Способ получения антибиотика с-15003 р-4

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту

Союз Советских

Социалистических

Республик (п 882414 (51) М. Кл, (22) Заявлено 16.1 178 (21) 2691551/28-13 (23) Приоритет - (32) 181177 (31) 139384/77 (33) Япония

С 12 0 9/14

1Ьаударсткяаый комитет

СССР ао даяаи яэобретений и атхрытяй (53) УДК 615..7, Р73 (О ) !

Опубликовано 15.1181 Бюллетень №42

Дата опубликования описания 15 1 131

Иностранцы 1ф

Еидзи Хигасиде, Казунори Хатано и Мицуко Ас и 1 фр,,(Япония)

rgr,, (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Такеда Кемикал Индастриз, ЛТД" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

С-15003 P-4

Изобретение относится к микробиологии и касается производства антибиотиков.

Предложенный антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение антибиотика.

Эта цель дости гается тем, что штамм

Nocardia sp.NC-15003 (АТСС-31281, 3F0-13726) выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с добавлением лейцина или его производных.

Штамм Nocardia sp. NC-15003, продуцирующий антибиотик, был выделен из почвы и других образцов.

Штамм NC-15003 депонирован в исследовательском институте ферментации Agency of Industrial Science and

Technology (FERM) под номером 3992, в институте фернентации, Осака (JFO) под номером JFO 13726 и в американской коллекции разновидностей куль2 тур (АТСС), Мэриленд, США под номером 31281.

Культурально-морфологические приз" наки. Вегетативный мицелий растет хорошо, гифы достигают 0,8-1,2 мкм, в диаметре, в некоторых случаях их можно разделить на фрагменты. Воздушный мицелий накладывается íà se" гетативный мицелий, часто образует

1р монолиты { 50-200Х200- 1000 мкм), на которых продолжается дальнейший рост °

Воздушный мицелий представляет собой волнообразные, прямые или петлеобразные спирали. Микроскопическое исследование старых культур показывает что лишь в нескольких случаях в цепях образуются конидии как клетки, тогда как клеточные суспензии, полученные с поверхностей таких культур содержат много удлиненных эллипсоидальных (0,8-1,2 мкм х 4,8-6,8 мкм) и эллипсоидальных (0,8-1,2 х: 1,О.2,0 мкм ) телец., похожих íà артроспоры

Сахарозо-нитратный агар : рост умеренный, цвет дыни до янтарно882414 рыжевато-коричневого, образует тела, похожие на монолиты. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый г>игмент отсутствует или бледный желтовато-рыжевато-коричневый.

Глицерино-нитратный агар : субстратный мицелий — рост умеренный, цвета слоновой кости, образует тела похожие на монолиты. Воздушный мицелий умеренный, белого цвета. Растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозо-аспарагиновый агар : рост умеренный, цвета календулы до яркожелтого. Воздушный мицег>ий скудный, белого цвета. Растворимый пигмент ярко-желтый

1лицериново-аспарагиновый агар рост умеренный, цвета слоновой кости

J образует тела, похожие на монолиты.

Воздушный мицелий скудный, белый.

Растворимый пигмент отсутствует.

Крахмальный агар : рост умереннь. й, цвета cBBTllo!": oI>oíoâoé кости до светло-г»пе>к>иного, Образует тела, похо>1/ие на моноли гы. Воздушный мице.>ий Обильный/ цвега светлой слоновой 1(Ости . Раствори>- .!l! Пи гигант От с >/ т (! в,,/ p

Агар на овсяной муке: рост умеренный, цвета от св:-тлол слоновой

Кос.ги до колон..альногo желтого, образует тепа, похожие на монолиты.

Воздушный мицег>ий скуднь>й, от белого до светло-желтого, Растворимый пи гмент отсутствуег, Тирозиновый агар : рост умеренl- .ûé, оТ cBpTIloé слоновой кости до цвета светло-желтой дыни, образует тела,, похожие на монолит. Воздушный мицелий умеренный, От белого до цвета светлой слоновой кости. Растворимый пигмент цвета верблюда. физиологические признаки. Температурный интервал роста 12-38 С.

