Патент ссср 825084
Союз Советскнн
Соцналнстнческнк
Республик
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛВСТВ.й (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22)Заявлено 07.08.79 (21) 2795922/28-13 (51)М. Кл.
А 61 К 37/22
А 61 К 35/34//
С 07 F 9/10 с присоелинением заявки .%
9куднрстеенный камнтет (23)Приоритет но делам нзааретеннй н аткрытнй
Опубликовано 30 ° 04 ° 81.. Бюллетень Нй 16
Дата опубликования описания 10.05 ° 81 (53) УДК 615.45:
:615.5(088.8) (72) Авторы изобретения
Э.Я.Костецкий и Н.И.Герасимен
Дальневосточный государственный универ (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ
ДИФОСФАТИДИЛГЛИЦЕРИНА, ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИНА И ФОСФАТИДИЛХОЛИНА
Изобретение относится к получению индивидуальных фосфолипидов, а именно дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина, которые находят широкое применение в изучении структуры и функции мембран, 5 фармакологии, медицине и парфюмерной . промышленности.
Предлагаемый способ одновременного получения дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина в патентной литературе не описан.
Цель изобретения — воэможность совместного получения дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина, Указанная цель достигается тем, что измельченное говяжье сердце экстрагируют последовательно хлороформом и хлороформом-метанолом, взятыми в з@ соотношении 2:1, экстракт обрабатывают дистиллированной водой, далее упаривают, полученный осадок растворяют в хлороформе, затем обрабатыва2 ют 2%-ным водным раствором хлористого магния, водный слой удаляют и целевые продукты выделяют последовательно хроматографией на силикагеле, при этом сначала выделяют дифосфа- тидилглицерин хлороформ-метанолом в соотношении 93:7, затем фосфатидилэтаноламин хлороформ-метанолом 9:1 в присутствии раствора аммиака и фосфатидилхолин хлороформ-метанолом
8:2 в присутствии раствора аммиака.
Пример. Получение дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина.
400 r свежемороженного говяжьего сердца измельчают на мясорубке, добавляют 5 объемов хлороформа, гомогенизируют 2-3 мин, фильтруют на воронке Бюхнера или центрифугируют при 1500-2000 об/мин 5 мин, водный слой отбрасывают. Остаток ткатти трижды экстрагируют в гомогенизаторе хлороформ-метанолом 2:l в соотношении ткань-растворитель 1:5. Объеди3 825084 ненные экстракты промывают l/5 частью дистиллированной воды. Водный слой отбрасывают. Хлороформ-метанольный слой упаривают под вакуумом на роторо ном испарителе при 40-45 С, остаток растворяют в 80 мл хлороформа, прибавляют 1/5 часть 2Х-ного водного раствора хлористого магния, энергично встряхивают около 2 мин и оставляют в делительной воронке на холоде до полного отделения водной фазы.
Нижняя хлороформенная фаза готова к нанесению на колонку. Выход общих липидов 12 r. Из них фосфолипиды составляют 73 . В состав фосфолипидов входят, Х: дифосфатидилглицерин 10,2, фосфатидилэтаноламин 29,0; фосфатидилхолин 39,0, сфингомиэлин 7,5; фосфатидилинозитид 7,3; фосфатидилсерин 3,6 лизофосфатидилхолин 1,5, Э го фосфатидная кислота 0,8 и лизофосфатидилэтаноламин 0,4, Для разделения общих линидов (465 мг) используют 17 г неактивированного силикагеля марки Л 40/100 M. Отношение силикагеля к загружаемой. фракции фосфолипидон 50:1. Силикагель суспендируют в хлороформе и загружают в колонку диаметром 1,6 см и высотой адсорбционного столба 30
16 см, т ° е ° отношение диаметра к высоте 1;)О. Объем колонки 30 мл. Фракцию общих липидов в 3,1 мл хлорофор- . ма вносят в колонку и начинают процесс элюирования. 35
Для элюирования используют:
11 колоночных объемов (330 мл) хлороформа. Вымывают все нейтральные липиды.
26 колоночных объемов (780 мл) хлороформ †метано 93:7. Первые три колоночных объема (90 мл) отбрасывают как содержащие следы нейтральных липидов. Оставшиеся 23 колоночных объема вымывают хромато- 45 графически чистый дифосфатидилглицерин — 34 мг. Выход около 99Х.
50 формула изобретения
60 колоночных объемов (1800 мл) хлороформ-метанола 9:1 с добавкой
4 мл/л системы 25 .-ного водного аммиака. Первые восемь колоночных объемов (240 мл) отбрасывают как содержащие следы дифосфатидилглицерина и фосфатидилэтаноламина.
Оставшиеся 52 колоночных объема (1560 мл) вымывают 97 мг хроматографически чистого фосфатидилэтаноламина. Выход около 98Х.
25 колоночных объемов (750 мл) хлорофом-метанола 8:2 с добавкой
15 мл/л системы 25Х-ного водного аммиака. Первый колоночный объем, содержащий следы фосфатидилэтаноламина, отбрасывают. Последующие 12 колоночных объемов (360 мл) вымывают 84 мг хроматографически чистого фосфатидилхолина, т.е. выход около
63 . Оставшиеся 12 колоночных объемов (360,мл) вымывают остатки фосфатидилхолина в смеси со сфингомиэлином и фосфатидилинозитом.
Оставшиеся фосфолипиды могут быть вымыты хлороформ-метанолом
1:1. Из 465 мг общих липидов (340 мг фосфолипидов) получают 34 мг хроматографически чистого дифосфатидилглицерина, 97 мг фосфатидилэтаноламина и 84 мг фосфатидилхолина.
Использование предлагаемого способа совместного получения дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина позволяет быстро, просто, с одной колонки, практически без потерь для таких целевых продуктов, как дифосфатидилглицерин и фосфатидилэтаноламин, одновременно получить хроматографически чистые дифосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин с повышенным выходом.
Одноколоночное разделение целевых продуктов позволяет получать их в более нативной форме за счет сокращения процедур и времени вьщеления,так как известно, что фосфатидилэтаноламин ы дифосфатидилглицерин содержат в своем составе значительное количество легкоокисляющихся полиненасыщенных жирных кислот> т.е. получать целевые продукты более высокого качества и значительно дешевле по сравнению с препаратами близкой чистоты, выпускаемых за рубежом. Так, дифосфатидилглицерин в 45 раз, фосфатидилэтаноламин в 25 раз, а фосфатидилхолин в
9 раз дешевле.
Способ одновременного получения дифосфатидилглицерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина, отличающийся тем, что измельченное говяжье сердце экстрагир-,ют последовательно хлороформом и хлороформ-метанолом, взятых в
5 соотношении 2:I, экстракт обрабаты вают дистиллированной водой, далее упаривают, полученный осадок растворяют в хлороформе, затем обраба" тывают 2Х-ным водным раствором хлористого магния, водный слой удаляют и целевые продукты выделяют последовательно хроматографией на силика«
825084 6 геле, при этом сначала выделяют дифосфатидилглицерин хлороформ - ме« танолом в соотношении 93:7, затем фосфатидилэтаноламин хлороформ-метанолом 9:1:в присутствии раствора аммиака и фосфатидилхолин хлороформметанолом 8:2 в присутствии раствора аммиака.
Составитель С.Малютина
Редактор Л,Филь Техред А, Савка Корректор М,Коста
Заказ 2385 40 Тиржк 681 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП Патент, г. Укгород, ул. Проектная,
