Способ ковалентной иммобилизации физиологически активных соединений
Союз Советскик
Социалистических республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву
I (22) Заявлено 23.03.77(21) 2465616/23-05 (5- )М. Кд .
С 08 F 4/04 с присоединением заявки М (23) Приоритет
1ЬеударстввннмИ квинтет
CCCP ие делам нзебретеннй н еткрмтнй
А 61 К 37/26
Опубликовано 05.12;79. Бюллетень М 45 (53) УД К 678.745 (088.8 ) Дата опубликования описания 07 12 79
Г. П. Власов и Н. Л. Изварина (72) Авторы изобретения (7l) Заявитель
Ордена Трудового Красного Знамени институт высокомолекулярных соединений АН СССР (54) СПССОБ КОВАЛЕНТНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
1, Изобретение относится к области химии высокомолекулярных физиологически активных соединений, точнее к способу ковалентной иммобилизации физиологически активных соединений, например гормонов, антибиотиков, ферментов, синтетическими полимерами.
Известен способ: получения нековалентного коньюгата комплекса физиологически активного соединения, например трипсина с поливинилнмидазолом, стабилизированного за счет солевых и водородных связей (1). При излучении инвитро коньюгат показал стабилизирующее влияние на трипсин.
Однако нековалентные комплексы поливинилимидаэола и физиологически активных веществ нестабильны и диссоцй-ируют в организме. Это затрудняет использование поливинилимидаэола для иммобилизации физиологически активных соединений.
Известен способ ковалентной иммобилйзацйи,,физиологически активных с< - -
2 динений на полимерах, содержащих различные реакционноспособные группыхлорангидридные, ацилазидные, ангидридные и т.д., при реакции которых с реакционноспособными группами физиологнчесS ки активных соединений (аминогруппами, например) происходит образование ковалентной связи между полимером и физио.— логически активными соедйнениями, т.е.
10 образование ковалентного" коньюгата полимера и физиологически активного соединения (2).
Однако, используя этот способ, необ ходимо предварительно активировать полимер введейием в него реакционноспособных группировок, что не позволяет ис- пользовать для иммобилизации такие полимеры, как поливинилимидаэол, поливинилпирролидон или полиакриламид, так как два последних можно применять для иммобилизации только после, добавочной предварительной модификации, связанной с раскрытием пирролидонового кольца, или превращением амидных" групировок в амилазидные, что существенно изменяет природу исходного полимера. Поливинилимидазол вообще нельзя применять по этому способу. Кроме того избыточное количество реакционноспособных групп на полимере, оставшихся посЭ ле реакции с физиологически активным соединением, должно быть инактивировано во избежание побочных реакций с последним, что также ведет к изменению свойств физиологически активного соедийения. Кроме того избыточные реак> ционноснособные группы на полимере неизбежно ведут к внутри- или ме1кмоле- кулярным сшивкам физиологически активных соединений, что, как правило, снижает активность полимерных модификаций физиологически активных соединений.
Известен также способ ковалентной иммобилизации физиологически активных соединений введением в последние винильной группировки при реакции, например, физиологически активного соединения с хлорангидридом акриловой кислоты, с последующей полимеризацией
{сополимериэацией) винильного производного физиологически активного соединенйя методами полимерной химии, например, при инициировании полимеризации винильных групп мономеров (физиологически активных веществ, содержащих винильные .группировки) УФ- облучением или обычными инициаторами радикальной полимеризации (3 j.
Этот способ обладает пониженной . реакционноспособностью двойной связи на физиологически активном соединении, коФ торая не позволяет получать полимеры с регулируемой концентрацией физиологически активной составляющей в коньюгате, поскольку в случае сополимеризации обычных виниловых мономеров с мономером физиологически активным вешеством, вследствие огромной разницы в констан" -тах сополимеризации, получаются коньюгаты, обогащенные, обычным винильным мономе ром.
Uemü изобретения — расширение ассортимента иммобилизукщих виниловых мономеров и упрощение способа, которое состоит в том, что азо-связь, введенная в высокомолекулярное физиологически. активное соединение, позволяет более широко регулировать соотношения физиологически активной компоненты и полимерной компоненты в иммобилиэованном образце.
2857 4
Эго достигается тем, что в качестве инициатора используют соединения общей, формулы сн н
5 (1 1 6- (-ж м-С вЂ” R
t
Сн Юн
В (д) 10
CH ! МН2
-м- -
6н J
З или (ь> где Я вЂ” остаток физиологически активного соединения; „- амидная или сложноэфирная;:
20 группировка.
Полимериэацию проводят в водных растворах при 40-65 С. В качестве винильных .мономеров используют винилимидазол, винилпирролидон, акриламид, акриловую кислоту или их смеси с дивинильными соединениями, например с, Ч -этиленбисакриламидом для получения подшитых полимерных структур, Физиологически активное соединение, со-30 держащее азо-связь, т.е, высокомолекулярный инициатор полимеризации. винильных мономеров, получают при реакции физиолгически активного соединениягормона или фермента, например инсулина, с бисхлоргидратом имидоэфира азоизомасляной кислоты.
П р. и м е р 1. Синтез высокомолекулярного инициатора — физиологически активного соединения, содержащего реак40 ционноспособную аэо-связь, на основе инсулина .
1,5 г инсулина суспенэируют в
200 мл сухого диметилформамида, содержащего 0,25 мл триэтиламина и 60 мг
45 бис-хлоргидрата бис-метилиМидата азоизомасляной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение трех дней при
4 С. За это врема инсулин растворяется.
