Способ иммобилизации нуклеиновых кислот

 

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ НУ]КЛЁ. ИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обр^абот'ку, приводящую к ковалентнс»1у связывания нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и отмывку продукта водными растворами Had и. водой, отличаю?* . щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения содержан^я нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличения выхода по связы ванию РНК и повышения устойчивости продукта к действию нуклеаз, сорбцию нуклеиновых' кислот проводят, на аминоэтилцеллюлозе при 60-100°С в течение 15-40 мин с последующим введением в' реакционную смесь глутарового альдегида до содержания его;в смеси, равного 0,25-4%, и выдерживанием смеси при 20-100''с в те-.чение 120-10 мин.'(/)с сО)at) елСП)со ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) 3(5)) С 12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 2499202/23-04 (22) 13.06.77 (46) 23.02,84, Бюл, В 7 (72 ) В.В. Романов и В.К. Старостина . (53) 577.12.07(088.8) (56) 1 ° Cavalleri Е., Carrol Е., :А Р))А-acrylamide gel column for

analysing proteins that bind to DNA.I DNA-polymerase. Proc. Nat.Aced

Sci. ОБА, 67, 807-812, 1970 °

2, Poonian M.S., БсЬ1аЪасЬ.7

Neissbach А,, Covalent attachment of, :nucleic acids to agarose for affinity

chromatography Biochemistry, 10, 424-427» 1971, 3.Koberson D.L. Davidson N.

Covalent coupling of ribonucleic ,acid to agarose. Biochemistry, 11,533

1972.

4, Berridge M U. Aronson А.J.

An assay;for the endonucleolytic с1евчвфе of РКА Со lagre oligonac1eotides,. Апа1. Bioch. 53, 603-612, 1973.

5. Smith J., Smith Н., Pifco S.,, Ргeparation and use of RNA-cellu1оее Со1иааа, Anal. Bioch. 48,. 27-32;

197 2. (54 ) (57 ) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ Ву)Щ

HHOBbIX КИСЛОТ, включают)ий сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обработку, приводящую к ковалентному связыванию нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и отмывку продукта водными растворами Nacl и. Водой, о т л и ч а ю ш и- и с я тем, что, с целью упроцения процесса, увеличения содержа нйя нуклеиновых кислот s готовом продукте; увеличения выхода по связыванию РНК и повышения устойчивости продукта к действию нуклеаэ, сорбцию нуклеиновых кислот проводят. на аминоэтилцеллюлоэе при 60-100 С в течение 15-40 мин с последующим введением в реакционную смесь глутарового альдегида до содержания его в смеси, равного 0,25-4%, и выдерживанием смеси при 20-100ОC в те.,чение 120-10 мин.

Ф

665635

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам иммобилизации нуклеиновых кислот, Способ может быть пригленен для получения эффективных сорбентон для аффинной хроматографии белков,.

Известен способ иммобилизации нуклеиновых кислот путем включения их н гранулы полиакриламидного геля Г17„

Недостатками этого способа являЮтся низкое содержание нуклеиновой кислоты в препаратах, неустойчивость препаратов к действию нуклеаэ, невозможность иммобилизации низко.молекулярных нуклеиновых кислот и плохие гидродинамические свойства репаратов, Известен ряд способон иммобилизации нуклеиновых кислот посредством связывания их с активиронанной матрицей (2-4 3, Эти способы сводятся к следующему: r гидрофильную матрицу, чаще всего агарозу, обрабатынают бромистым цианом с целью активации, затем промывают нодными растворами солей (NaC1 или КС1) и водой, К актинированной матрице приливают раствор нуклеиновой кислоты (ДНК или PHK) и инкубируют смесь. Затем промывают препараты водными растворами солей (NaC1 Или КС1) для удаления несвязаншихся нуклеиновых кислот, Таким образом, получают препараты иммобилизонанных нуклеиновых кислот с содержанием ДНК или

РНК 0,3-0,6 мг/г матрицы (0,050,1 мг7мл геля). Полученные пре гараты подвержены действию нуклеаз и период их пблужизни составляет 5-10 дней нативную ДНК таким способом иммобилизовать невозможно.

Недостатками этих способов являются использование токсичного вещества, бромистого циана, низкое содержание нуклеиновых кислот в продукте, нестабильность препара тов при взаимодействии с нуклеазами, невозможность иммобилизации нативной ДНК.

