Способ выделения цитохрома

 

ОПЙСАЛИЕ

ЙЗОБРЕТЕЛЙЯ,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 100177(2I) 2438315/23-04 с присоединением заявки И (23) Приоритет (51) М, Кл.

С 07 С 103/52

Государственный комитет

СССР по делам нзобретений и аткрытий

Опубликовано 300379, Бюллетень М 12 (58) УДК 547.964. .4.07 (088.8) Дата опубликования описания 30.0379 (72) Авторы нзобретения

В.А. Куричев, О.Г. Фоломеева, О.P. Поселенова и Л.B. Новохатская

Московский технологический институт мясной и молочной промышленности (71) Заявнтель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОИА С

Изобретение относится к улучшенному способу выделения цитохрома С биологически активного соединения, который может найти применение в медицине для лечения различных нарушений окислительных процессов в организме.

Известный способ выделения цито- 10 хрома С (1) состоит в кислой экстракции (трихлоруксусной кислотой) сердец крупного рогатого скота, отделении балластных белков сульфатом аммония, осаждении цитохрома С раство- 15 ром трихлоруксусной кислоты, очистке от примесей насыщенным раствором сульфата аммония, диализе водного раствора продукта, деминерализации раствора цитохрома С с помощью катионита Ю

СД — 3Т и анионита ЭДЭ вЂ” 10П и, наконец, лиофильной сушке. Основные недостатки известного метода состоят в том, что циализ продолжается в течение 2-3 суток, при этом потери цитохрома С 25 составляют до 25%| кроме того, весь процесс выделения состоит из большсго количества технологических операций, общая продолжительность которых составляет 120 ч. зо

Цель настоящего изобретения — повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается описываемым способом выделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота, заключающимся в том, что сердца крупного рогатого скота экстрагируют трихлоруксусной кислотой, от экстракта отделяют балластные белки обработкой сульфатом аммония, затем полученный экстракт обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, с последующим элюированием раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8, после чего проводят деминерализацию электродиализом с использованием ионообменных мембран.

Отличительными признаками способа являются обработка экстракта после отделения балластных белков макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, последующее элюирование раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8 и проведение деминерализации элюата электродиализом с

Оспользованием ионообменных мембран.

65461 бщ.), Ъ

Соде р жание цитохрома

С, мг

Фр

ЦИ

2,4

20 1,2

20 2,2

2,4

2,4

3,8

2,4

4,2

4,8

2,4

5,1

2,4

5,4

2,4

0,1

5,4

2,4

1,65

1,4

5,6

0,50

0,03

2,0

0,6

6,0

10

6,8

Предпочтительными вариантами способа являются многократная (преимущественно двухкратная) сорбция цитохрома С с помощью макропористых сульфокатионитов и осуществление электродиализа в течение 4-6 ч при плотности тока 1-2 А/дм

Применение описываемого способа выделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота позволяет сократить время проведения процесса со 120 до 60 ч и повысить выход целевого продукта на 8Ъ.

Пример 1 . Свежие сердца крупного рогатого скота дефростируют, измельчают, проМывают водой для удаления крови, а затем экстрагируют )5

2,5Ъ-ной трихлоруксусной кислотой

Выход цитохрома С в этом опыте составил 62Ъ от условного содержания в экстракте. В результате проведения 10 опытов было получено 50

10 фракций с содержанием цитохрома С

1,4 мг/мл. Объединенные фракции (100 мл) подвергают повторной хроматографической очистке на колонке (10 х 200 мм) . Для этого макропорис- 55 тый катионит КУ-23 30/100 предварительно переводят в Н-форму, последовательно промывают 1 н. раствором

NaOH H Π— 1 н. раствором НСгН О. и 2

Параметры ионообмена аналогичны описанным . В результате получено 25 мл раствора, имеющего следующие:характеристики: концентрация цитохрома С

4,5 мг/мл, концентрация (ИН ) SO<

2,4 r-экв/л. Потери составляют 20Ъ, выход 80Ъ. Таким образом, общий вы2 4 течение 2 ч. Для экстракции на

1 вес.ч. фарша берут 1 объем зкстрагента. Перед осаждением балластных белков рН в экстракте устанавливают

7,0 — 7,2. Балластные белки отделяют при добавлении 550 r (NH4)2 SO< ea

1 л жидкости. Для хроматографического отделения цитохрома С используют колонку 10 х 200 мм, в которую загружают 10,0+0,1 r (в пересчете íà сухое вещество) макропористого катионита 1(У-23 30/100. Скорость пропускания исходного раствора и элюента

2 мл/см мин, через колонку пропуска2 ют 150 мл экстракта, освобожденного от белков. Цитохром злиируют 0,55 М раствором ИаСГ (40 мл) . Параметры ионообмена приведены в табл.1.

