,0-защищенного инозилцистеина формулы IV из производных 2,3 -0-защищенного инозина формулы II и цистеиновых солей щелочного

25 металла формулы III состоит в следующем.

В случае, когда Х соединения формулы II является группой 1 †0 вЂ, соединение формулы II взаимодействует с солями цисЗ0 теина в жидком аммиаке или с цистеином

649723

Таблица 1

Число клеток ь S.Е. (Х!0 клеток) Скорость роста, 0/о

Номер соеди- нения (Испытуемое соединение, (50 якг/мл) 50,9 4,1

65,4 1,6

54,1+.2,0

44,1 +-5,6

50,5+1,3

57,,8 +. 1,8

49,8ьь-0,2

100,0

Контроль

S-инозил-L-цистеин

Инозин

Лденозпн

L-цпстеин

Инозин + L-цистеин

Лденознн+ L-цистепн

128,5

106,3

86,6

99,2

113,6

97,8 в спиртовом растворителе в присутствии алкоголята щелочного металла до получения соединения формулы IV. Примерами такого спиртового растворителя служат метанол, этанол, изопропанол и трет-бутанол.

Соли цистеина могут быть получены взаимодействием цистина или S-бензилцистеина со щелочными металлами в жидком аммиаке.

В случае, когда Х соединения формулы II представляет собой атом галогена, соединение формулы II подвергают взаимодействию с цистином в спирте в присутствии алкоголята щелочного металла с получением соединения формулы IV.

Реакцию в спиртовых растворителях проводят преимущественно при температуре от комнатной до температуры дефлегмации, а реакцию в жидком аммиаке обычно проводят в условиях охлаждения, предпочтительно при температуре от — 80 до — 30 С.

Удаление защитных групп из полученного таким образом соединения формулы

IV может легко осущестляться с помощью любой известной методики, например, путем гидролиза их органическими кислотами, например разбавленной муравьиной кислотой, или минеральными кислотами, например, разбавленной соляной кислотой или разбавленной серной кислотой.

Продлагаемый S-инозилцистеин настоящего изобретения проявляет превосходные свойства ускорения роста клеток и противоязвенное действие.

1. Эффект ускорения роста клеток.

Пример 1. Действие $-инозилцистеина на ускорение роста клеток сердца зародышей цыплят, О и ы т 1. Удаленные из 13-дневных зародышей цыплят сердца разрезают на куски размером 1 — 2 л1,и в диаметре при стерильных условиях. После промывки соляным

5 фосфатным буферным раствором, свободным от кальция и магния (PBS) кусочки сердец обрабатывают раствором из 0,1% трипсина в PBS, не содержащим ионов кальция и магния, а плавающую сверху

10 фракцию отбрасывают. Остаток обрабатывают. раствором из 0,1% трипсина в PBS, не содержащим ионов кальция и магния, а плавающие сверху фракции, содержащие отдельные клетки, собирают. Процедуру

15 повторяют 3 раза. Плавающие сверху фракции объединяют и разбавляют холодной культуральной средой (F12), содержагцей 10% фетальной телячьей сыворотки, натриевый пенициллин G (100 единиц на

20 1 л1л) и сульфатный стрептомицин (1 л1г на 1 мл) и центрифугируют при 150xG. Полученную лепешку дважды промывают культуральной средой и осторожно разбавляют той же культуральной

25 средой до получения суспензии, содержащей 200 000 клеток в 1 ил.

1 лл суспензии выливают в каждую из

28 трубок с культурой, разделенных равно на 7 групп. Клетки выращивают при 37 С

30 в инкубаторе. После одного дня инкубации культуральную среду из трубок. извлекают, а в трубки добавляют 1 лл каждой культуральной среды, содержащей приведенные в табл. 1, соединения. После допол35 нительной трехдневной инкубации культуральную среду извлекают и клетки затем обрабатывают 1 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты, содержащего 0,1% кристаллического фиолетового. После энергичного

40 встряхивания гемоцитометром подсчитывают число клеток.