Известен также способ иммобилиэа; ции нуклеиновых кислот, ДНК и РНК (5 3, заключающийся в том, что порошок целлюлозы пропитывают растворами нуклеиновых кислот, сглесь размазывают тонким слоем и сушат в токе воздуха н течение 16-24 ч. Затем сухой продукт суспендиругггт в спирте и суспензию облучают ртутной лампой мощностью 100000 эрг/глм в течение 1 5-30 мин, Спирт отфильтровывают, готовый продукт промывают нодным раствором NaC1 и водой, Выход по связыванию ДНК 90%, по связыванию PHK 23-25%. Этим способом получают препараты, содержащие

13 мг ДНК/г матрицы и 1 мг PHK/г матрицы.

Недостатками этого способа являются длительность получения препарата (2 сут)> низкое содержа5 ние нуклеиновых кислот в готовом продукте, низкий выход по связыванию PHK и ниэкая устойчивость продукта к ноэдействию.нуклеаз.

Цель изобретения — упрощение

10 процесса иммобилизации, увеличение содержания нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличение выхода по связыванию РНК и повышение устойчивости продукта к действию нуклеаз, Цель достигается эа счет того, что сорбцию нуклеиновых кислот производят на аминоэтилцеллюлозе при

60-100 С в течение 15-40 мин с поо следующим введением н реакционную смесь глутароного альдегида до содержания его в смеси, равного 0,254%, и выдерживанием смеси при 20.—

100 С н течение 120-10 мин, Процесс проводят следующим образом, B качестве носителя берут

АЭ-целлюлозу отечественного производства (Биохимпрепарат, г,Олайне) или производства "Реанал" (Венгрия), Иммобилизации подвергают ДНК иэ тимуса и молок лососевых рыб (СКТБ БАВ и Koch-Light и РНК из печени и

Е,coli hfRE-600 (СКТБ БАВ).

Способ нключает следующие стадии.

35 1. Нуклеиновые кислоты (ДНК или

PHK) собирают иэ водного раствора на АЭ-целлюлозе н течение 15-40 мин.

Содержание нуклеиновых кислот в водном растворе составляет до 60 мг/мл.

4Q Увеличение времени сорбции от 15 до

40 мин позволяет получить препарат с более высоким содержанием нуклеиновых кислот, Дальнейшее увеличение времени сорбции практически не приводит к унеличению связывания нуклеиновых кислот, Уменьшение времени (менее 15 мин) приводит к получению препарата с низким содержанием нуклеиновых кислот, что нежелательно.

2, Обрабатывают получаенную суспензию нерастворимого комплекса

АЭ-целлюлоза - нуклеииовая кислота водным раствором глутарового альдегида при 20-100 С в течение 12010 мин. Концентрацию глутарового аль дегида в реакционной смеси поддерживают равной объемным 0,25-4,0%. Укаэанные концентрации глутароного альде гида оптимальны и свойства полученных препаратов идентичны. Уменьшение

60 концентрации приводит к увеличению рабочих объемов, а увеличение концентрации создает неудобства при перемешивании массы. Перемешинание необходимо для равномерного распреде.

65 ления глутарового альдегида по

665635 объему. Увеличение температуры иммо- билизации приводит к сокращению времени обработки.

3. Полученную суспенэию отфильтро вывают на фильтре водным раствором

NaCl и водой для удаления несвязавшихся нуклеиновых кислот, Таким образом, иммобнлиэуется

80-90% нуклеиновых кислот, внесенных в реакционную смесь. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах составляет до 130 мг/г сорбента. Способ позволяет получать препараты, содержащие заданное количество нуклеиновых кислот, Длительность процесса получения иммобилиэованных нуклеиновых кислот составляет 0,53 ч в зависимости от условий реакции.

Препараты иммобилиэованных нуклеи . новых кислот на Аэ-целлюлозе устойчивы к действию нуклеаэ как в условиях хроматографии, так . и в жестких усЛовиях, при исчерпывающем гидролизе ИХ нукдеазой Berratià maгсеscens (20 ч при температуре 37 С). В условиях хроматографии сродства на колонке иммобилиэованной днк препаратов терминальной дезоксинуклеотидйлтрнасфераэы иэ тимуса, содержащит пРИМеси нуклеаз, иммобилиэованная Днк йолностью стабильна и полу-. чаемый препарат фермента не содержит примесей нуклеиновых кислот.

