Способ количественного определениягормонов мозгового слоя надпочечников

 

О П И С А Н И Е 828088

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву -— (22) Заявлено 03.01.79 (21) 2712186>28-13 с присоединением заявки М— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.05.81. Бюллетень М 17 (45) Дата опубликования описания 07.05.81. (51) М. Кл.

G О1 Х 33/74

Гасударственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) ДК 616-003.725 (088. 8) (72) Автор изобретения (71) Заявитель

В. К. Поздеев

Ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт экспериментальной: медицины АМН СССР (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНОВ МОЗГОВОГО СЛОЯ

НАДПОЧ ЕЧ Н И КО В

Изобретение относится к медицине, а именно к биологии и мохкст служить для определения биологически активных веществ.

Известен способ количественного определения гормонов мозгового слоя надпочечников путем адсорбции их на окиси алюминия при рН 8,2 — 8,5 с последующим промыванием адсорбента водой, элюпрованием кислотами адсорбировапных гормонов, разделением элюата па порции и окислением гормонов в элюате путем внесения в пробы для определения адрсналина и 3 — 4-диоксифенилаланина фсррицианида калия, а в пробы для определения дофамина и норадреналина иода, таутомсрпзацией образовавшегося 3-оксииндолов адреналина и 3 — 4-диоксифенилаланина аскорбинатом натрия в растворе ХаОН и 3-оксииндолов дофамина и норадреналина сульфитом натрия и измерением флпоорссцспцип конечных растворов (1).

Однако этот способ неточен и для его осуществления требуется много времени.

Целью изобретения является повышение точности способа и ускорение сго.

Поставленная цель достигается тсм, что адсорбцию ведут внесением окиси а.,поминия в исследуемый материал прп встряхивании, после чего суспензию переносят на незаполненную колонку, удаляют прошедшую через адсорбент надосадочную жидкость, элюцию осущеетвля|от НС!04 при встряхивании в закрытой колонке, окисление адреналина ведут при рН 3,8 — 4,0, норадреналина и дофамина при рН6,6 — 6,9 и диоксифенилаланина при рН 6,3 — 6,5, таутомеризацию адреналина, норадреналина и дофамина ведут при 2 2 — 2 5 н, и ХаОН, перед измерением флюоресцснции пробу с норадреналином и дофампном нейтрализуют смесью соляной и уксусной кислот, измеряют флюоресцснцию норадрсналина, подогревают и измеряют фл|оы оресценцию дофамина.

Пример. Адсорбция. 5 мл профильтрованной мочи помещают в круглодонную колбу емкостью 50 мл, содсржащу о 60 мг кристаллического ЭДТА, вегряхивают до

20 растворения ЭДТА и 2 н. раствором NaOH доводят до рН 8,5+0,1 под контролем рНметра. Затем в эту колбу помещают 500 мг очищснной и активированной по Брокману окиси алюминия (А1еОз), еще раз встряхи25 вают и измеряют рН, посл= чего колбу мягко встряхивают в течение 3 мин таким образом, чтобы адсорбент находился во взвешснном состоянии. Затем смесь помещают на колонку 10У..150 мм с фильтром

30 40 — 50 мкм, частички адеорбента, остап828088

60

Изд № 296

Поди всвое

Загорская типография Упрполигра

3 шиеся и колбе, смывают порциями этой же мочи, выходящей из колонки. После полного прохождения мочи сквозь адсорбенг эффлюент выбрасывают, а колонку и адсорбент тщательно промывают водой сначала 4 мл, а затем 3 раза по 2 мл (каж дую последующую операцию начинают после полного прохождения предыдущей порции воды сквозь адсорбент). Далее выход колонки осушают фильтровальной бумагой и закрывают герметично пробкой.

Элюция. Элюцгпо начинают помещением на колонку 0,4 мл 0,54н. хлорной кислоты, затем колонки (выход колонок герметично закрыт) последовательно извлекают из штатива, и мягкими ударами пальцев по колонке адсорбент взвешивают в элюирующем растворе (это повторяют 5 раз в течение 5 мин) .

Затем выход колонок открывают и элюат собирают в стаканчики, стоящие на льду.

Колонку и адсорбент промывают последовательно 0,6 мл 0,03 н. НС!04 и 2,6 мл воды. Общий объем элюата ста овится

3,3 мл, кислотность 0,042 и, +- 0,002.

