Способ получения рибонуклеозид-5-трифосфатов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛВСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Ресвублик

<1<>691462

J (6! ) Дополнительное к авт. сеид-ву (51)М. Кл.

С 07 Н 19/10 // A 61 К 31/70 (22) Звявлено 130278 (2l) 2580197/23-04 с присоединением заявки йо (23) Приоритет

Государствен аыя ком ятет

СССР по делам нзобретеммй н открытой

РЗ) УДК 547 ° 963.32.. 07 (088.8), Опубликовано 15.10.79- Бюллетень Нот 38

Дате опубликования описания 151079 (72) Авторы изобретения

С.Н.Загребельный, В.A.Êoðæoâ, Ф. Ста иковская (71) Заявитель

Специальное конструкторско-тех биологически активных ве ро (54) СПОСОБ ПОПУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕОЗИД 5- УРИФОСФАТОВ l0

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения рибонуклеоэид-5-трифосфатов, котоf рые широко используются в биохимических исследованиях, а также в медицине ..

Известен способ получения рибок нуклеозид-5-трифосфатов путем ферментативного синтеза на .основе соответствующих рибонуклеозид-5I

-монофосфатов, трис-НС6 буфера, рН 7,5 в присутствии ионов Ng + креатинфосфата, аденоэинтрифосфата, очищенной креатинкинаэы, stageленной из мышц кролика, очищенных 15 нуклеотидкиназ, выделенных из RscftGt÷ñtèà сот, т о (е.coei 3). процесс проводят при 37 С в течение 20 мин, про-. дукт выделяют хроматографически, выход продукта 85% в расчете на 20 исходный реагент < ), 1

Недостатками известного способа являются использование в качестве исходных субстратов для синтеза рибонуклеозид-5-трифосфатов соответствующих рибонуклеозид-5- монофосфатов, котбрые получают ферментативным гидролизом рибонуклеиновой кислоты с использованием очищенной 5-эндонуклеа- 30 зы и очищенной фосфодиэстеразы иэ змеиного яда. Продукт гидролиэа, представляющий собой смесь рибонуклеоэид-5 -монофосфатов, разделяют ионообменной хроматографией на

ДАУЭКС 1х2 и выделяют индивидуаль-! ные рибонуклеоэид-5-монофосфаты. Выt ход рибонуклеозид-5-монофос фатов на стадии гидролиэа рибонуклеиновой кислоты составляет 45-50%, относительно невысокий выход целевого продукта, так как вторая стадия процесса — фосфорилирование - протекает с выходом 85%, а выход целевого продукта за две стадии составляет 3843Ъt использование в синтезе очищенных нуклеоэидкиназ из Е.cori и очищенной креатинкиназы из мышц кролика; использование в качестве донора фосфорильных групп креатинфосфата.

Целью изобретения является упрощение способа получения и повышение выхода рибонуклеозид-5-трифосфатов.

Поставленная цель достигается использованием в качестве исходного субстрата рибонуклеиновой кислоты; в качестве ферментного препарата - цельного нефракционированного экстракта из f . со6 В;в качестве макроэргичес) 691462

Составитель Л.Никулина

Редактор Н .Потапова Техред С .Мигай КорректорИ. Михеева

Заказ 6144/19

Тираж 513, . Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1130 35, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 кого соединения — ацетилфосфата, получаемого простым химическим споссбом, Процесс проводят в присутствии фосфата натрия при рН 7,8-8,2 в течение 4-5 ч, что позволяет упростить процесс (исключить трудоемкие стадии очистки ферментов-нуклеотидкинаэ из E со84 В и крватинкиназы) и повысить выход целевого продукта на исходную рибонуклеиновую кислоту до 85-90%.