Температурный интервал, в котором наблюдается хороший воздушный рост, составляет 20-35" С. Желатин разжижает. Крахмал гидролизует. Ни траты восстанавливает. Молоко пептонизирует, но не коагулирует. Казеин расщепляет. Иеланоидны@ пигменты на агаре с пептоном и дрожжевым экстрактом не продуцирует, на тирозиновом агаре продуцирует. Тирозин разлагает. Ксантин и гипоксантин не разлагает. Толерантность к.лизоциму положительная. Толерантность к хлористому натрию — 24. Очень хорошо растет на фруктозе, маннозе, хорошо растет на глюкозе, маннитоле, сахарозе, растворимом крахмале.

Усваивает ксилозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, трегалозу, раффинозу, мелибиозу, слабо усваивает мальтозу, глицерин, не усваивает

i-инозитол, D-сорбитол, лактозу.

Лейцин в качестве добавки можно применять в форме производного. Примерами производного являются алкильные сложные эфиры С1 -С например, метиловый эфир, этиловый эфир лейцина, амиды, такие как амид С1 -С

1 2 алкиламиды (например N-метиламид, йэтиламид) лейцина, его кетокислоты (например -кетоизокапроновая кислота) или их соли например гидрохлориды

Желательно (>С -форма лейцина. Применимыми являются также свободная форма лейцина и его производные и смесь производных.

Количество добавляемого к среде вещества составляет 0,01 — 1i (вес/объем), предпочтительно 0,1-, 0,54, Время добавления любое на протяжении продуцирования антибиотика

Р-4, предпочтительно добавлять в начале стадии культивирования.

Среда для культивирования антибиотика может содержать источники углерода и азота, неорганические вещества, следы питательных веществ.

В качестве источников углерода используют глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, декстин, крахмал, глицерин, маннитол, сорбитол, жиры и масла (например, масло из бобов,сои, свиное сало, куриный жир) .

В качестве источников азота используют мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевую муку, жидкость от замоченного зерна, пептон. муку хлопковых семян, мелассу, мочевину, соли аммония (например сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония ) и нитрат солей (например нитрат натрия, нитрат калия).

Среда также может содержать соли натрия, калия, кальция, магния; соли железа, марганца; цинка, кобальта, никеля, соли фосфорной кислоты, бор— ной кислоты.

Среда может содержать в качестве добавок витамины (например В > В никотиновую кислоту, В>,>С, Е), нуклеиновые кислоты (например пурин, пирими, дин и их производные) .

882414

Т а б л и,ц а 1

Выход мкг/мл

Соотношение компонентов,4

Количество добавок,4

Доба вляемое вещество

Время добавлс" ния, ч

ГГ

Р-2 Р-3 Р-4

10 65 25 10

Без добавки

5 28 67 13,5

0,1

L-Лейцин

L-Лейцин

8 13 79 11 5

5 30 65 10

0,3

0,1

L-Лейцин сМ (0) в графе "Время добавления" означает, что вещество добавлено в качестве одного из ингредиентов.

Таблиц а2

Добавляемое вещество

Выход мкг/мл

Соотношение компонентов,Ф

Время добавления,ч

Коли чест во добавки, 4

15 60 25 18

7 21 72 20

5 1 1 84 15

Без добавки

0,3

L-лейцин

L-. лейцин

0,5

Для установления нужного значения рН среды добавляют неорганические или органические кислоты, щелочи, буферные растворы. В качестве . антивспенивающих веществ добавляют подходящие количества масел, жиров, поверхностно-активных веществ.

Культивирование проводят в любых стационарных, со встряхиванием, аэробным погружением и других условиях для выращивания культур. Для получения высоких выходов предпочтительным является аэробное погружение культуры.

Инкубирование осуществляют при температуре 20-35 С при начальном рН 5,5-8,5, предпочтительным является интервал 23-30 С и рН 6,5-7,5.

Определение полученных P-2,P-3 и

P-4 осуществляют следующим образом.

Время инкубирования может быть

48-240 ч.

Получают антибиотик .следующим образом.

