Способ определения лизосомолабили-зирующего действия веществ

 

О П И C А Н И Е ()))819171

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.01.79 (21) 2706693/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл з

С 12Q 1/44 (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (53) УДК 615.51 (088.8)

/ по делам изобретений и открытий

И. М. Буйкис и А. В. Спринговичс /

Латвийский научно-исследовательский институтэкспериментальной и клинической медицины (72) Автор изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ЛИЗОСОМОЛАБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ

Государственный комитет (23) Приоритет

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии.

Известен способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени (1).

Однако известный способ недостаточно точен и длителен.

Целью изобретения является повышение точности способа и ускорение его. 10

Эта цель достигается тем, что исследуют распределение хлорацетатэстеразы и появлении ее в перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ. 15

Способ осуществляют следующим образом. Подбирают молодых, однотипных, здоровых животных, так как любое инфекционное или паразитарное заболевание может спровоцировать неспецифическую активацию лизосомного аппарата клеток, предшествующую некробиотическим изменениям в гепатоцитах.

Испытуемые вещества (например, твин-60, тритон BP 1339, тритон х-100 и т. д.) опытным животным вводят парэнтерально. Дозы выбирают в зависимости от токсических свойств препарата и ожидаемого лизосомолабилизирующего эффекта, обычно в интервале концентраций 10 — М, З0

10 — з М, в пересчете на живой вес животных (при использовании низ ком олекулярных соединений), Через 24 — 48 ч опытных животных (в группе по три животных) под легким эфирным наркозом обезглавливают, извлекают печень и кусочки последней размером

1Х1 см замораживают в жидком азоте или в криостате.

Криостатные срезы изготавливают при — 15 С, толщиной 15 — 20 мкм. Срезы расправляют на предметных стеклах и подсушивают при комнатной температуре 15—

30 мин.

Криостатные срезы печени фиксируют в парах формалина при комнатной температуре в течение 15 мин.

Проводят гистохимическую реакцию на хлорацетатэстеразу. Данная реакция наиболее четко показывает лабилизацию лизосомной мембраны, что выражается в четком увеличении активности фермента в перибилиарных областях гепатоцитов.

Состав инкубационной среды: 20 мг нафтол А — Д вЂ” хлорацетат растворяют в 1 мл диметилформамида, добавляют 25 — 30 мл фосфорного буфера рН 5,5 мл и 20 мг прочного синего ББ.

Если в срезах имеются ферменты хлорацетатэстеразы (эластаза и др.), то суб819171

Составитель С. Малютина

Техред И. Заболотнова

Редактор Т. Зубкова

Корректор Л. Слепая

Заказ 642/18 Изд. № 258 Тираж 530 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 страт нафтол А — Д вЂ” хлорацетат расщепляется, и нафтол А — Д вЂ”, связываясь с краской — прочный синий ББ, дает синюю зернистость.

Продолжительность инкубации при температуре 37 С в термостате в течение 30—

90 мин.

Препараты заключают в глицерин-желатину и изучают на световом микроскопе. В участках лабилизации лизосомного аппа- 10 рата обильно отлагаются синие гранулы, преимущественно в перибилиарных областях гепатоцитов.

Степень лабилизации лизосомного аппарата в перибилиарных областях гепатоци- 15 тов оценивают полуколичественно по следующим четырем ступеням:

1 — в перибиллиарных областях гепатоцитов активность хлорацетатэстеразы не обнаруживается или слабая положительная реакция на данный фермент выявляется до

5% гепатоцитов. Такая картина обнаруживается в нормальной печени и при отсутствии лизосомотропного эффекта у испытуемого вещества; 25

2 — четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаруживается до 25 — 30% гепатоцитов;

3 — четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях гепатоцитов обнаруживается у 50 — 60% гепатоцитов;

4 — высокая активность хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаружи4 вается более чем у 50-60% гепатоцитов, По данной шкале полуколичественно может быть оценен лизосомотропный эффект любого испытуемого вещества в зависимости от его дозы, способа введения, сроков действия и т. д.

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое определение, ответ может быть получен уже в течение 1 — 2 ч после убоя животных, обеспечивает высокую точность и позволяет в короткие сроки обследовать большое количество веществ на предполагаемый лизосомолабилизирующий эффект.

Способ позволяет в физиологических условиях провести отбор малотоксичных и высокоактивных лизосомолабилизирующих веществ, способных модифицировать функции лизосомного аппарата клеток в норме и патологии.

Формула изобретения

Способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения его, исследуют распределение хлорацетатэстеразы и при появлении ее перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Покровский А. А. и Тутельян В. А, Лизосомы. М., 1976, с. 226 — 243.

Способ определения лизосомолабили-зирующего действия веществ Способ определения лизосомолабили-зирующего действия веществ 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам отбора лошадей

Изобретение относится к области молекулярной биологии

Изобретение относится к электрохимическим -методам анализа с использованием Лерментов и может быть использовано в промьппленности при обнаружении холестеролэстеразы в средах ее выращивания, а также в диагностических целях в медицине

Изобретение относится к области экологии, в частности к санитарно-экологическому контролю окружающей среды на наличие вредных компонентов, и может быть использовано преимущественно для оперативного отбора проб и оценки концентрации вредных веществ с фермент-тормозящим действием фосфорорганических соединений (ФОС), в том числе фосфорорганических пестицидов (ФОП) и фосфорорганических отравляющих веществ типа зарин, зоман, V-газы (ФОВ) в газообразной и жидкой среде

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими представляющими интерес нуклеотидными последовательностями

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок. Способ позволяет определить неспецифическую устойчивость патогенных микроорганизмов к антибиотикам и установить факт присутствия бактериальных биопленок. 4 ил., 5 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В частности, изобретение связано с фосфодиэстеразой-9А (PDE9A) для применения ее в качестве маркера злокачественной опухоли предстательной железы, а также для применения PDE9A в качестве маркера для диагностики, детекции, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или прогрессии злокачественной опухоли предстательной железы, и иммуноанализом. Способы и иммуноанализ включают следующие стадии: определение уровня PDE9A в образце; определение уровня экспрессии референсного гена в образце; нормализацию измеренного уровня экспрессии PDE9A относительно экспрессии референсного гена и сравнение нормализованного уровня экспрессии с предопределенным граничным значением, выбранным таким образом, чтобы исключить гормон-чувствительную злокачественную опухоль предстательной железы. Причем нормализованный уровень экспрессии, который оказывается ниже граничного значения, является показателем гормон-резистентной злокачественной опухоли предстательной железы. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл., 3 пр.
Наверх