Пример .Приготовление ферментного препарата 5 О г клеток E. со8 В суспендируют в 150 мл 0,5 М трис-НС8 буфера (pH 7,5) и разрушают ультразвуком на ультразвуковом генераторе с частотой 18 0,4 кГц в течение 15мин, Сусцензию центрифугируют в течение

20 мин при 12 000 об/мин и 4 С. Осадок отбрасывают, а супернатант используют в качестве ферментного препарата. Концентрация белка в препарате

14 мг/ил.

Ферментный препарат хранят при

-10 С.

Получение нуклеозид-5-трифосфатов .

Готовят путем смешения реакцион- 25 ную смесь (500 мл), содержащую 2 r рибонуклеиновой кислоты и следующие компоненты, мкмоль/мл". ацетилфосфат

210, Ng +15, фосфат натрия (NaH2PO+)

200, трио-HCE (рН 7,5) 40, фермент- 30 ный препарат 7 йг/мл (по белку).

Смесь термостатируют в течение 5 ч при 37 С.Реакцию останавливают до D бавлением к реакционной смеси равного объема охлажденной до 0 С 10%-ной З5

НС6О4. Осадок удаляют центрифугированием. В супернатанте определяют степень расщепления рибонуклеиновой кислоты йо приращению оптической плотности при 260 нм кислоторастворимой фракции. Степень расщепления рибонуклеиновой кислоты достигает

90%. Супернатант титруют раствором

КОН до рН 7,0 и выпавший осадок перхлората калия удаляют фильтрованием. Фильтрат хроматографируют на 45 анионообменной смоле Пауэкс 1х2, элюиру я ступенчато О, 05 N L iC Е в

0,003 í.НС8 (нуклеозид-5 -дифосфаты);

0,1 М ЫС6 в 0,003 н.НСР (цитоэин-5-трифосфат); 0,15 М ЙСР в 50

0,003 H НСЬ (аденозин-5-трифосфат);

0,2 g L C8 в 0,02 N формиате аммония (уридин-5- трифосфат) и О, 3 М

)а1СЮ в 0,003 н.НСВ (гуанозин-5-трифосфат) . Фракции элюата, содержащие соответственно цитозин-5-три/ фосфат, аденозин-5-трифосфат, уридин-5-трифосфат, гуанозин-5-трифосфат собирают раздельно, нейтрализуют и осаждают в виде литиевых солей

0 охлажденной до -10 С смесью метанола и ацетона (1:10). Осадки собираЮт центрифугированием и лиофильно высушивают и характеризуют.

Спектральные характеристики

6 )128o/д 26 29o/)1 .2 каж дого нуклеозид-5- трифосфата соответствуют стандартным для данного соединения, Содержание основйого вещества в каждом рибонуклеозид-5трифосфате 90-95%, Содержащаяся в препарате примесь — хлористый литий.

Предлагаемый способ получения нуклеоэид-5-трифосфатов из рибонук/ леиновой кислоты позволяет упростить процесс, повысить выход продуктов в 2 раза, не требует применения дорогостоящих ферментных препаратов и специального оборудования.

Формула изобретения

Способ получения рибонуклеозид-5-трифосфатов путем ферментатив ного синтеза на основе субстрата в буфеое трио-HCE фермента экстракта

ЕзсЬемсЬ1а ccLi В в присутствии макроэргических фосфатных соединений и ионов Мд 2 при 37,0-37,2 С, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве субстрата используют рибонуклеиновую кислоту, в качестве фермента - нефракционированный экстракт

Esckericb a eati В, в качестве макроэргического фосфатного соединения— ацетилфосфат, процесс проводят в присутствии фосфата натрия при рН 7,8-8,2 в течение 4-5 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

3, Е.S. Cane ИаМз, М.Е.5ottessman, í.î. Kaernen "А Mekho8 Ео Ае Synthesis of gibonucteosicte ап6 2egoxsviboaucCeosi6e-Á -тг)вЪо P8ate "В осй. В оРИ. Acta v. 39, в/ 1, Р 82,196б. (прототип) .