Штамм NC- 15003 выращивают в среде I, содержащей 33 растворимого крахмала, 0,23 хлористого .аммония, 0,053 сульфата магния, 1 093 калий дикислого фосфата, 2,093 дикалий

>о кислого фосфата, 0,0013 сульфата железа и добавочные. вещества, или в культуральной среде П, содержащей 5Ф декстрина, 33 жидкости от замачивания

;зерна, 0,13 пептона, 0,53. карбоната

1s кальция и добавочные вещества, и . затем эту среду культивируют. Результаты, полученные для среды Т, приведены в табл. 1, а результаты, полученные для среды II, приведены в

gp табл.2.

Питательный бульон экстагируют равным объемом этилацетата. Слой растворителя концентрируют и сушат, затем растворяют этилацетатом для получения 1/100 объема исходного бульона, Продукты определяют тонкослойной хроматографией на силикагеле, используя насышенный водный раствор этилацетатом. Получаемое количество и соотношение компонентов определяют по величине поглощения на длинноволокновом ТСХ-многоточечном измерительном приборе модели CS-910 на основе интеграл-плотностей каждого пятна на хроматограмме при 254 мм. Отношение компонентов представлено в процентах вес/вес в общих продуктах, P-2, P-3, Р-4. Как показано в табл. 1 и 2 штамм NC-15003 продуцирует антибиотик Р-4 в количестве 65-8М от общего количества в присутствии специфических добавок, и 2Я или меньше в отсутствие таких добавок, Поэтому выделение P-4 из питательного бупьона является в первом случае более

l эффективным, чем so втором.

Так как P-4, полученный таким способом в ферментационной жидкой среде, является липофильным нейтральным веществом, его обычно выделяют из питательного бульона в соответствии со способами выделения и очистки которые обычно используют для выделения таких микробных метаболитов, Р-4 легко экстрагируется из питатель-* ного фильтра несмешивающимися с Во дой органическими растворителями, такими как сложные эфиры жирных кислот,. например этилацетат и амилацетат, спирты, например бутанол, галоидированные углеводороды„ например хлороформ, кетоны, например метилизобу тилкетон. Экстрагирование Р-4 проводят при рН, близком к нейтральному, и предпочтительно экстрагируют этилацетатом, рН которого равен 7. Экстракт промывают водой и концентрируют при пониженном давлении. Затем к концентрату добавляют неполярный растворитель, например петролейный эфир или гексан, и выделяют в виде осадка сырой продукт, содержащий активное соединение. Полученный сырой продукт подвергают при желании обычным способам очистки. Так, в качестве

2414 8 обычного способа очистки может быть использована адсорбционная хроматография. Для этой цели используют один из обычно применяемых адсорбентов, например силикагель, окись алюминия, макропористые неионные смолы, ад-сорбенты и т.д,. P-4 в сыром продукте отделяют на таком силикагельном хроматографе, например, с помощью о

25 зО

50 петролейного эфира и гексана и элюирование осуществляют, добавляя такой полярный растворитель, как этилацетат, ацетон, этанол или метанол, или галоидированный водород, как дихлорметан или хлороформ с добавкой полярного растворителя, такого как спирт, например метанола или этанола, кетона, например, ацетона или метилэтилкетона, или тому подобных. Таким образом можно элюировать, выделить и получить Р-4.

Если в качестве средств очистки используют адсорбент как макропористую смолу, то элюирование проводят смесью воды с низшим спиртом, низшим кетоном или сложным эфиром. Например, низшим спиртом может быть метанол, этанол, пропанол или бутанол, низшим кетоном может быть, напри. мер ацетон метилэтилкетон. В качестве сложного эфира может быть этилацетат, бутилацетат. Сырой продукт

И растворяют в 603 смеси метанол вода и адсорбируют на колонке Diàion

НР-1. Колонку промывают 703 смесью метанол-вода. Затем осуществляют элюирование P-4 904-ной смесью метанол-вода.

Фракции, содержащие P-4, собирают и концентрируют при повышенном давлении. К сухому продукту добавляют

5-8 объемов этилацетата и полученную смесь оставляют выстаиваться, после чего выделяют кристаллы Р-4

Выход антибиотика достигает около 653 или более, при этом P-4 легко выделяется из питательного бульона. Поэтому предлагаемый способ является преимущественным для промышленного получения Р-4.

