Способ получения аденозин-5 -трифосфата

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 180478 (21) 2607827/23-04 (51) М. Кл.

С 07 Н 19/16//

А 61 К 31/495 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 250380. Бюллетень № 11

Дата опубликования описания 26.0380 (53) УДК 547.963. 32:

:547.857.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

И.И. Броду Р.А. Лудрика и у.я. Микстайс (71) Заявитель

"I (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФ

A р

А,.

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения аденозин-5 -трифосфата (АТФ), который широко применяется в биологии, биохимии и медицине, Известен способ получения ATC путем биофосфорилирования аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола с последующим подкислением до рН 2,53,0 и выделением конечного продукта ионообменной хроматографией на амфотерновл ионите БАК при рН З,О,Выход трифосфата 40-45Ъ, Чистота 951003 (1) .

Недостатком известного способа является высокий расход адсорбентавследствие невысокой рабочей обменной емкости ионита по отношению к аденозинфосфатом (40-80 мг нуклеотидов на 1 г смолы) из-эа сильного влияния при рН 2,5-3,0 конкурирующих ионов фосфата, ацетата, хлорида, присутствующих в реакционной смеси после отделения дрожжевого шламма.

Кроме того выход целевого продукта сравнительно низок (40-45%), так как часть аденозинфосфатов вообще не сорбируется, проходя через ноно обменную колонну при рН 2,5-3,0 в малодиссоциированном виде. Выбор рН сорбции обусловлен амфотерной при— родой смолы БАК, которая как анионит работает только при рН менее 3.

Иелью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Это достигается тем, что для прекращения реакции биофосфорилирования реакционную смесь подкисляют до рН 4,5-4,8 и ионообменную хроматографию проводят на сильноосновной ионообменной смоле, что позволяет увеличить выход целевого продукта до 72% °

Предлагаемый способ получения

Я аденозин-5 -трифосфата заключается в биофосфорировании аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола, с последующим подкислением до рН 4,5-4,8, в проведении ионообменной хроматографии на сильноосновной ионообменной смоле. Выход АТФ 70-72%. Чисто30 та 96 100

722920

Формула изобретения

Составитель Л. Никулина

-Редактор Н. Данилович Техред М.Келемеш Корректор Т, Скворцова

Заказ 307/14 Тираж 495 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 жлиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Пример 1, 500 г аденозина растворяют в 18 л деминерализованной воды. К раствору добавляют

2170 г Na HPO 12 Н О, 504 r KH PO„, 36 r KCk 1 кг сахарозы, 56 г

MgCC - 6 Н,О, 36 л пивных дрожжей и..750 мп толуола.

Устанавливают рН 7,0 + 1, Т

37 + 1ОC. .3a ходом реакции следят по изменению рН. Время фосфорилирования 3 ч.. Для прекращения реакции добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,5 и смесь охлаждают до

+ 4 С. Отфильтровывают дрожжевой шламм и фильтрат разбавляют 4-5 кратным объемом деминерализованной воды. Полученный раствор с рН приблизительно 4,6 наносят на колонну с анионитом,: соотношение диаметра и высоты колонны 1:4; 2,8 кг анионита APA-5П (коэффициент набухания 2,5-3,6) . После сорбции колонну промывают 50 л воды и 0,004 и. раствором соляной кислоты.

АДФ элюируют 0,02 н, раствором

NaCQ в 0,01 н. HC9, AT@ дасорбируют

0 5 н. раствором NaCP в .0,02 í. HC9 „

АТФ осаждают, смешивая элюат с

10-кратным объемом этилового спирта.

Осадок фильтруют, растворяют в 7 л деминерализованной воды, добавляют

65 г хлористого натрия, устанавливают рН 1,8 раствором НСР и смешивают с 7 л этилового спирта, Кристаллизуется динатриевая сс ль аденазин-5трифосфорной кислоты, Выход 680 г.

Чи стота 9 8% .

Элюат процесса сорбции направляется на выделение аденозина и ATC для возвращения их в реакцию биофосфорили ров ани я.

Пример 2. 25 г аденозина растворяют в 800 мл деминерализованной воды. К раствору добащтяют

108,5 r Иа2НР04 12 Нао, 25,2 г

КН PO 1,8 r KCQ 1,8 г МССР х бН О, 50 r сахара и .1,3 л пивных дрожжей. условия фосфорилирования как и в примере 1. Реакцию прекращают добавлением ледяной уксусной кислоты до рН 4,6, Отфильтровывают дрожжевую массу, фильтрат разбавляют 4кратным объемом воды (рН 4,8) и наносят на ионообменную колоннуг

0,13 кг анионита APA-5П; соотношение диаметра и высоты колонны 1:5. Разделение аденозинфосфатов проводят, как описано в примере 1. Фракцию

АДФ концентрируют до содержания АДФ более 10%,Раствор с рН 1 смешивают с

10-кратным объемом этилового спирта.

Осаждается натриевая соль АДФ. Выход 4,2 г. Чистота 96%.

ATC осаждают из элюата 10-кратным объемом этилового спирта, осадок отфильтровывают, растворяют в

400 мл воды добавляют 3,5 г хлористого натрия, подкисляют до рН 2,3, 20 кристаллизуют динатриевую соль АТФ добавлением 400 мл этилового спирта, Выход 33 r, Чистота 99%.

Способ получения аденозин-5 -трифосфата путем биофосфорилирования аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорга3Q нических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола с последующим подкислением и выделением конечного продукта ионообменной хроматографией, о т л и ч а ю3$ шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, подкисление проводят до рН 4,5-4,8 и ионообменную хроматографию осуществляют на сильноосновной ионообменной смоле.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1 . Авторское свидет ель ство СССР

Р 395082 по заявке 1 698592/31-16, кл. A 61 К 31/495, заявл. 1971

45 (прототип) .