Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием

 

Натриевая соль н-4-нитрофенилацетилтрео-01-3-нитрофенилсерина формулы ОН Н I f ci - I H HN-e 0 ймг 2 02N обладакицая-иммунодепрессивным действием .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

os аи

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 280139 3/23-04 (22) 25.07.79 (46) 30.11.83.,Бюл. Р 44 (72) Ю.Ю.Страукас; Н.Г.Арцимович, Г.П;Кудрина, Т.Л.Мигдал и С,К.Иманалиева (71) Институт биохимии AH Литовской

ССР и Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 547.466.03(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке М 2621601/04, кл . С 07 С 101/32, 31.05.78.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства, M., 1972, т. 2, с. 171.

3(Я) С 07 С 101 32 A 61 К 31/195 (54) НАТРИЕВАЯ СОЛЬ N-4-НИТРОФЕНИЛАЦЕТИЛТРЕО-DL- 3-НИТРОФЕНИЛСЕРИНА, ОБЛАДАЮЩАЯ ИММУНОДЕПРЕССИВНЬ М ДЕЙСТВИЕМ. (57) Натриевая соль N-4-нитрофенилацетилтрео-Dl-3-нитрофенилсерина формулы

OH H

1 б — с — бООжа

G2N н ныбобн, / юо, обладаницая .иммунодепрессивным действием.

790622

Изобретение относится к новому химическому соединению — натриевой соли N-4-нитрофенилацетилтрео-2L-3-нитрофенилсерина, которая, обладает иммунодепрессивным действием.

Это свойство дает возможность предполагать его использование в медицине.

Наиболее близким соединением по структуре является натриевая соль

1 - g, -— фенилацетил-N-g-салициден-трео- 10

-BL-фенилсерина, обладающая противовоспалительным действием (1) .

Однако указанное соединение не обладает иммунодепрессивным действием. 15

Целью изобретения является расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Известные иммунодепрессивные средства, как 6-меркаптопурин, азатиоприн, 5-фторурацил, недостатком которых является нежелательное побочное действие |2j .

Эта цель достигается новой химической структурой, описываемой формулой

0НН

С -С-C 00N а

) I ц @ coca / @О (ц 30

02 И

Соединение формулы 1 получают ацилированием трео-3L-3-нитросерина хлорангидридом 4-нитрофенилуксусной 35 кислоты в водощелочной среде, и полученный N-4-нитрофенилацетил-трео-2L-3-нитрофенилсерин переводят в целевой продукт в метанольном растворе метилата натрия. 40

Пример . К охлажденному льдом раствору 4,52 г (20,0 моль) трео-П1-3-нитрофенилсерина в 50 мл

0,4 н. едкого натра (20,0 ммоль) в воде при энергичном перемешивании 45 одновременно в течение 10 мин по каплям добавляют холодные растворы

4,0 г (20,0 ммоль) хлорангидрида

4-нитрофенилуксусной кислоты в

10 мл диоксана и 10 мл 2 н ° водного едкого натра (.20,0 ммоль), следя за тем, что реакционная смесь в течение всего времени оставалась слабощелочной. Затем реакционную смесь перемешивают еще 1 ч при комнатной температуре, охлаждают льдом, под55 кисляют 2 мл концентрированной соляной кислоты. Выделевшееся вещество отфильтровывают, на Фильтре тщательно промывают водой и перекристаллизовывают из смеси ацетона и воды (1 : 1). Получат 5,3 r(68%) N-4-нитрофенилацетилтрео-DL-3-нитрофенилсерина, т. пл. 204-205 С (разл.) .

Продукт представляет слегка желтоватые кристаллы, нерастворим в воде, 65 очень слабо в спирте, растворим в диметилсульфоксиде.

ИК-спектр (в таблетках с КВ на приборе Specord 7I IR): валентные колебани С = 0 при 1645 см и NH при 3270 см в амидной группировке, симм. валентные колебания NO при

1345 см . УФ-спектр (в этилово : спирте на приборе Яресогй 4Ч -Ч35)Э„щ„

203 нм(Е = 27100 л.мол. 1 см ) h z «270 нм (Е = 15600 л,мол. см ).

Найдено,Ъ: С 52,44; Н 3,88; N 10,79.

С Hiq- N>Og

Вычислено, Ъ: С 52,45; Н 3,88 N 10,79.

К раствору н-4-нитрофенилацетилтрео-OL-3-нитрофенилсерина в эквивалентном количестве 0,5 н. метилата натрия в метаноле прибавляют эфир и выделяют натриевую соль N-4-нитрофенилацетилтрео-3Ь-3-нитрофенилсерина, которую хорошо промываэт эфиром и высушивают в вакуумэксикаторе (при плавлении разлагается). Т разл. 150-161 о С.

