4,6-3-капронилгидразон-прегнадиен17 -ол-20-он-ацетат, обладающий гестагенным действием

 

«««« j.«цтг

«

ЛИС Н 745907

Союз Советскмк

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТО РСХОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к акт. cBHll-âó (22) За я иле но 10.04.78 (21) 2602386/23-04 (51)М. Кл.

С 07 J 5/00

С 07 J 41/00

А 61 K 31/57 с присоединением заявки Ж

Государственный комитет (23) Приоритет по делам изобретений и открытий

Опубликовано 07.07.80. Бюоллетень .% 25

Дата опубликования описания 07 07.80 (5З) УИК 547.689..6 (088.8) (72) Авторы изобретения

И. fi. Скачек, А. Г. Селиченко, В. В. Натаров и Л. H. Воловельский (71) Заявитель

Харьковский научно. исследовательский .институт эндокринологии и химии гормонов (54) Ьл "-3-КАПРОНИЛГИДРАЗОН- ПРЕГНАДИЕН-17ск-ОЛ-20-0Н-АЦЕТАТ, ОЬЛАДА101цИЙ ГЕСТАГЕ11НЫМ ДЕЙСТВИЕМ

em ! л.О

0 — СОСН

5.С Н -СО-NH-й

Б лл

Изобретение относится к получению новых стероидных соединений, конкретно к Ь

4,6

-3-капронил-гидразон-прегнадиен-17а -ол-20-он- ацетату общей формулы обладающему гестагенным . действием.

Известно, что в молекуле прогестерона, представляющего собой ненасыщенный стероидный дикетан прегнанового ряда — Ь -прегнендион-3,20, гестагенную активность обусловливает наличие Ь -3-кетогруппировки в кольце

А(1). Замена указанной группировки на любую другую лишает вещество гестагенных свойств.

Известно также, что для андростановых

3-кетостероидов замена у Сэ-кетогруппы на

С-N-группу усиливает некоторые биологические свойства соединений (2).

11ель изобретения — расширение ассортимента стероидных соединений ряда прогестерона, обладающих высокой гестагенной активностью.

Поставленная цель достигается описываемым

Ь" " -3-капронилгидраэон-прегнадиен- 17ст -ол-20-он-ацетатом формулы 1, проявляющим гестагенное действие.

Целевой гидразон формулы 1 синтезируют по известному методу (31 при взаимодействии гидразида капроновой кислоты с Л -прегнадиен4,6

-17 6 -ол-3,20-дион-ацетатом в спиртовом растворе с дальнейшим выделением продукта обычными приемами.

Пример. Смесь 2 г hь-17а -ацетоксипрогестерона, 3 г гидраэида капроновой кислоты, 50 мл этиленгликоля нагревают в теченйе 5 ч при температуре банФ 195-205 С. Полученный

pacraop выливают в 1 л насыщенного раствора

NaCl, выпавший осадок отфильтровывают, промывавг водой и высушивают при комнатной

4,6 температуре. Выделяют 5 r сырого Ь -капронилгидразона прегнадисн-! 7и -ол-20-он-ацетата, Таблица 1

Специфическая активность У -3-капронилгидразон-прегнадиен-17а-ол-20-он

auerara спустя 3 дня после однократного внутримышечного введения в дозах, эквивалентных прогестерону.

$0 i g

Вес полового аппарата

Гестагенная активность

Вес тела, r оза, кролика мг/кг веса исходный окончательный менеP в мг о К онтлю

1 0,2

2 0,2

3 0,2

780

1300 1440

1650 1100

1600 1600

900

1500

1000

810.

853,3

1516,6 1381,3 +88,6 (0,05

85,6 171,2

1133,3

81,2

i Sx

205,5

3 74 ,который растворяют в ацетопе и высаживают в гексан. Получают 2 r целевого .продукта с т. пл. 126-128 C.

Найдено,%: С 71,9; Н 8,85; N 5,93;

С2 9Н42 N204

Вычислено,%: С 72,2; Н 8,71; N 5,81

ИК-спектры: 3170 (NH), 1730 (C=O), l67O (C=O, 1600 (C=N).

Изучение специфической активности синтезированного вещества проводят иа 60 инфантильных кроликах самках весом 0,8-1,0 кг по методу С.Ctauberg и модификации К.Junkrnann, основанной на структурных изменениях слизистой оболочки матки под влиянием прогестерона.

