Способ получения днк из биомассы еsснеriснiа coli

 

<п1 861399

Союз Советских

Соцнапнстнчесннк

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОВРЕТИНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свнд-ву(22) Заявлено 19.10.79 (21) 2869125/28 — 13 с присоединением заявки М— (23) Прнорнтет(51)М. Кл.

С 12 N 1 0&

1Ьеударстееаиыб кемитет

СССР де делам иеебретениа и еткрмтий (53) ЛК615 7396 . (088.82

Опубликовано 07.09;81, Бюллетень М 33

Дата опубликования описания, 07.09.81

М. Я. Хейслере, И. А. Шмите, С. Э, А берга . =, .;., и Л. К. Ясюкевнча

Ъ

j (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ИЗ БИОМАССЫ

ESCHE8 ICHIAC0U

Йзобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения

ДНК, применяемой в исследовательской работе молекулярной биологии.

Известен способ получения дезокснрибонук5 леиновой кислоты иэ биомассы Е. coii путем обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделением нз супернатаита фагов в градиенте концентраций хлористого. цезия, освобождением иэ ннх ДНК с последую те щей очисткой и осаждением .целевого продукта (1).

Однако . известный способ длителен (40 ч) и выход целевого продукта незначителен (0,32 м ДНК/1 г биомассы).

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и ускорение способа.

Эта цель достигается тем, что по способу получения ДНК иэ биомассы Е. coli путем: обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделения из супернатанта фатов в градиенте концентраций хлористого цезия, освобождения нз них ДНК и очистки целевого продукта, фаги после выделения очи- шают диализом против трис-буфера, содержащего 0,05 М NaCI и 0,01 М. ЕДТА, нри рН 7,9, освобождение ДНК проводят додецилсульфатом, а очистку осуществляют фенолом н смесью хлороформа с амиловым спиртом, вэитьтк в соотношении 24:1.

Способ осуществляют следующим образом.

Полученный осадок суспендируют в 0,01 М тряс-буфере, рН 7,9 — 8,0+10% хлороформа.

Очистку фага лямбда проводят в градиенте

СеС1. Полученную фракцию фага диализируют

2 ч против раствора, состоящего из 005 М

ИаС1, 0,01 М раствора трис, рН 7,9, 0,01 М

ЕДТА. Лизие клеток: фага проводят додеципсульфатом натрия. Депротеинизацию ДНК проводят феиолом со смесью хлороформ— изоамиловый спирт (24:1), ДНК осаждают спиртом.

Пример 1. 13 г биомассы еуспенднруют в 45 мл 0,01 М трис-буфере, рН 7,9—

$,Î, добавляют 4,5 мл хлороформа, выдерживают 20 мии при 37 С, потом охлаждают до 4 С. Центрифугируют IS мин при

15000 об/мин.

8613

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред А. Ач

Корректор Е. Рашко

Редактор Г. Бельская

Заказ 6456/7 Тираж 528

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Очистку фага проводят в 33 мл градиента

CsCI (d 1,4; d 1,5; d 1,3). Осадок центрифугируют.

Полученную массу фага диализируют 2 раза. по часу против 2 л буфера, содержащего

0,05 М NaCI, 0,01 М трис, рН 7,9, 0,01 М

ЕДТА — Na. К массе фага прибавляют 3,5 мл

10%-ного додецилсульфата натрия. Раствор нагревают до 48 С.

Для удаления белка к раствору, содержащему 1о фаговый ДНК, прибавляют фенол. Осадок центрифугируют, Операцию повторяют, к центрифугату прибавляют равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) . Осадок центрифугируют. К раствору прибавляют 15

2 объема этилового спирта.

Выход 0,4 мг лямбда ДНК/1 г биомассы.

Качество: Д 260/Д 280 > 1,8.

Пример 2, 10 г биомассы суспендируют в 45 мл 0,01 М трис-буфере, рН 7,9 — 8,0, добавляют 4,5 мл хлороформа, выдерживают

20 мин при 37 С, потом охлаждают до 4 С.

Центрифутируют 15 мин. при 15000 об/мин.

Очистку фага проводят в 33 мл градиента

CsCI (d 1,4; d 1,5: d 1,3). Осадок центрифугируют.

Полученную массу фага диализируют 2 раза по часу против 2 л буфера, содержащего

0,05 М NaCI, 0,01 М трис, рН 7,9, 0,01 М

ЕДТА — йа.

К массе фага прибавляют 3,5 мл 10 o-ного додецилсульфата натрия. Раствор нагревают до 48 C.

Для удаления белка к раствору, содержащему фаговый llHK, прибавляют фенол. Осадок центрифугируют. Операцию повторяют. К центри- З5

99 4 фугату прибавляют равныи объем смеси хлороформ-изомиловый спирт (24:1). Осадок центрифугируют. К раствору прибавляют 2 объема этилового спирта.

Выход 0,4 мг лямбда ДНК/1 г биомассы.

Качество: Д 260/Д 280 > 1,8.

Предложенный способ позволяет увеличить выход ДНК на 20% и сократить длительность процесса до 9 ч по сравнению с известным (40 ч). Ожидаемый экономический эффект

200000 руб/на 1 кг ДНК.

Способ получения ДНК иэ биомассы Escherichia coli путем обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделения из супернатанта фагов в градиенте концентраций хлористого цезия, освобождения из них ДНК и очистки целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения способа, фаги после выделения очищают диализом против трис-буфера, содержащего 0,05 М NaCI и 0,01М

ЕДТА, при рН 7,9, освобождение ДНК проводят додецилсульфатом, а очистку осуществляют фенолом и смесью хлороформа с амиловым спиртом, взятых в соотношении 24:1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. М. Thomas and R. W. 0aves. Studies on

the cleavage of bacteriophage lambda 0wa

with Е. сот1 Restriction Endonuclease 6 Md.

Biol. 1975, v. 91, р. 315 — 328.