Способ получения белково-пептидногокомплекса

 

ц843994

0 П И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ боюз ьоветских ьоииалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05.02.79 (21) 2751742/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.07.81. Бюллетень № 25 (45) Дата опубликования описания 07.07.81 (51) М. Кл.

А 61К 37/02

А 61К 35/39

Государственный комитет (53) УДК 615.361.37 (088.8) II0 делам иаобретений и открытий (72) Авторы изобретения P. И. Каратаева, Ю. Е. Размахнин, Ф. Ю, Рышка, П. В. Кугенев, И. А. Донецкий и А. П. Жемайтите

Ордена Дружбы народов университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы / (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНОГО

КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к биологической промышленности.

Известны различные способы получения белково-пептидного комплекса, содержащего кристаллический инсулин, используемого в терапевтических целях, а также для стимуляции мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (1 — 3l.

Использование инсулина в последней стадии откорма сельскохозяйственных животных повышает интенсивность углеводного, азотистого и жирового обменов и использование питательных веществ организмом, что приводит к увеличению привеса животных на 5 — 15%, Наиболее близким к предлагаемому способу является способ (4), предусматривающий водно-спиртовую экстракцию поджелудочной железы с использованием серной и ортофосфорной кислот, отделение балластных примесей при рН 4,5 — 4,7 и рН

4,2 — 4,8 путем добавления 10%-ного раствора ацетата цинка, осаждение инсулинасырца солями цинка при рН 4,2 — 4,5 и

5,4 — 5,5 высаливание 20 — 25%-ным раствором хлорида натрия и дальнейшую кристаллизацию инсулина известным способом.

Недостатком известного способа является то, что введение инсулина, не содержащего проинсулина и глюкагона, методом имплантации у животных вызывает резко выраженную гипогликемию, а введение животным одного инсулина путем инъекции или имплантации приводит к быстрому рассасыванию и разрушению его ферментами тканей животных, что снижает

- степень использования и резко сокращает продолжительность эффекта.

1р Целью изобретения является повышение биологической активности белково-пептидного комплекса за счет наличия в его составе инсулина, проинсулина, глюкагона, протамина и цинка.

Цель достигается тем, что целевой продукт осаждают солями тяжелых металлов вначале при рН 6,0 — 8,0, а затем повторно при рН 5,5 — 7,5 и в присутствии протаминсульфата при рН 6,0 — 8,0.

Подкисление экстракта проводят серной кислотой до рН 2,5 — 3 5 в течение 20—

30 мин и соляной кислотой до рН 2,0 — 2,5 в течение 120 — 150 мин.

Отделение балластных веществ от экстракта проводят при рН 5,0 — 10,6, преимущественно при рН 6,0 — 7,5.

Полученный белково-пептидный комплекс при анализе методом электрофореза в полиакриламидном геле характеризуется наличием фракций, соответствующих ин10

65 акулину, проинсулину, глюкагону. Кроме того, в препарате имеются пролонгаторы инсулина и глюкагона, а также протамин и соли цинка, Использование предлагаемого способа позволит упростить технологическую схему получения белково-пептидного комплекса по сравнению с известной для инсулинасырца, повысить выход и снизить себестоимость препарата.

Применение белково-пептидного комплекса при откорме сельскохозяйственных животных не вызывает у них резко выраженной гипогликемии, повышает использование питательных веществ и увеличивает привесы, что обусловлено наличием наряду с инсулином проинсулина и глюкагона.

Присутствие в комплексе протамина и цинка снижает степень разрушения гормонов тканевыми ферментами и обеспечивает продолжительныи эффект препарата.

Пример 1. 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней измельчают и экстрагируют 3,5 — 4,0-кратным объемом 70 — 85 /о-ного раствора этилового спирта, подкисленного 45 — 59 мл концентрированной ортофосфорной кислот, в течение 3 ч. рН экстракционной смеси 2,8 — 3,0.

Экстракт фильтруют и дважды осаждают в нем балластные вещества и соли при рН 5,8 — 6,0 и рН 9,5 — 10,2.

Выпавшие осадки удаляют фильтрацией или центрифугированием.

Из надосадочной жидкости осаждают белково-пептидный комплекс при рН 5,8—

7,5, добавляя 80 — 100 мл 10 /о-ного раствора уксуснокислого цинка. Полученный осадок отделяют, промывают дистиллированной водой и растворяют в воде, подкисленной соляной кислотой. Полученный комплекс очищают высаливанием 20 О/о -ным раствором хлористого натрия при рН 2,5. В дальнейшем проводят переосаждение его npu рН 5,5 — 7,5 и комплексообразование с протамин-сульфатом при рН 7,0 — 7,5. Для этого к растворенному белково-пептидному комплексу добавляют 225 мл раствора, содержащего 103,5 мг протамин-сульфата, 94,5 г двузамещенного фосфата натрия, 67, 5 мг хлористого цинка и 0,14 мг фенола.