Животные подвергаются предварительному (в течение недели) эстрогенному. воздействию путем ежедневного подкожного введения фолликулина в дозе 10 МЕ в 0,2 мл косточкового масла. На восьмо" день от начала опыта кроликам однократно внутримышечно вводят испытуемое вещество в дозах, эквивалентных

0,2-0,6-0,8 и 1,0 кг прогестерона, с последующими ежедневными инъекциями поддерживающих дозу фолликулина (1 МЕ) вплоть до забоя, Испытания заканчивают спустя 3,7 10 и 14 дней после введенич вещества умерщвлением крольчих путем внутривенного введения воздуха в краевую вену уха. Тело и рога матки тщательно отсепаровывают от соединительной ткани

5907,ф и жира, взвешиваюг, фиксируют 8 10%-ном растворе формалина и подвергают гистологичес-, кой обработке. Матки заливают в целлоидинпарафин с последующим получением серийных срезов толщиной 5 мкм, которые окрашивают гематоксилин-зозином. Полученные гистологические препараты изучают с помощью микроскопа МБИ-1.

Оценку гестагенной активности проводят по

10 четырехбальной шкале:

Чистая эстрогенная пролиферация ...,....„., +

Явная гестагенная активность ............++

Сильная гестагенная активность -...„....,.+++

Очень сильная гестагенная активность,...++++

Каждую дозу испытуемого вещества изучают не менее чем на 3-5 животных. В качестве контроля используют кроликов того же веса, находившихся в одинаковых условиях с подопытными, но подвергавшимся лишь эстрогенной подго20 товке фолликулином.

Действие изучаемого вещества сравнивают с лрогестероном, международная единица действия которого составляет" 1 мг. Для этого в равноценных условиях проводят серию опытов на

33 кроликах, применяя различные дозы прогесхерона (от О,1 до 1,0 мг) и проводя наблюдения после однократного воздействия в разные сроки (3,7, 10 и 14 дней), Результаты изучения специфического действия зо Ь -3-капронилгидразон-прегнадиен-17а -ол-204,б

-он ацетата представлены в табл . 1, 745907

770

Н.

910

920

+++

1233,3 1299,3 177,4 < 0,05

171,2 188,4

950,0

840,6

XSx

27,4

1030

2700 2348

150

l,0

+н н++

5150 5852

880

7!0

l,0

920

1300 182

1100

1,0

2720 2473 — — ++++! 100

l,0

1350 1174 †— ++++

1150

l,0

930

2644,0 2605,8 +255,8 < 0,05

727,9 900,3

906,0

1076,0

4 Sx

51,7

61,3

319

12 Контроль

870

1028

720

470.

810

6!О

684

580!

15

1000 1087

870

920

730

650

1100

880

550

800,0 870,0

+Sx

37,8

55,9

4 06

5 0,6

6 0,6

13 Фолликулин 770

950 1022

1450 1576

1300 1300

618,6 732,3

99,3 1076

Продолженне таблицы 1.7 745907 8

Как видно из табл. 1, спустя 3 дня после в дозах 0,2 и 0,6 мг, сопровождаются повьппе однократного внутримышечного введения испы- нием веса матки по сравнению с центральными туемого вегцества в дозе, эквивалентной 0,2 мг животными в среднем на 77-89% (Р < 005). прогестерона, гестагенная активность выявлена Применение Ь -3-капронилгндразон-прегнау двух из трех подопытных животных. Гисто- g диен-17й -дл-20-он-ацетата в дозе, эквивалентлогическая картина слизистой оболочки матки ной 1 мг прогестерона, вызывает у болыпей кроликов при этом свидетельствует о значи- части подопытных животных резкую пролифетельном ее разрастании и выраженном развитии рацию слизистой оболочки матки, сопровождаюматочных желез. Отмечается также утолщение щуюся развитием болыпого числа глубоких мышечного и соединительнотканного слоев. 16 складок слизистой и увеличением количества