Т а б л и ц а 1

1,57

2,45

2,50

2,50

2,50

2,55

2,55

2,55 ход цитохрома после 2-кратной очистки на сульфокатионите составил 50Ъ.

Полученную фракцию цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате

АО-i, предназначенном для обессоливания биологических жидкостей. Объем рабочей камеры 5 мл, электроды платиновые. В аппарате используют ионообменные мембраны ИА-40 и МК-40 с рабочей поверхностью 5,5 см. Мембраны предварительно переводят в рабочую форму и приводят в равновесие с раствором цитохрома С. В качестве каталита используют 0,2 н. раствор NaOH, а аналита — 0,02 н. раствор Н SO . Де2 4 минерализацию проводят в течение 4 ч при плотности тока 2,0 A/äì. B резульате концентрация (ИН4)2 БО4снижается до 0,1 г-экв/л. Потери цитохрома С на этой стадии составляют 15Ъ. Получен654612 в примере 1. Потери цитохрома С на этой стадии составляют 12%. Обший выход цитохрома С по предлагаемой схе550 ме выделения 44%, 5

Окисл

Пример 3. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит, полученный в результате полимеризации дивинилбензола, КУ=23 100/100 в количестt ве 10,0+0,1 г (в пересчете на сухое вещество). В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Параметры 2-кратного ионообмена на данной смоле аналогичны параметрам, описанным в примерах 1 и 2. Выход цитохрома С равен 55t. Электродиализ проводят при параметрах, описанных в примерах. 1 и 2. Выход на этой стадии

853. Общий выход цитохрома С по предТ а б л и ц а 2

Элюент од, 550 восст

ZHo окисл а т о э т

Н О дистиллированная

0,62

50,0

0,55 М раствор

1)аСЯ

3,3

0,56

60,0

Ацетатный буфер, рН 5,8

2,4

0,52

67,0

Выход и чистота цитохрома С по схеме противопоставляемого метода (после очистки насыщенным раствором (NII4) $0 ) 0,55 50,0 ный раствор подвергают лиофильной сушке . Идентификацию и количественное определение осуществляют спектроФотометрическим методом. Общий выход

Е55о цитохрома С 42,5%, — т = 0,9. эосст

zeo окисл

Пример 2. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента ис— пользуют макропористый сульфокатионит КУ=23 40/100 в количестве 10,0 +

+0,1 г (в пересчете на сухое вещество) . Параметры ионообмена в данном случае аналогичны параметрам, описанным в примере 1. Кроме того, для данной смолы исследовали влияние раз— .личных видов элюента на процесс десорбции (табл.2).

В данном примере оптимальные результаты (учитывая степень чистоты и выход) получают при использовании в качестве элюента раствора NaCC

Повторное хроматографирование объединенных фракций, содержаших

3,3 мг/мл цитохрома С, на катионите КУ=23 40/100 позволило получить фракцию цитохрома С, которая имеет следуюшие характеристики: концентрация цитохрома 5,0 мг/мл, концентраЦия (ИН ) $04 2,3 r-экв/л. ОбЩий Выход цитохрома С после 2-кратной хроматографической очистки составил 50%.

Полученный раствор цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате

А0-1 с помощью ионообменных мембран

ИА=40 и ИК=40. Параметры ионообмена аналогичны параметрам, приведенным

E 55О лагаемой схеме 47%g сосет 10.

2 во

ОКИСЛ

Пример 4. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит IG -23 15/100.Параметры сорбции и десорбции аналогичны примерам 1,2,3. В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8.

Катионит КУ-23 15/100 применяют в

II-, 1)а- и NH<- формах. Ионообмен проводят двухкратно. Наибольший выход цитохрома С (21Ъ) получен при использовании NH — формы. Условия электро4 диализа и выход цитохрома С аналогичны описанным в примере 1 и 2.

Общий выход гемопротеида с использованиеь4 данного катионита 17%, 55О

E Восст

2 во - 0,8. онисл

Формула изобретения

1. Способ выделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота путем экстракции последних трихлоруксусной кислотой, отделения балластных белков, последуюшей деминерализации и лиофильной сушки, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью увеличения выхода и упрощения процесса, экстракт, полученный после отделения балластных белков, обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержа» щим дивинилбензол в пределах 15-100%, с последующим элюированием водным раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8 и деминерализацией полученного раствора электролизом с использованием ионообменных мембран. в

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сорбцию с помощью макропористого сульфокатионита проводят двухкратно.

3. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что электродиалиэ

654612 осуществляют в течение 4-6 ч при плотности тока 1-2 А/дм.

Источники информации, принятые во внимание при экспертиэе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 351546, кл. А 61 К 35/34, 1"71

Закаэ 2305/215

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель В. Волкова

Редактор В. Иинасбекова ТехредЛ Алферова 1:орректор А ° Гриценко

Тиразк 512 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

113035 Иосква Ж-35 Раушская наб. д. 4/5