Полученный препарат отделяют и высушивают. Выход препарата 600 мг.

Содержание гормональных компонентов в комплексе следующее, . .инсулина

40 — 60, проинсулина 20 — 30, глюкагона до

10. Суммарное содержание гормонов

20 — 30 /о, протамина 10 — 15% и цинка до

5О/О от веса препарата.

Пример 2. 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней измельчают и экстрагируют 5-кратным объемом 80О/о-ного раствора этилового спирта, подкисленного 75 мл смеси концентрированных серной и соляной кислот в соотношении 1:1, в течение 3 ч. рН экстракциой: ной смеси 2,5.

Экстракт фильтруют и осаждают в нем балластные белки;.ри рН 5,8 — 6,0 и р!-1

9,5 — 10,2, Выпавшие осадки удаляют фильтрацией или центрифугированием.

Из надосадочной жидкости осаждают белково-пептидный комплекс при рН

5,8 — 7,5 добавлением 80 — 100 мл 10 -ного раствора уксуснокислого цинка. Полученный осадок отделяют, промывают дистиллированной водой и растворяют в воде, подкисленной соляной кислотой. Полученный комплекс очищают высаливанием

20О/о-ным раствором хлористого натрия при рН 2,5. В дальнейшем проводят переосаждение его при рН 5,5 — 7,5 и комплексообразование с протаминсульфатом при рН

7 0 — 7 5, как в примере 1.

Полученный препарат отделяют и высушивают. Выход препарата 700 мг. Соотношение компонентов в препарате такое же, как в примере 1.

Пример 3. Измельчают 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота и суспендируют в 5 л 80 -ного этилового спирта. К суспензии добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают в течение 20 мин, затем добавляют 10 мл 18 -ной соляной кислоты и перемешивают еще 160 мин. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием и отбрасывают. В надосадочной жидкости доводят рН до 5,5 добавлением 20 О/о -ного раствора едкого натра. Через 1 ч образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, а в надосадочной жидкости доводят рН до 10,0 добавлением едкого патра. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. В надосадочной жидкости рН снижают до 6,0 и при перемешивании добавляют 100 мл

10О/о-ного раствора уксуснокислого цинка.

Выпавший осадок отстаивают в течение 5 ч, верхний слой декантируют, а нижний центрифугируют. Выход влажного сырца 12 г.

Его суспендируют в 120 мл воды и рН доводят до 2,2 — 2,4 добавлением 18О/О-ного раствора соляной кислоты. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием и отбрасывают, а к надосадочной жидкости досавляют 45 г хлористого натрия и перемешивают до полного растворения соли. Выг.авший осадок отделяют центрифугировакием, а маточник отбрасывают. Осадок суспендируют в 120 мл воды и добавлением

180/..-ного раствора соляной кислоты рН доводят до 2,5 — 2,8.

Полученный раствор фильтруют через кизельгур, а к фильтрату добавляют 5 мл

10 /о -ного раствора уксуснокислого цинка и рН доводят до 5,5. Через 5 ч осадок отделяют центрифугированием, а маточник отбрасывают. Осадок суспендируют в 75 мл

843994

Состав фракции, %

Содержание, %

\ о (Cr) >, ) Q)

ММ о к

6; ж о.

Ф о

С» и л

C( о д х о

Ы д2

Й о х у

М > д СО

О д и

Е x ао о, c би (б

aS

Я "+ ъ о q о и Х о ж о

Д ж

vga а> z O л! аа Ф

Д 1=(Ю

Cl, 2 о

13,9 28,5

10,9

8,7

9,9

33,6

22,9

650

10479

22,7

Крупного рогатого скота

12,1

8,9

9,5

11,8 28,5

10,1 25,4

17,1

32,8

30479 Свиная

40779 То же

800

28,5

10,3

9,7

17,2 34,0

6,9

900

31,6

Содержание инсулина и глюкагона определено методом бумажной хроматографии.

Состав белковых фракций определен методом электрофореза в полиакриламидном геле, где содержание белка принято аа 100у,.

45 воды и доводят рй до 2,8 — 3,2 добавлением 18%-ного раствора соляной кислоты. К раствору добавляют 2 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, 2,5 г глюкозы, 0,3 г фенола и рН доводят до 3,3 — 3,5. Затем к раствору добавляют 30 мл 0,25%-ного раствора протамин-сульфата, а рН доводят до 6,0. Выпавший осадок через 10 — 12ч отделяют центрифугированием. Маточник отбрасывают. Осадок промывают ацетоном и сушат. Выход порошка 650 мг, содержание гормональных веществ (типа инсулина и глюкагона) в нем 25%.