Физико-химические свойства P-4 приведены в табл. 3.

88241 4

С-15003 P-4

Антибиотик

С Н C1N 09 = 649,196

177- 180 — 142 g 10 (С = 0,522 СНС1З ) Найдено, 3

N 4,32 о

С1 5,46

Рассчитано,%

233(29900)240(плечо 28240)

252(275590) 280(5712) 288(5680) (в метаноле) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038

1,03 (д) (6Н)

587,485, 470, 450

Нерастворим в петролейном эфире, гексане, воде. Умеренно растворим в бензоле, эфире. Растворим в хлороформе, этилацетате, ацетоне, этаноле, метаноле, пиридине, тетрагидрофуране, диметилсульфоксиде

Драгендорф : положительная

Бельштейн : положительная формула

Точка плавления, С

Удельное вращение

id (É0

Элементарный анализ

Элементарный анализ

Ультрафиолетовый спектр поглощения НМ (6 ) Инфракрасный спектр поглощения КВ г, см

ЯМР-спектр частиц на млн, 100 МгГ в СДИ

Масс-спектр (m/е)

Растворимость

Цветовая реакция

С 60,65

Н 705

N 4,25

С1 5 23

С 61,05

Н 6,99

Таблица 3

882414

Антибактериологическая активность

По способу бумажных дисков определяют ингибирующие концентрации штамма выращенного на триптикинозно-соевом агаре (BBL) против микроорганизмов, перечисленных далее. Так, диски фильтровальной бумаги, пропитанные каждый 0,02 мл раствора концентрации 300 мкг/мл Р-4, помещают на пластины, инокулированные соответственно микроорганизмамй, перечисленными ниже, для определения минимальной ингибирующей концентрации.. Полученные результаты показали, что антибиотики не обладают активностью против следующих микроорганизмов : Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis Bacil1us

cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Mycobacterium

avium.

С другой стороны, на агаровых пластинках, содержащих испытываемую среду (3,5 r динатрийфосфата, 0,5 г монокалийфосфата, 5 г дрожжевого экстракта (Difco) 10 r глюкозы, 15 r агара, 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,0), было определено ингибирование роста Talaromyces аче11aneus В этом опыте минимальная ингибирующая концентрация составляет i 1,5 мкг/мл для P-4. Далее культивируют в качестве исследуемого организма дикий штамм Tetrahymenapyriformis х на опытной среде, состоящей из 20 г протеоза-пептона (Difco)

1 г дрожжевого экстракта, 2 г глюкозы

1000 мл дистиллированной воды и

10 мл 1 Н фосфатного буфера рН 7,0

)при 28 С в течение 44- 48 ч и определяют методом последовательных разбавлений активность ингибирования роста антибиотиков против этого конкретного микроорганизма. Оказалось, что ингибирование роста наблюдается при концентрации 0,5 мкг/мл для

С- 15003 Р-4.

Р-4 обладает активностью против следующих микроорганизмов

Fus с1ад!цв levieri, Helminthosporium

s i gmoi deum var, i rregul are, Pyricularia oryzae, Cochl ioborus

miyabeanus, Sclегоtinià sclегоtiorum

Pell icularia sasakii, Trichophyton

rubrum, Rhodotorula rubra u

Сгyptococcus neoformans.

5 о

Антиопухолевая активность. Было исследовано терапевтическое действие

P-4 вводимого внутрибрюшинно в течение 9 последовательных дней, против лейкемии Р388 у мышей (1х106 клеток/животное, трансплантированных внутрибрюшинно)1. Результаты показали, что в единицах степени продления продолжительности жизни эти соединения обладают антиопухолевой активностью порядка 2004 при уровне дозы 0,00625 мг/кг в день.