Результаты приведены в табл. 1.

649723 дс".:-,Itc в таил. 2 соединения. После дополиитсл::иой однодневной инкубации подсчигь вают число клеток, Рсзульт0TII приведенbI в табл. 2.

0 п ы т 2. Используя методику для клеток сердца зародыша цыпленка по примеру 1 после 3 дней инкубации культуральную среду удаляют и туда добавляют по 1 м.г культуральной среды, содержащей привеТаблица 2!

Номер соединения

Число клеток

+ S.Е., X 10 клеток

Скорость роста, %

Испытуемое сосд«ttett tte (20 лкг/,ил) 1

81,6+- 2,0 100,0

97,8+.3,8 (1 19,9

Контроль

S-инозпл-L-цистеин, S-пнозил-L-гомоцпстепн S-адсцоз,.л-L-цистеш1

S-адснозил-L-гомоцистеип

S-гуанозил-L-го оцистеин

10,цействие S-изози ttttcIetttta»a ускорение роста клеток сердца заро. дыша цыпленка в присутствии ннгпбптора роста.

0 п ы т 3. Используют методику для да добавляют по 1 м.г культуральной среклеток сердца зародыша цыпленка, описан- лы, содержащей I(CX (1,7 л!г на 1 мл) и ную в опыте А, После однодневной инкуба- соедггнения, приведенные в табл. 3. ции культуральную среду извлекают и ту- Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Скорость роста, по отношению к контрольному опыту (табл. 1) ":

Номер

Испытуемое соединение пения (50 нкг/лиг) Число клеток

S.E„

Х 10 клеток (корость роста, 01

In Этот опыт проводят одновременно с опытом 1. опыта 10 тураль"î" среде добавляют KC!I 1 I(1,7 ма на лг,г). куль- Результаты приведены в табл. 4.

0 п ы т 4. Используют методику

2, за исключением того, что к каждой

Таблица 4

Число клеток ь- S.E. (Х104 клеток) Скорость роста, I0

Скорость роста

% по отношению к контрольном опыту (табл. 2) *Номер соединения

Испытуемое соединение (20 мкг/,ил) 1

65,8 + 0,8

100,0

80.6

130,1

104,9

1 1 1,7

90,1

8 S-аденозил-L-цистеин 8,7

9 S-адснозил-L-гомоцпстеин

10 S-гуанозил-L-гомоцистеин

81,3

Этот опыт и опыт 2 проводят одновременно.

2

4

Контроль

S-инозил-L-цистеин

Инозин

Лдс.юз. ш

L-цпстеин

Ииозпн + L-цистеин

Лденозип + /.-цистепн

Контроль

1, S- .. /.-ц с.;

8-пнозил-L-гомоцистепн

32,0ь-5,0

50,9 -1,5

37,2 4,4

33,3+-1,9

41,9 +-6,3

42,3 +-3,7

36,0 +-4,0

85,6 +-0,4

73,5 7

64,2+-3,0

65,2 1,8

66,3ь 1,4

78,2 +- 7,5,95,8 !

74,8 ь 4,7 91,7

71,5+-3,4, 87,6 !

G9,2 + 1.8 84,8 (100.0

116,3

104,1

130,9

132,2

112,5

97,6

99,1

| (100,8

62,9 ! 00.0

73. 1

65Л

8.3

83.1

70.7

649723

Таблица 5

Число клеток

+ S.Е. (X 104 клеток) !.Скорость роста, % !!

Скорость роста, по отношению к контрольному опыту (табл. 2) "

Номер соединения

Испытуемое соединение (20 мкг/мл) 68,3 0,4

85,8ь 2,9

Контроль

S--инозпл-L-цистепн

5- и оз гл-L-го монисте.и i

8-аденозил-Е-цпстеип

S-адепозпл-L-гомоцистеин

100,0

83,7

125,6

105,1

65,3 +3,7

70,7+1,2

75,7+. 1,6

72,3+. 5,5

95,6

80,0

103,5

86,6

110,8

92,8

105,9

88,6

Таблица 6

Номер соединения

Степень защиты, е

Средний язвенный индекс

+ S.Е.