Выявленные изменения соответствуют согласно желез, что соответствует по схеме очень сильсхеме Клуберга явной гестагенной активности ной гестагенной активности (++ ). У двух (-+). Прн анализе структурных изменений в подопытных животных гестагенная активность матке третьего подопытного кролика выявлена соответствует сильной гестагенной реакции(+++). лишь эсгрогенная пролиферация, обозначаемая 15 Вес полового аппарата подопытных животных согласно общепринятой классификации (+). значительно увеличивается по сравнению с контПодобные изменения в структуре слизистой рольными кроликами (на 255,8%). оболочки матки возникают у контрольных животных, подвергавшихся воздействию одного Следовательно, спустя 3 дня после однократ. фолликулина. ного внутримышечного введения Л4 -3-капро

С увеличением дозы вещества до 0,6 мг нилгидразон-прегнадиен-17й -os-20-он-ацетата специфическая активность становится более вы- выявлено наличие сильного и очень сильного раженной и соответствует явной гестагенной гестагенного действия при воздействии дозы, р е а к ц щ (+ + ) у д в у х и 3 т р е х подопытных к р о - равной 1 M B p o F o c To p o H B c H B s H b I H H R B Ho H ков и сильной (+ . -) у одного животного. з5 гестагенной реакции — 0,6 мг и явной спеГистологическая картина слизистой оболочки цифическои реакции — 0,2 мг. рогов матки свидетельствует о выражецном ее . разрастании, развитчи складок слизисто" со Сопоставление активности испытуемого везначительным увеличением количества желез, щества с действием прогестерона (см. табл. 2), Ввиду укаэанных изменений поверхность матки 3п для которого установлена международная приобретает выраженную складчатость с высту- единица действия, равная 1 мг, позволяет запающими в просвет ее древовидными выроста- ключить, что испытуемое вещество по своему ми, имеющими сложный извилистый койгур специфическому действию спустя 3 дня после (+++) . внутримышечного введения приближается к

Гистологические изменения, отмеченные прогестерону, оказывая аналогичное влияние в матке под влиянием испытуемого вещества на структуру слизистой оболочки матки.

Та блица 2

Специфическая. активность прогестерона после однократного внутримышечного введения

Вес тела, г

Вес полового аппарата

Срок исслеДоза, МГ

Гестагенная активность кролика исходный окончательный мг/кг еса дования, день иэмев нения в%к контролю

900 750 833

1,0

750 1030 1373

1,0

650

700, 750 1250 1667

1,0

++++

890 2850 3202

1150 1870 1626

1;О

880

1,0

930

780,0 911,2 1550,0 1740,2 +137,6 < 0,05

870 856 790 929

730 790 1320 1670

740 810 1900 2346

810 860 1730 2012. 900 910 1880 2066 нн

810 0 844,0 1524,0 1804,6 +146,4 < 0,05

32,6 38 0 2 }0,7. 268,1

670 670. 2500 3731

+н

4l 3 0,6 720 780 1950 2500 ++н

0,6 920 830 1030 1241 — Ф++

42 3

748,0 792,0 1604,0 2088 0 +185,1 < 0,05

47,9 40;2 344 8 536 4

3 0,4 900 920 1020 1109

3 0,4 770 780 980 1256

850 890 1100 1236

840,0 863,3 Я33,2 1200,3 +63,9 < 0,05

44,5 47,9 41,1 51,4

ФЯх

34

36

+Sx

39

+Зх

45

+Sx

3 0,8

0,8

0,8

0,8

0,8

0,6

0,6

0,6

0,4

53,6

710

720

745907

76,7 402,2 459,7

880 1820 2068

800 . 720 900

Продолжение таблицы 2

745907

60 950

550 550

1000

0,2

900

870

0,2

633,3 730,0 — 0,3 > 0,05

71,9 137 0

890,0

830,0

51,4

68,5, 580 699

570 594:

460 474

830

0,1

800

0,1

790

960

850

970

0,1.51

536,6 589,0 -19,6 . >0,05

41,1 137,5

813 3

920,0

+Sx

20,5

47,9

970 900

1000 !111

52 7

1,0

1080 1140

53 7

1030 903

1,0

1110 1200

54 7

1700 1417

1,0

1080,0

102,7

1243,3 1143,7 56,1 > 0,05

239,7 74,6

1053,3

47,9 х

+Sx

700 890 840 944

0,8

790 880 360 409

0,8

700

0,8

500 625 х

164,4 184,9

30, а 30,8

iSx

730,0 857,0 567,0 679,3 - -7,2 > 0 05

745907

14

Продолжение таблицы 2. 10

530

880

1,0

530

970

850

1,0

540

557 — — +

600, 632 . — — +

1,0

10

960

900

973,3

573,0 -2),7 > 0,05

556,6

876,6 х

17,1

iSx

17,1

23,9

34,2

П р и м е ч а н и е: Достоверность результатов определяют по отношению к контрольной группе животных, приведенной в табл. 1.

