Способ получения фосфатидилглицерина

 

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социапистическик рес убпик (»)831129 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24. 07. 79 (21) 2789169/28-13 (51)M. Кл. с присоединением заявки J% (23) Приоритет

А 61 К 31/66

С 07 F 9/10

ВоудвратвввныН квинтет еСС1 ао девам изаеретевнй и опрытвй .

Опубликовано 23.05.81, Бюллетень М !9

Дата опубликования описания 25.05.81 (53) УДК6! 5.45»

:615.739.!6

{088.8) (72) Авторы изобретения

Э. Я» Костецкий и Т. В. Власенк

» 1

» т » е

Дальневосточный государственный унивй1тенвет (71) Заявитель

»., „! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИИ ФОСФАТИДИЛГЛИЦЕРИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промьппленности.

Известен способ получения фосфатидилглицерина путем действия фосфолипазы Д на лецитин в присутствии глицерина с последующей очисткой колоночной хроматографией (11.

Однако при этом способе выход фосфатидилглицерина незначителен и состав.Я ляет 257, чистая фосфатидная кислота не выделяется.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и одновременное получение фосфатидной кислоты.

Поставленная цель достигается тем, что лецитин растворяют в диэтиловом эфире, полученную фракцию обрабатывают трнлоном Б и элюирование проводят смесью хлороформ-метанол в соотношении 94:6 в присутствии аммиака для получения фосфатидилглицерина и при элюировании смесью хлороформ-метанол

2 в соотношении 6:4 выделяют фосфатидную кислоту»

II р и м е р 1. Препарат фосфолипазы Д готовят гомогенизацией капусты с 0,05 М натрий-ацетатньм буферомрН 5,6. Соотношение ткань-буфер 1:3.

Полученный экстракт центрифугируют при 5000 об/мин 15 мии. Надосадочную жидкость используют в качестве препарата фосфолипазы Д. Ферментативную смесь готовят путем растворения 1,5 г чистого лецитина в 300 мл диэтилового эФира (5 мг/мл), смешивают с 300 мл

0,05 М натрий-ацетатного буфера рН

5,6, с 300 мл препарата фосфолипазы

Д, 600 мл 0,02 М раствора хлористого кальция,и 600 мл глицерина. Реакцию о проводят при 26 С 0,5 ч при постоян ном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 95Х лецитина. Соотношение фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты около 3:1. Полученная фракция содержит фосфатидную кислоту, около 22X, лецитин около 5Х, фосфатидил35

Из 1 r фракции . фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты получают сразу 376 мг (около 60X) хроматогра55 фически чистого фосфатидилглицерина и 300 мг с примесью фосфатидилметанола и лецитина, полученных в начале и конце второй систеМы. Их доочистка.3 83112 глицерин около 63Х, фосфатидилметанол около 37, и нефосфолипидные примеси около 77..

Фракцию фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты извлекают 4 раза сис5 темой хлороформ-метанол 2:1, одной третьей частью от реакционной смеси каждый раз. Хлороформ-метанольный слой упаривают до 50 мл, прибавляют

50 мл 2%-ного раствора трилона Б в lo системе вода-метанол 9:1, тщательно перемешивают, центрифугируют и верхний слой отбрасывают. Нижний слой отмывают 30 мл дистиллированной воды .от избытка трилона Б. Водный слой от- 15 брасывают, нижний упаривают досуха и растворяют в 10 мл хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25Х водного аммиака (3 мл/л системы). Фракция готова к нанесению иа колонку. Для разделения 20

1 r смеси веществ используют 50 г силикагеля Л 40/100@.. Силикагель суспензируют в хлороформ-метаноле 94:6 с добавкой 257. водного аммиака, (3 мп/л системы) и загружают в колонку диамет- 25 ром 4,5 см с высотой адсорбционного столба 10 см. Отношение диаметра к высоте адсорбционного столба 1:2.

Для элюирования используют:

1. 4 л хлороформ-метанола 94:б 3о с добавкой 25Х водного аммиака (3 мл/

/л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и фосфатидилметанол. В послед" нем литре системы .заметно появление фосфатидилглицерина;

2. 10 л хлороформ-метанола 92!8 с добавкой 25Х водного аммиака (4 мл/

/л системы). Вымывают хроматографически чистый фосфатидилглицерин. В первом литре системы заметно небольшое 40 количество фосфатидилметанола, в по следних полутора литрах появляются следы лецитина.

3. 3 л хлороформ-метанола 7:3 с добавкой 257. водного аммиака (6 мл/л 45 системы). Вымывают лецитин. В последних полутора литрах выходит лецитин с примесью фосфатидной кислоты.

4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4.

Вымывают хроматографически чистую 50 фосфатидную кислоту.

9 4 на аналогичной колонке дает еще

150 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина. Конечный выход хроматографически чистого фосфатидилглицерина составляет около 847. от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидной кислоты составляет 130 мг (около 60Х).

Пример 2. Препарат фосполипазы Д готовят гомогенизацией семян арахиса с дистиллированной водой. Соотношение ткань-вода 1:3. Полученный экстракт центрифугируют при 5000 об/

/мин:15 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве препарата фосфолипазы Д.

Ферментативную .смесь готовят растворением 1,5 г лецитина "Олайне" (смесь лецитина, сфингомиэлина, лизолецитина, фосфатидилэтаноламина и нейтральных липидов) в 300 мл диэтилового эфира 5 мг/мл, смешивают с

300 мл препарата фосфолипазы Д, ;300 мл дистиллированной воды, 600 мл

0,02 М раствора хлористого кальция и 600 мл глицерина. Реакцию проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном о перемешивании. В ходе реакции расшепляется около 90 возможных предшественников фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты.