Продукт представляет аморфный порошок с сероватым отттенком, хорошо растворим в воде, метиловом и этиловом спиртах, ацетонитриле, ацетоне, этиловом ацетате, тетрагидрофуране, диметилформамиде, нерастворим в эфире, алифатических-и ароматических углеводородах, хлороформе, растительных маслах.

Данные биологических испытаний показывают,.что соединение формулы ,1 обладает выраженным иммунодепрессивным действием. Оно практически не токсично (его LDso составляет

2500 мг/кг).

Биологическую активность соединения 1 изучают по трем тестам, характеризующим функциональное состояние иммунной систеьн:

1) влияние на бласттрансформацию лимооцитов

2) влияние на ингибыцию миграции макрофагов;

3) влияние на образование гемаглютининов.

Аллергизирующее действие препарата изучают при помощи кожноаллергической пробы с 2,4-динитрохлорбензолом.

Эмбриотропное действие изучают опосредованно (через организм материи},воздействуя препаратом в период органогенеза зародыша.

Исследование проводят на инбредных мышах линии СВА, морских свинках-альбиносах, крысах линии Wistsr, в реакции бласттрансформации используют периферические лимфоциты периферической крови человека.

Изучение влияния натриевой соли

N-4-нитрофенилацетил-трео-3L-3-нитрофенилсерина на бласттрансформацию лимфоцитов °

790622

Результаты опыта приведены в .табл. 1.

Из табл. 1 видно, что испытуемыми препарат в малых концентрациях 5

10 мкг/мл практически не изменяет включение меченого предшественника 40

ДИК по сравнению с контролем. В концентрациях 20, 30 и 60 мкг/мп препарат оказывает ингибирующее действие, наиболее выраженное в концентрации 60 мкг/мл (36% по отноше- 45 нию к контролк) . Следует отметить, что в испытанных концентрациях препарат не оказывает цитотоксического эффекта. Включение меченого предшественника в культуры лимфоцитов, не стимулированных ФГА, после внесения препарата такое же, как и в контрольных культурах без ФГА.

Изучение влияния натриевой соли

И-4-нитрофенилацетилтрео-13L-3-нитро- 55 фенилсерина на ингибицию миграции макрофагов.

Метод ингибиции миграции макрофагов позволяет определить функциональную активность Т-клеток эффек60 торов.

Морским свинкам-альбиносам, весом 250-300 r, вводят подкожно по

Для постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов (РТБ) использу-, ют гепаринизированную кровь здоро вых доноров. Мононуклиарные клетки выделяют центрифугированием крови в фиколл-гипак градиенте, содержание лимфоцитов 40-60Ъ. Количество жизнеспособных клеток, определяемых окраской трипановым синим, составляет 90% и выше во все сроки исследования. Клетки (1,5.106 мл) куль- 10 тивируют в среде 199 с добавлением . антибиотиков (, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина), 10Ъ сыворотки крови человека AB-группы и

10 мкг ФГА-Р (Дифко). В момент пос- 15 тановки культуры до ФГА вносят испытуемый препарат в концентрациях:

5, 10, 20, 30 и 60 мкг/мл культуральной среды. За 4 ч до конца культивирования в каждую пробирку добавляют 1 мкк Н -тимидина (уд.радиоактивность 17,6 Ci мМ). Через

72 ч начала культивирования каждую пробу переносят на миллипоровые фильтры, отмывают холодным 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты .и физиологическим раствором, Радиоактивность подс .итывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике

"Марк 11". Результаты выражают в процентах метки по отношению к контрольным стимулированным культурам, принятым за 100%, 2 мг БЦЖ. Перитоксальные макрофаги от этих животных берут на 21-ый день после сенсибилизации БЦЖ.

Испытуемый препарат вводят сенсибилизированным БЦЖ морским свинкам в дс зах 50 и 75 мг/кг, пятикратно, начиная со дня сенсибилизации.