Таблица 3

Длительность специфическОй активности Л" -3-канронилгидразон-прегнадиен-17а-ол-20-он-ацетата после однократного внутримышечного введения в дозе, эквивалентной 1 мг прогестерана

Вес тела, в г

Вес полового аппарата

N Cрок кро-; исследолика вания, день !

Гестагенная активность

1 изменев мг/кг веса исход-! ный

I окончательный в мг ния в % р к конт2700 2348

5150 5852

1300 1182

1150

1030

880

710

1100

920

+++

С целью выяснения вопроса о длительности действия испытуемого вещества проводят серию опытов, в которой животных забивают спустя

7, 10 и 14 дней после однократного внутримышечного введения вещества в дозе, равной 1 мг.

Полученные при этом результаты (см. табл. 3)

35 свидетельствует о том, что через 7 дней после однократного применения вещества у всех вэдопытиых животных обнаруживается сильная гестагениая активность,(+++), в то время как под влиянием прогестерона в тех же условиях опьгга имеет место лишь явная гестагенная активность (++). Вес полового аппарата подопытг ных животных, получавших импытуемое вещество; сохраняется увеличенным по сравнению с контрольными на 132,3% (P (0,05), под влиянием же прогестерона вес полового аппарата не отличается достоверно от веса полового аппарата контрольных животных,. т. е. нормализуется.

745907

++tt

930

ll50

2644, 0 2605,8 +255 8 < 0 05

727,9 900,3

906,0

1076 0

61,3

51,7

19:

1350 1306

850

+++!

000

850

20 17

1900

1900

2000 1904

1050

2l 7

1783,3 1703,3 +132,3 < 0 05

188,3 202,1

886,6

1053,3

34,2

+Sx

20,5

770

10

980!

910

1730

10

950

1821

1868,3 +155,1 < 0,05

1710 0

826,6

923,3

47,9

47,9

102 7

212,3

+$х

750 860

581

14

770 870

1200

1379

27

220

850! 117 — t 960

746,6

+400 > 005

>Sx

273,9. l7,l

138 7

6,8

2720 2473

1350 1174!

850 2202

1550 1582

860,0 883 3 1025 б

ПРодолжение таблицы 3

745907

Таблица 4

Острая токсичность Ф6-3-капронилгидразон-прегнадиен-17а-ол-20-он-ацетата при внутрибрюшинном введении

Доза, мг/мышь

Смертельная доза, (смг/кг) Гибель, в %

Количество животных мг/кг взятых погибших выживвеса в опыт ших

10

33,3

2500 6

50,0

/Щ1„- }660

3750 6

ДД„, 3631

66,6

5000 6

100

}7

При увеличении нромежугка времени после воздействия испьгтусмого вещества до 10 дней со стороны слизистой оболочки матки отмечается явная гестагенная реакция (у двух кроликов) и у Одного живо гного сильная- Вес ПО 5 лового аппарата при этом сохраняется увеличенным на 155,1% (P (0,05). Под влиян}}ем прогестерона в те же сроки наблюдения изменения структуры слизистой оболочки матки соответствуют лишь эстрогенной пролиферации (+), т. е. гестагенная реакция отсутствует:

В группе животных, забитых спустя 14 дней . после однократного внутримышечного,введения вегцества в указанной дозе, явная гестагенная реакция отмечается лишь у одного кролика (++), у остальных животных специфическая реакция слизистой оболочки матки соответствует 4). опоставление длительности действия испытуемого вещества с активностью прогестерона свидетельствует о том, что h -3-капронил46

20 пщразон-прегнадиен-17а -ол-20-он-ацетат обладает более выраженным пролонгированным

У эффектом. Так, если прогестерон спустя 7 дней после введения .оказывает лишь явную.