Ори исчерпывающем гидролиэе иммобилизованных ДНК и РНК нуклеаэой

Serratia marcescens от препаратов, содержащих денатурированные ДНК и

РНК отщепляется 10-18% нуклеотидного материала, а от йрепаратов,содержащих активную ДНК вЂ” 41%. В то же время, анадогичная обработка нуклеазой препаратов, не обработанных глу таровым альдегидом, приводит к отщеплению 65% нуклеотидного материала. Препараты иммобилиэованных нуклеиновых кислот на АЭ-целлюлозе стабильны в. течение года при многократном использовании и хранении.

Использование иммобилиэованной Днк в качестве сорбента для хроматографии средства терминальной деэоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса позволяет провести очистку фермента по белку в 3-5 раз с выходом активности 6075%, очистку от, нуклеаз в 15-30 раз, очистку от фосфодиэстераз в 50200 раз.

Пример 1 ° 25 мл водного раствора денатурированной ДНК или

РНК с концентрацией 10 мг/мл (200 об. е./мл, измеренные при

260 нм на приборе СФ-16), погружают . в воду, имеющую температуру кипящей водяной бани, на 10 мин и всыпают в нее 10 г влажной АЭ-целлюлозы (4 г сухого веса). Смесь выдерживают, в течение 15 мин на кипящей водяной бане при постоянном перемеиивании.

Затем добавляют 6 мл 3%-ного водного раствора глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,5 об.Ъ и инкубируют смесь еще в течение 10 мин на кипящей водяной бане. Полученный осадок, представляющий собой иммобилиэованную нуклеиновую кислоту (ДНК или

PHK), переносят на стеклянный порис10 тый фильтр, промывают водным раствором 1М NaCl до отсутствия оптической плотности ДНК в промывных во дах и водой.

Связывание нуклеиновых кйслот с

15 АЭ-целлюлозой 80-90%, содержание нуклеиновых кислот 50-60 мг/г матрицы.

Иммобилиэованная РНК стабильна в условиях хроматографии ферментных препаратов, содержащих нуклеазы.

При исчерпывающем гидролизе эндонук. леаэой Serratia mercecsceas (20 ч при 37 C) от матрицы отщепляется не более 18% нуклеотидного материала, связанного с матрицей. Препараты стабильны в течение года при йериодическом использовании и хранении при 4 С.

Пример 2. Иммобилизацию нуклеиновых кислот проводят как в

З примере 1, за исключением того, что для иммобилизации берут 50 мл водного раствора денатурированной нуклеиновой кислоты и инкубируют с

АЭ-целлюлозой в течение 30 мин. При этом получают препараты иьелобилизованных нуклеиновых кислот (ДНК или

PHK) с содержанием ДНК или РНК 100 120 мг/г матрицы.

Пример 3. Иммобилизация

4Q нативной ДНК.

K 2 г влажной АЭ-целлюлозы (0,66 г сухого веса ) приливают 11 мл раствора ДНК с концентрацией 2,3 мг/мл.

Инкубируют смесь в течение 20 мин при

45 60 С при непрерывном перемешивании. о

Затем в смесь вливают 1 мл 33 глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,25 Об,Ъ и инкубируют в течение 2 ч при 25 С при непрерывном перемешивании. После . окончания выдержки смесь переносят на стеклянный фильтр, промЫвают водным раствором 1N Nacl до отсутствия оптической плотности ДНК в элюате и водой.

Получают препарат, содержащий

30 мг (ДНК) г сухого веса препарата.

Выход по иммобилизации ДНК сосгавил 80%. При проведении исчерпывающего гидролиза энденуклеазой от мат60 рицы отщепляется 40% иммобилизованной ДНК. При аналогичной обработке образца, необработанного альдегидои, отцепляют 65% ДНК.

Пример 4. ИммобилИзации нук65 лейновых кислот проводят как в при665635

Корректор Г. Orap

Редактор Л. Письман Техред Т.Фанта аа м4ф и ISIS

Занаэ 1138/5 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035< Москва, М-35, Раушская наб., д. 3/4 ЮВ МЮЮ

Филиал IIIIII "Патент", г. ужгород, ул, Проектная, 4 мере 1, эа исключением того, что в смесь добавляют 5 мл 25%-ного водно"- го -растворяй глутарового альдегида

{концентрация глутарового альдегида в реакционной смеси составляет

4,0 об.Ъ). Связэеание нуклеиновых кислот с АЭ-целлюлозой 80-90%, cvдержание нуклеиновых кислот 50, 60 мг/г. При исчертывающем гидролиэе э ндонуклеаэой Be r r e t i а ша rcecseens от препарата отщепляется не более 20% содержащейся в нем ДНК.