Испытуемое соединение (50 кг/кг, р. о.) Контроль (физиологический раствор) 13 9й0 5

S-п поз ил-L-цистепн

S-ннозил-L-гомоцистеин

S-аденозил-L-цпстеин

S-адепознл-L-гомоцистеин

S-гуаиознл-L-гомоцистеин

8,1 +- 1,1

12,3 -1,1

12

12,1+-1,2

11,3 ч-0,7

15,0 й1,8!

О язвенный индекс (контроль)— — язвенный индекс (исп. соед.)

Степень защиты— X 100 язвенный индекс контроль

0 п ы т 5. Используют методику опыта

2, за исключением того, что к каждой куль10 S-гуанозил-L-гомоцпстенн

Опыт этот проводят одновременно с опытом 2.

Как видно из табл. 1 — 5, способность ускорения роста клеток, вызываемая пред- 5 лагаемым S-инозилцистеином превосходит таковую для известных соединений 2 — 10.

l1. Противоязвенное действие

Пример 2. Действие S-инозилцистеина на язву от перевязывания привратника желу,дка.

0 п ы т 6. Используют детенышей Впстерских крыс (Кеаг(Gifu — Lab.) возрас- 15 том 7 недель. После 48 ч пребывания без пищи крыс весом от 210 до 230 г разделяют на 6 групп по 10 крыс. Привратникжелудка перевязывают под слабой анестезией пентобарбиталом натрия (25 мг на кг, i. р.), 20 туральной среде добавляют 6-меркаптопурин (5 мг на 1 мл).

Результаты приведены в табл, 5.

Сразу после перевязки одной группе орально вводят физиологический раствор, а оставшимся 5 группам вводят орально раствор каждого испытуемого соединения (50 мг на кг). После этого крыс оставляют без пищи и воды в течение 10 часов после перевязки, а затем удаляют желудок под анестезией пентобарбиталом натрия (30 мг на кг).

Содержимое желудка удаляют и желудок фиксируют с помощью инъекции 10 мл

2%-ного раствора формалина в люмене. Же лудок открывают вдоль его большей куратуры. жесткость повреждения рубца, т. е. степень (оценку) язвы выражают через язвенный индекс согласно методу Юкотани.

Результаты приведены в табл. 6.

649723

Таб".Ilöë 7

С гспснь защиты, 00

Средний язвенный индекс ч- S.Е.

Испытуемое соединение (50 «г/кг) Ко:! òðîëü (физиологический раствор) 12,5+-2,6

5,1 +- 1,6 (I) S-; Ioзил-L-IIIIcIeIIiI

Степень защиты вычпслrl«IT, как в табл. 6.

Результаты приведены в табл. 8.

Таблица 8

Ооиьзя НСI Общая к!!«ëîò«îñòü

Свободная НСI

Объем! степень защиты, степень

mEV/II+ — защиты, — 0/

Испытуемое соединение (50 лг/кг, р. о) степень защиты, % степень (за| гит

% рН т Е-„ | -,.

+- S.Е. тЕ0 /-. - ч- S.Е. нк ьS.Е

93,8 л 4,2

8,6 ="0,5

106,С ":3.6 (Контроль (1) S-пиозил-L-ци стени.03 670+ 42

5,3ч-0 о (23 83 26 о (! !

1 (36 738 .64 (38

42,8 ч-6,0

I.5 00 06 вслич|ша контрольного опыта — величина исп. сосд.

"" Степень защиты — р, 100 величина I:0IITpoëüíîãо опыта

Clt;HgINg0t;S Н20.