3а двое суток до постановки реакции опытным и контрольным морским свинкам вводят внутрибркыинно 10 мл стерильного 2%-ного пептона. Из экссудата брюшной полости этих животных получают клетки. Клеточная суспензия перитониального экссудата содержит 25% полиморфноядерных лейкоцитов, 10% лимфоцитов и 65Ъ макрофагов. Отмытые и ресуспендированные в среде 199 клетки набирают в тонкие стеклянные капилляры (диаметр 1,—

1,5 мм) и центрифугируют при 800

1000 об/мин с тем, чтобы получить рыхлый осадок клеток. Капилляры одинаковой длины (1-1,2 см) с клетками помещают в специальные стеклянные камеры и прикрепляют разогретым парафином. Камеры заполняют питательной средой 199, содержащей

100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина и 10% инактивированной нормальной сыворотки морской свинки. В питательную среду для опытных образцов добавляют антигентуберкулин в дозе 25 мкг/мл, в соотношении О,В мп среды 199 и 0,2 мл антигена. Края камер смазывают стерильным вазелином и сверху закрывают стеклом. Опытные н контрольные камеры инкубируют при 37 С.в течение 24 ч, после чего камеры помещают под микроскоп и с помощью рисовального аппарата (РА-4),,укрепленного на тубусе микроскопа, производят зарисовку зон миграции на бумаге, после чего их вырезают, взвешивают на торзионных весах и вычисляют процент ингибиции миграции макрофагов по формуле: площадь миграции с антигеном .площадь миграции без антигена

Результаты опытов приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что испытуемый препарат ингибирует миграцию маркофагов БЦЖ вЂ” сенсибилизированных морских свине:.. в присутствии антигена. Ингибирующее действие препарата наибо лее выражено в дозе 75 мг/кг (почти на 50Ъ по сравнению с контролем, принятым за 100%) °

Изучение влияния натриевой соли

И-4-нитрофенилацетилтрео-2L-3-нитрофенилсерина на гуморальныи иммунитет.

79.06 22

Эксперименты проводят на инбред ных мышах линии СВА, используя метод определения титров гемагглютининов к бараньим эритроцитам. Препарат в дозах 50 и 75 мг/кг вводят опытным животным внутрибрюшинно в течение трех дней, начиная со дня иммунизации эритроцитами барана.

ЭритроцИны вводят внутрибрюшинно, однократно, по 0,3 мл 50% взвеси s физиологическом растворе. Спустя 10

5 дней определяют титры гемагглютининов по общепринятой методике. Было обнаружено, что натриевая соль

Б-4-нитрофенилацетилтрео-2Ь-3-нитрофенилсерина в дозах 50 и 75 мг/кг, 15 не влияет на титры гемагглютинов, которые остаются на уровне контроля (1 : 88). тактного дерматита, в течение двух недель. Препарат испытан в следующих дозах: 10, 25, 50, 75 и

100 мг/кг. В каждой группе было по

10 животных. Контрольным. свинкам наносят накожно 2,4 ДНХБ, испытуемый препарат им не вводят.

Интенсивность сенсибилизации оценивают визуально по выраженности воспалительной реакции кожи на месте кожной пробы по пятибальной системег

Π— отсутствие видимой реакции, 1 - слабая эритема, 2 - четкая эритема, 3 — то же, с уплотнением, 4 - резкая эритема с явлениями геморрагии, выраженный инфильтрат, 5 — серозно-геморрагическая корка с изъязвлениями.

В результате проведенных экспериментов выявлено, что испытанный препарат в дозах 10, 25, 50, 75 и

100 мг/кг не влияет на течение аллергического контактного дерматита, индуцированного накожной аппликацией 2,4 ДНХБ. Интенсивность реакции у опытных животнЫх существенно не отличается от контроля (0-1 балл).

Следовательно, испытуемый препарат не влияет на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа..

Изучение влияния натриевой соли

N -4-нитрофенилацетилтрео-Þ(,-3-нитрофенилсерина на аллергизирующее действие в кожно-аллергической пробе с 2,4-динитрохлорбензолом (2,4 ДНХБ).

25

Для определения аллергизирующей активности испытуемый препарат вводят опытным животным, затем индуцируют с помощью накожной аппликации 2,4 ДНХБ аллергический контактный дерматит и определяют влияние препарата на развитие кожной реакции к 2,4 ДНХБ. Если препарат обладает аллергизирующим действием, то реакция кожи на 2,4 ДНХБ усиливается. В опытах использованы морские свинки-альбиносы, самцы, весом 250-300 г.

Изучение эмбриотропного действия натриевой соли N-4-нитрофенилацетилтрео 3L-Ç-нитрофенилсерина.

Опыты проводят на крысах линии

Wistar. Животным вводят внутримышечно испытуемый препарат с 8-го по

15-ый день беременности, что по времени совпадает с периодом органогенеза и плацентации, в следующих дозах: 75 и 100 мг/кг. Для выявления влияния препарата на .плод животных забивают на 21-ый день беременности

На вскрытии осматривают рога матки, яичники, плоды и плаценты. Учитывают количество желтых тел в яичниках, число мест имплантации, наличие в матке живых, мертвых и резервированных плодов. На основании этих данных вычисляют предимплантационную и общую эмбриональную гибель плодов. Все плоды и плаценты взвешивают и рассматривали под микроскопом

MSC-1, при этом отмечают наличие у них внешних изменений и отклонений в развитии.