Образование лютинов и измерение их флюоресценции, Элюат по 0,5 мл разливают в пробирки, затем в них добавляют по 0,6 мл соответствующих буферных растворов (для А рН 4,1, для НА и ДА рН 7,25, для Д рН 6,74) в результате смешивания создают оптимальный рН для окисления веществ (pH окисления А

3,8 — 4,0; HA и ДА 6,75+-0,15; Д 6,4<-0,10).

Окисление адреналина осуществляют добавлением 0,04 мл 0,25%-ного раствора феррицианида калия. После встряхивания пробирки стоят 3 мин, затем добавляют

0,4 мл аскорбината натрия. Флюориметрию осуществляют сразу при 419 — 530 нм. Тканевой фон образуется за счет того, что вначале приливают аскорбинат натрия, а после 3-минутной экспозиции — феррицианид калия.

Окисление Д и получение тканевого фона выполняют с помощью тех же реактивов и также, как А. Отличие состоит в том, что для создания оптимальной рН окисления используют соответствующий буферный раствор, аскорбинат натрия, экспозицшо окисления 2 мин и флюориметрию прп 365 — 481 нм.

Определение НЛ и ДА осуществляют последовательно в одних и тех же пробирках. Окисление осуществляют прибавлением 0,04 мл 0,05 в. раствора йода, после встряхивания экспозиция 3 мин; затем приливают 0,5 мл щелочного сульфнта, после энергичного встряхивания экспозиция

5 мин и затем приливают 0,45 мл емеси уксусной и соляной кислот (конечный рН

4,2), Ткансвой фон в данном случае создают за счет кислой среды, поэтому в пробирку вначале приливают не буферный

Заказ 3140 Тираж 915

50 оо

4 раствор (как для А и Д), f смесь уксусной и соляной кислот. Соответствующий буферный раствор приливают после шслочного еульфита. После приливания всех реактивов экспозиция 25 мин и затем флюорнметрия лютина НА при 365 — -481 нм.

Из флюориметрической кюветы смеси вновь возвращают в пробирки, которые помещают в ультратермостат, где в течение

15 мин при 100 С активируется флюорофор дофамина. Г!осле извлечения из ультратермостата пробирки охлаждают до комнатной температуры н флюориметрируют лютин ДА при 313 — 382 нм.

Предлагаемый способ позволяет уско рить процесс количественного определения гормонов мозгового слоя надпочечников и повысить точносп определения, Формула изобрстеппя

Способ количеетвенпого определения гормонов мозгового слоя надпочечников путем адсорбции Нх на окиси алюминия при рН 8,2 — 8,5 с последующим промыванием адсорбента водой, элюированпем кислотами адсорбированных гормонов, разделением элюата на порции и окислением гормонов в элюате путем внесения в пробы для определения адреналина и 3 — 4диоксифенилаланина феррицианида калия, а в пробы для определения дофамина порадреналина иода, таутомеризацпсй образовавшегося 3-оксииндолов адрсналина и 3 — 4 диоксифенилаланина аскорбинатом натрия в растворе NaOH » 3-оксииндолов дофамина и норадреналина сульфитом натрия и измерением флюоресценции конечных растворов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения его, адсорбцию ведут внссением окиси алюминия в исследуемый материал при встряхивании, после чего суспензию переносят на незаполненную колонку, удаляют прошедшую через адсорбент надосадочную жидкость, элюцию осуществляют НС104 при встряхивании в закрытой колонке, окисление адреналина ведут при рН 3,8 — 4,0, норадреналина и дофамина при рН 6,6- — 6,9 и диоксифенилалав гна при рН 6,3 — 6,5, таутомеризацию а,1!)еналина, норадреналина и дофамина ведут при

2,2 — 2,5 и, NaOH, перед измерением фпюоресценции пробу с норадреналивом и до. фамином нейтрализуют смесью соляной и уксусной кислот, измеряют флюоресцснцию норадреналина, подогревают и измеряют флюорссценцию дофамина.

Источники информации, принятыс во внимание прп экспертизе

1. Матлина Э. Ш., Меныпиков В. В.

Клиническая биохимия катехоламивов. M., 1967, с. 25.