0 п ы т 7. Используют методику опыта 6. Зффект S-инозил-L-цистеина на язву от перевязывания привратника желудка

0 п ы т 8. Крыс перевязывают как и в предыдущем опыте 6 и разделяют на

2 группы по 10 крыс. Сразу же после перевязки орально вводят физиологический раствор или раствор S-инозил-L-цистеина.

После того, как крыс 5 ч после перевязки держат без пищи и воды, перевязывают пищевод и удаляют желудок под анестезией пентобарбиталом натрия (30 л1г/кг). Содержимое желудка собирают п центрифугируКак видно из табл. 6 — 8, вызываемая предлагаемым S-инозилцистеином противоязвенная способность превосходит таковую известных аналогичных соединений 7 — 10.

Приводимые ниже примеры иллюстриру1от получение нового S-инозилцистеин-(5 -S(2 -ампно-2-карбоксиэтил) -5 -тиопнозила).

П р ti м е р 3. S- (2,3, 0-изопропилиденинозил) -/=цистеин.

А. В емкость, оборудованную сушильной трубой, заполненной нейтронной известью, гидроокисью натрия и охлаждаемой безводным ледяным ацетоном, помещают около 1 л жидкого аммиака и к нему добавляют 6,6 г L-цистина. К полученной таким образом смеси добавляют металлический натрий в таком количестве, чтобы раствор стал бледноголубым. Затем для обесцвечивания смеси добавляют небольшое количество L-цистина. проверяют при впутр им ышечном введении.

Результаты приведены в табл. 7. ют при 2000 об/,чин в течение 10 иин. Измеряют объем всплывшей жидкости и ее рН с помощью рН-метра (Хитач — Хориба тип. М-5) . Свободную НСl, общую HCI u общую кислотность всплывшей жидкости определяют титрованием 1/50 ХаОН с использованием раствора Топфера и раствора фенолфталеина в качестве индикатора.

К полученному раствору добавляют

21,1 г 2,3 — 0-изопропилиден-5 -0- (и - тол)ол-сульфонил) -инозина. После перемешивания в течение 4 ч смесь выдержива1от в течение ночи прп комнатной температуре так, чтобы аммиак испарился. Полученный таким образом остаток выливают в ледяную воду и полученную смесь слаоо подкисляют добавлением концентрированной соляной кислоты. Затем добавляют этанол для отделения кристаллов, котоl!;:å собирают путем фультрации. Пере«рпсталлизация из воды (ает 16,6 г целевого продукта с т. пл. от 195 до 198 С (раз ложенпе). Зтот продукт дополнительно перекристаллизовывают с получением белых кристаллов, имеющих точку плавления от

205 до 208 С (разложение).

649723

65

Вычислено, /о.

С 44,75; Н 5,50; N 16,31.

Найдено, /о.

С 44,61; Н 5,32; N 15,97.

Ь. 176 лг хлоргидрата L-цистина и

100 лг металлического натрия растворяют и 20 лл этанола и к полученному раствору дооавляют 463 лг 2,3 -0-изопропилиден-5 -0-(n-толуолсульфонил)-инозина. Полученную таким образом смесь дефлегмируют в течение 5 ч. После охлаждения собранные фильтрацией кристаллы растворяют в 3 лл уксусной кислоты. K полученному раствору добавлшот этанол для отделсш|я «ристаллов, которые собирают фильтрацией. Проводят «роматографическое разделение над силикагелем и получают 82 лг целевого продукта с т. пл. от 193 до 197 С (разложение) . Хроматограмма этого продукта идентична хроматограмме образца, полученного по методу A.

В. 180 лг «лоргндрата L-цистеина и

100 лг металлического натрия растворяют в 20 лл этанола и к полученному раствору добавляю r 270»ie 5 -хлор-5 -деокси-2,3 -0изопропилиденинозина. Полученную таким ооразом смесь дефлегмируют в течение 5 ч.