Полученная фракция содержит фосфатидную кислоту 14,27, сфингомиэлин

2,6Х, лецитин 10,7Х, фосфатидилгли церин 50,)7, фосфатидилэтаноламин

З,ОХ, фосфатидилметанол 3,1Х, лизолецитин 0,6Х, фосфатидилинозит 2;6Х, нефосфолипидные примеси 13,1Х.

Обработку полученной фракции трило-, ном Б и подготовку колонки проводят по примеру 1.

Для элюнрования используют:

1. 5 л хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25Х водного аммиака (3 мл/л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и фосфатидил-метанол. В последнем литре системы заметно появление фосфатидилглицерина.

2. 9 л хлороформ-метанола 92:8 с добавкой 257 водного аммиака (4 мл/л системы). Вымывают хроматеграфически чистый фосфатидилглицерии. В первом литре системы заметно небольшое количество фосфатидилметанола, в последнем литре появляются следы фосфатидил.этаноламина.

Формула изобретения

Способ получения фосфатидилглицерина путем действия фосфолипазы Д на лецитин в присутствии глицерина с последующей очисткой колоночной хроматографией, отличающийся тем; что, с целью повышения выхода целевого продукта и одновременного по,лучения фосфатидной кислоты, лецитин

5 8311

3. 4 л хлороформ-метанола 7:3 с до- бавкой 25Х водного аммиака (6 мл/л системы). Вымывают фосфатидилэтаноламин, лецитин, сфингомиэлин, фосфатидилинозит со следами фосфатидной кислоты в конце системы.

4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4.

Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту.

Из 1 r фракции фосфатидилглицерина 10 и фосфатидной кислоты получают сразу

320 мг (около 64Х ) хроматографически чистого фосфатидилглнцерина и 280 мг с примесью фосфатидилметанола и фосфатидилэтаноламина, полученных в на- 15 чале и конце второй системы. Доочистка последней на сходной колонке дает еще 140 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина. Конечный выход хроматографически чистого фосфатидил- zo глицерина составляет около 92Х от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидиновой кислоты составляет 92 мг (около 65X). 25

Пример 3. Препарат фосфоли пазы Д готовят по примеру 2.

Ферментативную смесь готовят растворением 1,5 г лецитина "Олайне" (смесь лецитина, сфингомиэлина, лиза- ЗО лецитина, фосфатидилэтаноламина и (нейтральных липидов ) в 300 мл диэтил вого эфчра .5 мг/мл, смешивают 300 мл препарата фосфолипазы Д, 300 мл дистиллированной воды, 600 мл 0,02 М 35 .раствора хлористого кальция и 600 мл

О . глицерина. Реакцию проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 95Х возможных предшественников

40 фосфатиднлглицерина и фосфатидной кислоты. Полученная фракция содержит фосфатидную кислоту 12,2Х, фосфатидилглицерин 43,4, лецитин 4,4Х, сфингомиэлин 2,6Х, фосфатидилметанол 2,2Х, 45 фосфатидилэтаноламин 3,4Х, фосфатидилинозит 2,7Х, лизолецитин 0,4Х нефосфолипидные примеси 27,8Х.

Обработку полученной фракции трилоном Б и подготовку колонки проводят

SO по примеру I. В отличие от последнего изменено соотношение диаметра 2,2 см к высоте адсорбционного столба 22 см до 1:10.

Для элюирования используют:

1. 2,7 л хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25Х водного раствора аммиака (3 мл/л системы). Вымывают не29 6 фосфолипидные примеси и фасфатидилметанол. В последнем литре системы заметна следовое количества фосфатидилглицерина.

2. 6 л хлороформ-метанола 92:8 с добавкой 25Х водного аммиака (4 мл/л системы). Вымывают хроматографически чистый фосфатндилглицерин.

В последнем литре системы идет смесь фосфатицилглицерина и фосфатидилэтаноламина в незначительном количествеэ

3. 3 л хлороформ-метанола 7:3 с добавкой 25Х водного раствора аммиака (6 мл/л системы). Вымывают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, лецитин, сфингомиэлин. В конце системы появляется следовое количество фосфатидной. кислоты.

4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4.

Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту.

Из 1 г фракции фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты получают сразу

350 мг (около 80X) хроматографически чистого фосфатидипглицерина и 100 мг с примесью фосфатидилметанола и фосфатиднлэтаноламина, полученных в на чале и конце второй системы. Доочистка последней на сходной колонке дает еще 50 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина. Конечный выход хроматографически чистого фосфатидилглицерина составляет около 92Х от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидной кислоты составляет

77 мг (около 63X).

Использование предлагаемого спасо по сравнению с известными способами, позволяет быстро, просто, с экономной затратой растворителей одновременно получить хроматографически чистые фосфатидилглицерин и фосфатидную кислоту с высоким выходом 84-92Х фосфатидилглицерина и 60-65Х фосфатидной кислоты.

7 831129 8 растворяют в диэтиловом эфире, полу- нии 6:4 выделяют фосфатидную кислоту. ченную фракцию обрабатывают трилоном

Б и элюирование проводят смесью хло- Источники информации, роформ-метанол в соотношении 94:6 в принятые во внимание при экспертизе присутствии аммиака для получения 1. M. Не11ег. Phospholtpase Din фосфатидилглицерина и при элюировании peanut seeds Bui l, Sol Chim Biol. смесью хлороформ-метанол в соотноше-. 1968, 50, 9, )395-!409.

Составитель .С. Малютина

Редактор О. Малец ТехредМ Рейвес Корректо С. Шекмар,, Заказ 3005/15 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4