Результаты опытов представлены в табл. 3.

В результате проведенных опытов установлено, что введение животным натриевой соли N- 4-нитрофенилацетил трео-2Ь-3-нитрофенилсерина в дозах

100 и 75 мг/кг не вызывает увеличеНа тщательно выстриженные участки кожи правой и левой лопаток, 10 размером 2 2 см, при помощи глазной пипетки наносят по 2 капли 503-ного раствора 2,4 ДНХБ| каждую каплю втирают в кожу стеклянной палочкой сенсибилизирующая доза. 2,4 ДНХБ .разводят смесью спирт-ацетон в соотношении 1 : 2. Через 24-48 ч у морских свинок развивается аллергический контактный дерматит. На

14-й день после сенсибилизации животным выстригают на спине два участка размером 1 4 см каждый, и наносят по 1 капле 2,4 ДНХБ в следующих концентрациях: 1/250, 1/500, 1/ 1/1000 1/2500 — разрешающая доза.

У

В случае, если испытуемый препарат сенсибилизирует организм, то реакция на 2,4 ДНХБ наблюдается в высоких разведениях (1 : 1000, 1 :2500).

Натриевую соль N-4-нитрофенилаце- тилтрео-DL,-З-нитрофенилсерина вво- 60 дят морскии свинкам подкожно за месяц до нанесения. сенсибилизирующей дозы с 2,4 ДНХБ и продолжают вво-, дить препарат животным и в период развивавшегося аллергического кон-, 5

790622 ние общей и постимплантационной гибели плодов (P < 0,05).

Т а б л и ц а

Влияние натриевой соли N-4-нитрофенилацетилтрео-3L- 3-нитрофенилсерина на ФГА-индуцированную бласттрансформацию лимфоцитов доза препарата, мк г/мл

Включение Н -тимидина в ФГА3 стимулированные культуры, % от контроля, принятого за

1.00Ъ

Иммунотропная активность

100

Нет

102

Нет

104

Нет

81,2

Ин гибиция

То же

74,3

60 °

36,1

Примечание. Во всех опытах стандартные ошибки ниже 5-10Ъ

Т а б л и ц а 2

Влияние введения натриевой соли N-4-нитрофенилацетилтрео-2Ь-3-нитрофенилсерина на ингибицию миграции маркофагов

Сенсибилизация

Ингибиция миграции макрофагов, Ъ

Доза препарата, мг/кг

72+6,1

54 + 4,5

То же

Препарат не вводят (контроль) 100

Из этих данных можно сделать вывод о том, что натриевая соль N-4-нитрофенилацетилтрео-DL -3-нитрофенилсерина обладает иммунодепрессивным действием, выявленным на моделях клеточного иммунитета (снижает включение меченого предшественника

ДНК в культурах лимфоцитов и ингибирует миграцию макрофагов). но не влияет на гуморальный иммунитет (титры гемагглютининов у опытных животных на уровне контроля) .

Препарат не токсичен ) Ь с

2.5 r/êã.

При испытании новых иммунотропных препаратов черезвычайно важным является изучение аллергизирукщего и иммунотропного действия испытуемого препарата. Выявлено, что натри5 евая соль N-4-нитрофенилацетилтрео-Гл.-3-нитрофенилсерина ингибирует реакции клеточного иммунитета, для изучения алергизирующего действия этого препарата выбрана модель ал10 лергического контактного дерматита, которая отражает состояние.T-лимфоцитов и относится к реакциям гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Установлено, что соединение

15 формулы 1 аллергизирующим и эмбриотоксическим действием не обладает

790622

Таблиц а 3

Изучение эмбриатропного действия натриевой соли N-4- итрофенилацетилтрео-3L-3-нитрофенилсерина

Общая эмбриональная гибель, Доза препарата, мг/кг

3,6 + 0,04 0,61+0,01

3,4+ 1,4

3,5 + 0,005 0,59+0,003

2,7 + 1,2

100.

3,95 + 0,03 0,63 + 0,01

З,о + 1,4

Техред Ei.Áàáèíåö

КоРРектоР М.Шарохин

Редактор П.Горькова Заказ 10749/4 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Контроль (введение физиологического раствора — 1 мп) Постимплантационная гибель эмбрионов, Ъ

1,4 + 0,6

1,6 + 0,7

1,5 + 0,7

Средний вес плодов, r

Средний вес плацент, r

Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3- нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием 

 

Похожие патенты:
Наверх