После охлаждения к реакционной смеси добавляют 3 »4л уксусной кислоты и растворитель испаряют при пониженном давлешгп с получением остатка. К, остатку добавляют горячий этанол и осадок собирают фильтрацией. Это вещество подвергают

«роматографическому разделению над силикагслем и получают 250 лг целевого проду«та с точкой плавления от 195 до 199 С (разложение). Хроматограмма этого соединения была идентична хроматограмме образца, полученного по методу А.

Г. В емкость, описанную в методе А, помещают около 200 л л жидкого аммиака и к нему добавляют 210 яг L-цистина.

К полученной таким образом смеси добавляют металлический натрий в таком количестве, чтобы раствор стал слабоголубым.

Затем для обесцвечивания смеси,добавляют небольшое количество L-цистина.

К полученному раствору добавляют

560 »1г 2,3 -0-изопропилиден-5 -0 — метансульфонилинозина. 5Ки дкий аммиак испаря ют при перемешивании в течение б ч. Полученный таким образом остаток выливают в ледяную воду и полученный раствор слегка подкисляют добавкой концентрированной соляной кислоты. Туда же добавляют этанол для отделения кристаллов, которые собирают фильтрацией. После хроматографического разделения над силикагелем получают 150 лг целевого продукта с т. пл. от 198 до 203 С (разложение). Хроматограмма полученного соединения идентична хроматограмме образца, полученного по методу A.

Пример 4. $-инозил-L-u cre« .

A. 2,0 г S- (2,3 -0-изопропилиденино5

Зо

50 зпл) -/ -цистепна, полученного по примеру 2, растворяют в 10 лл 60 /о-ного раствора муравьиной кислоты. Полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 6 дней. Затем к этому раствору дооавляют этанол до отделения криста ллов, которые собирают фильтрацией.

Этот продукт подвергают «ромато.рафическому разделснпю íàJ, спликагелем и получают 1,4 г кристаллов с т. пл. от 227 до

230 С (разложение).

CiaHi N 0eSВычислено, С 42,04; Н 4,62; 1«18,86.

1-1айдспо, о.

С 42,35; Н 4,95; «1 18,41.

Ь. В сосуд, описанный в методе А, помещают около 200 лл жидкого аммиака и

«полученному раствору добавляют 1,0 г

L-цистина. К полученной таким образом смеси добавляют металлический натрий в таком количестве, что раствор стал светлоголубым. Затем, для обесцвечивания смеси добавляют небольшое количество

/--цпстина.

К этому раствору добавляют 3,4 г 2,3 0-бензплпден-5 -О-мстансульфонилинозина.

Яид«ий аммиак испаряют прп перемешиванип в течение 6 ч. Полученный таким об. разом остаток выливают в ледяную воду и полученный раствор слабо подкисляют добавлением концентрированной соляной кислоты. К раствору, добавляют этанол до отделения кристаллов, которые собирают фильтрацией. Этот продукт перекристаллизовывают из смеси метанол — вода и получают 0,8 г S- (2,3 -0-бензилиденинозил)L-цистеина с т. пл. от 176 до 179 С. Это вещество растворяют в 5 лил 30 /о-ного раствора уксусной кислоты и полученный раствор подвергают взаимодействию при 70 С в течение б ч После завершения реакции раствор испаряют при пониженном давлении .досуха с получением остатка, который подвергают хроматографическому разделению над силикагелем и получают 0,5 г кристаллов с т. пл. от 221 до 225 С (разложение). Хроматограмма продукта была идентична хроматограмме образца, полученного по методу А примера 3.

Формула изобретения

1. S-инозилцистеин (5 -S- (2-амино-2-карбокси-этил) -5 -тиоиназин) общей формулы о (I

Hlt+j N) и я-нс-c s»Äc о г соои

1 ио он проявляющий регенерирующее действие на живые ткани.

649723

14

Составитель Г. 1(оннова

Ъ;орректор С. Файн

Редактор Т. Никольская

Техред H. Строганова

Заказ 48/162 Изд. Xе 181 Тираж 520 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д, 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. <Патент»

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Патент США Лгв 3796700, кл, 260-211,5, он блик. 12.03.74,