Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспара- гиназы

 

Ве-; се -о,-:.„,,„„ пйт&нтно т т, т F ., 1u," к,!ОЛИО а - 4

„„782363

Сома Советских

Социалистических

Республик о .н и в

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 20.06.79 (21) 2789289/23-04 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 23.01.82. бюллетень № 3 (45) Дата опубликования описания 23.01.82 (51) М Кл з С 07 Ст 7 628

С 12 D 13/10

//А 61 К3748

|осударственный комитет по делам изобретений н открытий (53) УДК 577Л5.67 (088.8) (72) Авторы изобретевия 3. И. Лебедева, Т. Т. Березов и В. Н. Орехович ! (71) Заявители Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы, Институт биологической и медицинской химии АМН СССР (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО

ПРЕПАРАТА ГЛУТАМИНАЗЪ|-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологическим способам получения ферментов, в частности к способу выделения фермектного препарата тлутаминазы-аспаратиназы (КФ 3.5.1.38), и может найти применение в медицине.

Перед медицинской наукой и современной онкологией поставлена задача поиска новых лечебных препаратов, обладающих избирательной и высокой противоопухолевой активностью.

Известно, что фермент глутамина"-а-аспарагиназа подавляет рост опухолей, устойчивых к действию Е-аспарагиназ.

Известен способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы Pseudomonas aurantiaca ИБФМ

В-14 (1). Он предусматривает отделенйе биомассы от культуральной жидкости и разрушение ее ультразвуком, экстракцию фермента буферным раствором с рН 7,8, удаление нуклеиновых кислот введением в реакционную смесь хлористого марганца.

После того, как удалены нуклеиновые кислоты, удаляют балластные белки нагреванием смеси при 55 — 60 С в течение 5 мин.

Дальнейшая обработка полученного препарата заключается в известных приемах. Осадок балластных белков отделяют, а полученный супернатант концентрируют и используют для дальнейшей очистки известными методами.

Недостатками известного способа являются; невысокий выход препарата (после ! стадии отделения балластных белков—

64 — 75% ), а также относительная сложность его воспроизведения, связанная с проведением нагревания в течение очень ограниченного времени, что затрудняет промышленную реализацию данного способа.

Кроме того, недостатком способа является продолжительность операции удаления нуклеиновых кислот при введении МпС1а (более 40 ч).

Целью изобретения является упрощение способа выделения, ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, ито

2О в известном способе выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиказы в качестве продуцента используют штамм

Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548, отделенную от культуральной жидкости биомассу перед экстракцией обрабатывают ацетоном, экстракцию проводят буферным раствором при рН 6,9 — 7,0, для удаления нуклеиновых кислот используют протаминсульфат, а для удаления балластных белков нагреЗ0 вание проводят при 50 — 54 С в течение

782363

15 — 30 мин в присутствии стабилизатора—

0,03 — 0,04 М L-глутамата натрия.

Согласно изобретению, описывается способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы

Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548, включающий отделение биомассы от культуральной жидкости, обработку биомассы ацетоном, экстракцию фермента буферным раствором при .рН 6,9 — 7,0, удаление нуклеиновых кислот с помощью прбтаминсульфата и удаление балластных белков нагреванием реакционной смеси при 50—

54 С в течение 15 — 30 мин в присутствии стабилизатора — 0,03 — 0,04 М Ь;глутамата натрия.

Описываемый способ обеспечивает значительное повышение выхода по сравнению с известным способом (94% — на стадии отделения балластных белков).

Замена хлористого марганца протаминсульфатом для удаления нуклеиновых кислот позволяет значительно ускорить процесс за счет сокращения стадии удаления нуклеиновых кислот с 40 до 1 ч.

Кроме того, описываемый способ дает возможность, несколько увеличив время нагревания раствора, упростить промышленную реализацию процесса выделения.

Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы заключается в следующем.

Биомассу, полученную в результате культивирования микроорганизма Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548 на среде, содержащей глутамат и .минеральные соли, при 30 С обрабатывают ацетоном. Фер " " мен1 экспарируют из ацетонового порошка микробной массы 0,05 М калийфосфатным буфером рН 6,9 — 7,0 и для удаления нуклеиновых кислот в суспензию вводят протаминсульфат. Смесь выдерживают в течение 1 ч и выпавший осадок удаляют, например, центрифугированием или фильтрованием. К супернатанту, представляющему собой раствор глутамйназы-асйарагиназы с примесями, добавляют глутамат Ха и нагревают раствор в течение 15 — 30 мин при температуре 50 — 54 С. Выпавший осадок денатурированных балластных белков удаляют центрифугированием. Супернатант койцентрируют. Полученный целевой продукт используют для дальнейшей очистки.