Токсичность. В тестовых испытаниях на острую токсичность, проведенных на мышах в качестве подопытных животных, которые предусматривали внутрибрюшинные инъекции Р-4, все исследованные антибиотики продемонстрировали величину ЛД,р>= го я0,625 мг/кг и ЛД = 0,313 мг/кг

Антибиотик Р-4 обладает высокой ингибирующей активностью против грибковых организмов и простейшых и поэтому представляет ценность в ка25 честве фунгицидного агента или агента против простейших. Кроме того, так как P-4 демонстрирует продлевающее продолжительность жизни действие у млекопитающих, у которых зв есть опухоль (например мышей ) можно также ожидать, что это соединение сможет найти применение в качестве антиопухолевого лекарства.

Как фунгицид или агент против простейших Р-4 можно испольэовать

" для оценки бактериальной экологии в почве, активном иле, жидкости животных организмов и т.д. Так, если нужно выделить ценные бактерии из обр,зз4в цов почвы или если нужно оценить действие бактерий независимо от грибковых или простейших организмов при работе и исследовании активных илистых систем, используемых для очистки сточных вод,то можно использовать антибиотик для получения селективного роста бактериальной флоры, сопровождающегося подавлением роста загрязняющих грибковых или простейших организмов в образце. В этом

50 случае образец добавляют к жидкой или твердой среде и на 1 мл среды добавляют 0,1 мл раствора 10100 мкг/мл антибиотика в li-ной сме— си метанол-вода, после чего образец инкубируют.

Р-4 можно также использовать в . качестве бактерицидного агента для борьбы с болезнями растений, вызван

882414 ными микроор гани змами, упомянутыми выше. Как случай типичного применения

P -4 используют в виде 14-ного метанольного водного раствора, содержа-, щего 0,5 мкг/мл - 5 мкг/мл антибиотика

Так, например, P-4 можно использовать для контроля за красновато-коричневой листовой гнилью, бластом, гельминтоспориозной пятнистостью листьев и листовым заболеванием рисовых растений.

Пример 1, 40 мл засеянной культуральной среды (1,03 глюкозы, 2,0 бактотриптона, 1,24 бактодрожжевого экстракта, рН 7,0 ) выливают в колбу Эрленмейера объемом

200 мл. После стерилизации в среду .нкубируют Nocardia sp. С-15003 (JF0 13726 : АТСС 31281 : FERN 3992) о

Инокулянт инкубируют при 28 С во вращающемся шейкере (200 об/мин) для получения засеянной культуры.

Эту засеянную культуру трижды промывают стерилизованной дистиллированной водой и промывные клетки выделяют до исходного количества стерили— зованной дистиллированной водой.

1 мл полученного вещества инокули— руют в основную культуральную среду 3r, растворимого крахмала, 0,24 хлористого аммония,0,053сульфата магния, 0,093 монокалийфосфата, 2,093 дикалийфосфата 0,0011 сульфата железа, 0,3i 1.-лейцина), и основную культуральную среду выдерживают при 28 С

8 дней во вращающемся шейкере (200 об/мин) . Общее количество полученного С- 15003 составляет 12 мкм/мли 80 его составляет,Р-4.

Пример 2. Готовят тот же посев культуры, что и B примере 1, и

500 мл засеянной культуры выливают в колбу Сакагуши объемом 2000 мл;

После стерилизации питательной среды среду инокулируют тем же штаммом, что и в примере 1. Инокулированную среду культивируют при 28"С 48 ч с вращательно-поступательным движением { 110 ход/мин ) до получения засеянной культуры. 100 л засеянной культуры (2,03 глюкозы, 3,03 растворимого крахмала, 1,04 жидкости замоченного зерна, 1,0i соевой муки, 0,53 полипептона, 0,34. хлористого натрия, 0,53 карбоната кальция, рН 7,0) готовят и выливают в 200литровый ферментер из нержавеющей стали. После того как ферментер стерилизуют при 121 С 20 мин и охлаждают, в него инокулируют 500 мл засеянной культуры. Содержимое культивируют при 28 С 48 ч при скорости аэрации 100 л/мин, скорости перемешивания 200 об/мин.