Реакционную массу высаживают в 600мл
50 сухого эфира, центрифугируют. Остаток растворяют в 10 мл (0,1 моль ) аммиака и хроматографируют на колонке (200 х 5 см) на сефадексе Г-75. Вы55 делают две фракции; 1 — с обьемом задержки 450 мл;2 — с обьемом задержки
700 мл. Выход фракции 19%, 2 — 52%.
Физико-химическое и биологическое изучение — зле ктрофоретичес кая подвижность
Таблица1
Электрофоретическая подвижность рН 2,45 по сравнению с инсулином Е
Биологическая активность, %, (от активности инсулина) Тип инициатора
Оптические характеристики (ДОВ), % спиральности рН 2,5
11,2 рН
1,4
1, 12
22
100
24
67 28 веществ из фракции 1 и 2 исходного инсулина, данные по дисперсии оптического вращения (L1OB) тех же веществ до и после обработки трипсином (расщепление связи аргинин 22 — глицин 23) или до и после обработки меркаптоэтанолом (расщепление дисульфидных связей показало, что вещество из фракции 1 имеет структуру А, а из фракции 2 - Б, т.е. является внутримолекулярносшитым производным инсулича.
Биологические испытания проводят; определяя содержание глюкозы и крови кроликов. Каждое вещество испытывают в двух сериях на девяти кроликах. В . 15 табл.1 приведены физико-химические свойства и биологические характеристики высокомолекулярных иницИаторов - физиологически активных соединений (на основе инсулина). 20
Пример 2. Иммобилизация инсулина на поливининимидазоле.
200 мг модифицированного инсулина типа Б выдерживают в растворе, состоящем из 2,8 мл дистиллированной воды и 25
1,2 мл и -винилимидазола при 65 С в течение 4 ч. Затем смесь разбавляют равным обьемом (0,1 моль аммиака и хроматографируют на сефакксе Г-75. Фракция, соответствующая поливинилимини- 30 азольной форме инсулина, выходила с объемом задержки 300 мл. Мол. вес..
8000-1200, определен с помощью гель хроматографии. Биологическая активность полимерной модификации инсулина по сни- 35 жению уровня глюкозы в крови кроликов
150% по сравнению с исходным иисусы ном. Определена с помощью стандартного мышьяково-молибденового метода 7, две серии опытов на девяти кроликах, под- 40 кожно, из расчета 0,5 ед/кг живого веса. Полимерный инсулин изучен злектро57
6 фотометрически и спектрополяриметрически. Аналогично получены и исследованы другие производные инСулина (см. табл.2 )
Гомополимер не образуется.
Предлагаемый способ ковалентной..им.мобилизации физиологически активных соединений на; полимерах расширяет ассортимент иммобилизукщих виниловых полимеров, благодаря чему возможно получение новых интересных модифицированных полимерных форм физиологически активных соединений, воздействующих на живой организм, и повышение их биологической активности. Например, возможна модификация физиологически активных соединений немодифицированными поливинилимидазолом, поливинилпирролидоном н др. достаточно хорошо изученными в медицинском отношении и совместных с биологическими системами полимеров. Причем полученные ковалентные полимерные коньюгаты не име|от нежелательных внутри — и межмолекулярных сшивок физиологически активных компонентов ввиду контролируемой модификации физиологически активного соединения при получении высокомолекулярного физиологически активного инициатора. В свою очередь, данный инициатор позволяет широко варьировать соотношение физиологически активной компоненты и полимерной компоненты в коньюгате, на основании чего можно установить корреляцию структурных параметров, изменение которых обусловлено длиной цени иммобилизукщего полимера, а также долей физиологически активной компоненты и физиологической активностью коньюгата при использовании полимерных коньюгатов для регулирования биологических процессов в орган изме.
672857
Таблица2
Условия получения и характеристики полимерных производных инсулина
+65 10000 52
Вода 1,2
3 200 Б
2,98
Винилнирролидон
+40 8000 100
Акриловая к-.та
4 200 Б
5 ЮО Б
То же Тоже
То же
+55 11000
Акриламид 2 5
Виниламидазол+
3,0
6 100 Б
+ этилен акриламид
Тоже
1,2 . +60 сн, сн, с 1 с- б-З=М- C -З; или
NH I
Ен3 Сн3
R. Источники; инФормации, принятые во внимание при экспертизе
Составитель A. Переверзева
Редактор Л. Письман .. Техред 3. Чужик Корректор,И. Стец
Заказ 7663/61 Тира к 585 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035; Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4
Формула изобретени я
Способ ковалентной иммобилизации зо физиологически активных соединений путем полимеризации виниловых мономеров в Водных растворах" в присутствии где % — остаток физиологически актив40 ного соединения;
Q — амидная или сложноэфирная группировка.
2. Способ по 1, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что в качестве виниловых мо45 номеров используют мономеры, выбранные из ряда: винилимидазол, винилпирро - ".; лидон, акриламид, акриловая кислота или их смесь с виниловыми мономерами. инициатора, отличающийся тем, что, с целью расширения, ассортимента иммобилизирукщих виниловых . маномеров и упрощения способ, в качестве инициатора используют соединения обшей формулы
НЪ 5 мн б dH 2
1. Авторское свидетельство СССР № 422418, кл. С 08 F 4/04, 1972.
2. Суровцев В. И. и др. "Биохимия"
36, 199, 1971.
Э.Netboect М и др. Gtgwa, 29, 109, опублик. 1975.