Пример 1. Культуру Pseudomonas

aurantiaca ВКМ-548 выращивают в ферментере емкостью 100 л на среде с 0,5% глутамата Na с добавлением солей в течение

18 — 20 ч с аэрацией и перемешиванием при рН 7,2 — 7,4 и температуре 29+-1 С. Биомассу отделяют сепарированием, обрабатывают ацетоном в течение 5 мин при 0 — 4 С в аппарате, обеспечивающем интенсивное п8ремешивание суспензии, фильтруют и высушивают. Получают 50 .г сухого ацетонового порошка, содержащего глутаминазуСпособ выделения глутаминазы-аспарагийазы.

Стадия экстракции. рН буфера для экстракции

Относительная обшая активность, %

Варианты способов

Известный

7,8

Предлагаемый

7,0

100 аспарагиназу. Ацетоновый порошок суспен- дируют в 800 мл 0,05 М калийфосфатного буфера рН 7,0 и перемешивают в течение 2 ч при 0 — 4 С. К полученному экстракту добавляют 1,5 г протаминсульфата, растворенного в 100 мл того же буфера.

После перемешивания в течение 1 ч образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Супернатант (650 мл) загружают в колбу с мешалкой, добавляют 4,4 r

L-,ãëóòàìàòà натрия, нагревают до 50 С, выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, охлаждают до 4 С и выдерживают в течение 30 мин. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Супернатант (600 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл. Выход фер Ментного и репарата глута мин азы- аспарагиназы 94% от содержания фермента в

20 экстракте.

Пример 2. Биомассу и ацетоновый порошок получают вышеуказанным способом. Фермент экстрагируют из ацетонового порошка биомассы 0,05 М калийфосфатным буфером рН 6,9 в течение 2 ч при 0 — 4 С.

К полученному экстракту добавляют при перемешивании 1,5 г протаминсульфата.

После перемешивания в течение 1 ч суспензию центрифутируют и осадок удаляют.

80 К 650 мл супернатанта добавляют 3,3 r

L —,rëYòàMàòa Na и нагревают раствор до

° 54 С, выдерживают его при этой температуре в течение 30 мин. Суспензию охлаждают до 4 С, выдерживают в течение

35 30 мин и центрифугируют. Супернатант (590 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл. Выход ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы 93% от содержания фермента в экстракте, 40 Активность фермента определяют по количеству аммиака, освобождающегося при ферментативном гидролизе L-глутамина или L-аспарагина и определяемого методом прямой несслеризации. За единицу

45 ферментативной активности глутаминазыаспарагиназы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1 мк/ моль субстрата за 1 мин при 37 С. Концентрацию белка в растворе измеряют по

50 методу Лоури.

В табл. 1 приведены полученные результаты, характеризующие влияние рН— экстрагирующего буфера на глутаминаз ную активность клеточных экстрактов.

Таблица 1

782363

Таблица 2

Способ выделения глутаминазы-аспарагиназы.

Стадия удаления нуклеиновых кислот.

Взриаиты способов

Добавляемое вещество

Условия (время,, ч) Выход,%

Известный

Предлагаемый хлористый марганец протамнисульфат

77

Таблица 3

Способ выделения глутаминазы-аспарагиназы.

Стадия нагревания.

Условия (время, температура) Варианты способов

Стабилизатор

Выход, %

Известный

Предлагаемый

5 мии, 55 — 600 С

003 — 004%

L-глутамата Na

15 — 30 мин, 50 — 54О С

Условия проведения стадии удаления нуклеиновых кислот и стадии нагревания представлены в табл. 2 и 3.

Формула изобретения

Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы продуцента Pseudomonas auraritiaca путем отделения биомассы от культуральной жидкости с последукицей экстракцней фермента из биомассы буферным раствором, уда,лением нуклеиновых кислот осаждением и удалением балластных белков, нагреванием оставшегося раствора с последующим выделением целевого продукта, о т л ич а ющ н и с я тем, что, с целью упрощения способа ускорения процесса н повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas

auraritiaca ВКМ-548, отделенную от культуральной жидкости биомассу перед экстракцией обрабатывают ацетоном, экстракцию проводят буферным раствором при рН

6,9 — 7,0, для осаждения нуклеиновых кислот используют протаминсульфат, а для " удаления балластных белков нагревание проводят при 50 — 54 С в течение 15—

30 мин в присутствии стабилизатора—

0,03 — 0,04 М L-глутамата натрия.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Виноградов Б. Д., Чигалейчик А. Г., Рылкин С. С., Меркулов М. Ф. Очистка и свойства дезамидазы L-глутамина и L-аспарагина из Pseudomonas aurantiaca ИБФМ з

В-14, «Прикладная биохимия и микробиология», 1976, т. ХП, вып. 5, с. 704 — 709 (прототип) .