Пример 4. Измельчают 1 кг поджелудочной железы свиньи и полученный фарш суспендируют в 4 л 85%-ного этилового спирта. Суспензию подкисляют 10 мл кон. центрированной серной кислоты и перемешивают в течение 30 мин, затем к суспензии добавляют еще 60 мл 18% -ного раствора соляной кислоты и продолжают перемешивать 150 мин. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости рН доводят до 7,0 добавлением едкого натра. Выпавший осадок балластных веществ отделяют центрифугированием и отбрасывают. К надосадочной жидкости добавляют 80 мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка при рН 68.

Осадок отделяют центрифугированием и маточник отбрасывают. Осадок растворяют в воде при рН 2,0 — 2,2, нерастворимую часть отбрасывают, а к раствору добавляют хлоПри введении гормонального препарата, содержащего 93 — 95% белково-пептидного комплекса из поджелудочной железы животных на 5 — 7% -ной стеариновой кислоте для откормочных животных свиней, путем одноразовой имплантации таблеток в последние 90 †1 дней откорма в дозе для бычков 160 мг, бычков-кастратов 200, телок 250 мг привесы молодняка были выше, чем у контрольных животных на 9 — 12%, в сравнении с имплантацией инсулина привесы были выше на 3 — 4%.

6 ристый йатрий до 0,8 насыщейия. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, опять растворяют в воде и из водного раствора осаждают добавлением уксуснокислого цинка при рН 7,5. Осаждение протаминсульфатом проводят при рН 7,0. Вес сухого порошка белково-пептидного комплекса

750 мг. Содержание гормональных веществ (типа инсулина и глюкагона) 43%.

10 Пример 5. Процесс проводят по примеру 3, но для подкисления водно-спиртового раствора берут 6 мл серной кислоты и 40 мл соляной кислоты, балластные вещества отделяют только при рН 7,2, а целевой продукт — солями цинка при рН 6,3.

Для высаливания продукта из водного раствора используют 20% -ный раствор хлористого натрия. Второе осаждение солями цинка проводят при рН 6,0, а осаждение протамин-сульфатом — при рН 7,2.

Выход белково-пептидного комплекса составляет 800 мг из 1 кг свиной поджелудочной железы при содержании гормональных веществ около 48%.

При мер 6. Процесс ведут по примеру

2, но для подкисления водноспиртового раствора берут 20 мл серной кислоты. Другие значения рН, как в примере 4. Выход белково-пептидного комплекса 500 мг при

30 содержании гормональных веществ 25%.

Физико-химические свойства отдельных серий, полученных как в примере 4, представлены в таблице.

Одновременно с увеличением привесов имплантация метаболина повышала убойный выход на 1,2 — 1,6%, а в мясе — содержание белка и жира.

Применение метаболина методом одноразовой имплантации на молодняке свиней в последние 90 †1 дней откорма в дозе для боровков 50 мг, для свинок 60 мг увеличивало привесы на 13 — 16%, убойный выход на 1,2 — 2,2%, в мясе содержание белка и жира по сравнению с контрольнымы животными. Использование инсулина

843994

Формула изобретения

Составитель В, Финник

Редактор 3. Бородкина Техред И. Заболотнова Корректоры: О. Силуянова и Е, Хмелева

Заказ 1557/16 Изд. № 424 Тираж 694 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 методом имплантации оказалось не эффективным.

При производственной апробации метаболина на 1 тыс. голов молодняка свиней в последнюю стадию откорма были получены аналогичные результаты.

Экономический эффект от применения метаболина в расчете на одну голову молодняка крупного рогатого скота составил

8 — 12 руб., молодняка свиней — 5 — 7 руб. 10

1. Способ получения белково-пептидного комплекса из поджелудочной железыубойных животных путем экстракции ее водноспиртовым раствором с одновременным подкислением экстракта и последующим отделением нерастворимой части, отделением балластных веществ из экстракта и 20 осаждением высаливанием целевого продукта солями тяжелых металлов, о т л ич а ю щи и ся тем, что, с целью повышения биологической активности белковопептидного комплекса, осаждение солями прово8 дят вначале при рН 6,0 — 8,0, а затем пов. торно при рН 5,5 — 7,5 и в присутствии прота минсульфата при р Н 6,0 — 8,0.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что подкисленне экстракта проводят серной кислотой до рН 2,5 — 3,5 в течение

20 — 30 мин и соляной кислотой до рН

2,0 — 2,5 в течение 120 — 150 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение балластных веществ от экстракта проводят при рН 5,0 — 10,6, преимущественно при рН 6,0 — 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Авторское свидетельство СССР № 332832, А 61 К 17/04, 1972.

2. Ковалевская П. Т. Влияние инсулина на мясную продуктивность и некоторые показатели обмена веществ. Автореферат, Львов, 1965.

3. Обыденов В. А. Использование инсулина при откорме свиней — «Животноводство», 1969, № 11.

4. Авторское свидетельство СССР

¹ 351547, А 61 К 17/02, 1969.