25 гестагенную активность (++), испытуемое вещество в той же дозе вызывает сильное гестагенное действие (+++). Спустя 10 дней. прогестерон не оказывает гестагенного влияния, в то время как Ь"-3-капронилгидразон-прегнадиен-17а-ол-20-он-ацетат вызывает яв30 ное гестагенное действие. Аналогичные изменения отмечены у некоторых животных даже спустя 14 дней после воздействия испытуемого вещества, Следовательно, длительность действия испытуемого ве цества составляет в среднем

10-I4 дней, в то время как прогестерона—

7 дней.

}8

С целью выяснения вопроса об эффективности Ь " -3- кап ронилгидразон- прегнадиен- 1-7а.

-ол-20-он-ацетата прн различных путях воздействия проведены опытЫ на 8 кроликах с введением вещества pегоs в дозе 1 мг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение обладает явной и сильной гестагенной активностью на протяжении 10 дней.

Таким образом, полученные данные позволяют считать, что предложенное вещество обладает гестагенным действием, приближающимся по силе своей эффективности к прогестерону, но превышающим последний по длительности эффекта. Вещество активно при парентеральном и пероральном применении.

Токсичность Л4 -3-калронилгидразон-прегнадиен-17п-ол-20-он-ацетата изучают в острых опытах на 40 белых мышах самцах массой

20-22 г при однократном внутрибрюшинном введении в оливковом масле в объеме 0;5-1 мл в дозах, равных 10, 50, 75, 100 и 200 мг на мышь, что составляет соответственно 500, 2500, 3750, 5000 и 100000 мг/кг веса. На протяжении двух недель после воздействия учиты.вается выживаемость животных, а также изменения внешнего вида, веса, двигательной н пищевой активности.

Результаты изучения токсичности в острых опытах (см. табл. 4) свидетельствуют о том, что введение испытуемого вещества в дозе; равной 500 мг/кг веса, не вызывает гибели животных. В состоянии подопытных мышей на протяжении всего времени наблюдения не отмечается каких-либо отклонений по сравнению с контрольными животными.

745907

200

10000 6

100

ЛД вЂ” 0470

Контроль

10 о- о н, Составитель О. Минаева

Техред Ж.Кастелевич Корректор М. Демчик

Редактор Л. Ушакова

Тираж 495 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д..4/5

Заказ 3889/! 7

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная, 4

Повьпцение дозы испытуемого вещества до

2500 мг/кг веса вызывает гибель 33,3% животных. Последующее увеличение количества введенного вещества до 3750 и 5000 мг/кг веса способствует гибели соответственно 50 и 66,6% мышей. Применение вещества в дозе 10000 мг/кг веса вызывает гибель всех подопытных животных.

Гибель наблюдается как правило на протяжении первых 2-3 дней после введения. Летальному исходу предшествуют явления общего угнетения, которые сменяются адинамией, прерывистым дыханием. Наблюдение за весом выживших животных не выявляет существенных изменений у подопытных мышей по сравнению с контрольными. Все животные равномерно прибавляют в весе. о

На основании полученных результатов можно считать, что изученное вещество мало токсично— его J1Jlgp составляет 3631 (1815-7262) мг/кг веса.

Таким образом, в результате изучения специ- 35 фического действия и токсичности Л -3-капро4,6 иилгидразон-прегнадион-17п -ол-20-он-ацетата установлено, что целевое вещество обладает гес- . тагенным свойством, приближающимся по силе своей эффективности к прогестерону, но пре- 4О вышающим последний по продолжительности действия. Вещество активно не только при парентеральном, но и при пероральном применении, мало токсично в острых опытах на мышах.

Формула изобретения 4 6 -3- Капронилгидразон- прегнадиен-17а -ол-20-он-ацетат общей формулы

0Н ! 0

С Н -СО-NH-N м обладающий гестагенным действием, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Физер Л., Фиэер М. Стероиды. М,,"Мир", 1964, с. 570.

2. P.Ruggeiri, G.Gandolfi, О.Chiaromonti.

Line nene Ве е von Stегоiden mit Protein—

anaboli seher Wirung, Boll.Soc. Ital. Biol.

Sperim 38,985 (1962).

3. Воловельский Л. Н. ЖОХ, сб. Синтез природных соединений, их аналогов и фрагментов, 103 (1965).