Питательный бупьон (10 л ) помещают в 100 литров питательной среды (51 декстрина, 34 жидкости от замачивания зерна, 0,14 пептона, 0,5ь 1 "

1о лейцина, 0,53 карбоната кальция, рН 7,0 ) в 200-литровом ферментере из нержавеющей стали. Ферментацию проводят 4 дня при 28 С при скорости аэрации 100 л/мин и скорости перемешивания 150 об/мин. Полное количество полученного С-15003 составляет 12 мкг/мл, и P-4 С-15003 составляет около 853(вес/вес).

Пример 3. К 95 л жидкой питательной среды, полученной в примере 2, добавляют 50 л ацетона. Полученную смесь перемешивают 30 мин.

К полученной смеси добавляют 2 кг

hyf1o-superce11 и полученную смесь хорошо перемешивают. Полученную смесь отфильтровывают на фильтре под давлением, в результате чего получают

13,5 л фильтрата. К полученному фильтрату добавляют 50 л воды и 90 л этилацетата, полученную смесь перемешивают и экстрагируют. Процедуру повторяют дважды. Полученные слои этилацетата объединяют и дважды промывают 80-литровыми порциями воды.

К слою добавляют 1 кг безводного суль35 фата натрия, высушивают и концентрируют до 200 мл. К полученному концентрату добавляют петролейный эфир, и образовавшийся осадок выделяют фильтрованием, в результате чего получа40 ют 35 г продукта.

К полученному таким образом сырому продукту добавляют 50 мл этилацетата и полученную смесь перемешивают. Нерастворимую часть выделяют фильтрованием и к фильтрату добавляют

10 г силикагеля. После перемешивания полученной смеси этилацетат отгоняют при пониженном давлении. Остаток помещают в верхнюю часть колонки с силикагелем (500 мл) . Элюирование проводят последовательно 500 мл к -гек" сана, 500 мл смеси и — гексан: этилацетат (3:1), 2000 мл смеси я -гексан: этилацетат (1:1) и 2000 мл насыщенного водного раствора этилацетата.

При этом элюат собирают в 50-миллилитровые фракции. По 1 мл от каждой фракции концентрируют досуха и к по8824

Формула изобретения

Составитель С.Иалютина

Редактор N.Öèòêèíà Техред З.фанта Корректор Н.Швыдкая

Заказ l0009/88 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 лученному концентрату добавляют

0,1 мл этилацетата до получения смеси. Смесь дает пятно на расстоянии

2,5 см от нижнего края пластины силикагель - стекло и проявляется около

17 см растворителем (вода, насыщенная этилацетатом}. После проявления проводят определение ультрафиолетовым излучением (2537 А). Активные фракции

Rf 0,49 собирают. и концентрируют при 1о понин йном давлении до з2 мл. К этому конф4 А ату добавляют 20 мл петролей" ного эфира, @ результате чего получают 1,08 г" Дip ix кристаллов. Сырые кристаллы растворяют в 20 мл теплого этилацетата. Ъосле охлаждения выделяют 920 мг. кфйсталлов Р-4. Темпео ратура подавления 178-180 C (P-4, 943 вес/вес).

П р и- м е р 4. В 400 мл 504 метано- о ла растворяют 20 г сырого продукта, полученного в примере 3. Колонку ."

2 5 см в диаметре набивают 1000 мл, диайона HP-10 и готовят 3000 мл 50iной смеси метанол-вода. Приготовлен- д ный таким образом раствор .образца пропускают через колонку и промывают, используя 1000 мл 603-ного метанола и последовательно проводят градиентное элюирование 7500 мл 60 - з ной смеси метанол-вода, 7500 мл 95Фной смеси метанол - вода. Элюат собирают в 75 мл фракции и каждую фракцию исследуют тонкослойной хроматографией на силикагеле, описанной в при35 мере 3 ° фракции NN 182-190 собирают и концентрируют. К полученному концентрату добавляют 500 мл воды и 1000 мл

14 16 этилацетата. Получерный раствор встряхивают в разделительной воронке и водный слой отделяют, пьсле двухкратного промывания 300 мл воды этилацетатный слой высушивают над безводным сульфатом-натрия, концентрируют и оставляют выстаиваться. В результате получают кристаллы, которые собирают фильтрованием и высушивают. Получают 950 кг P-4. Температура плавления 177- 179 С (P-4, 924 вес/вес).

Пример 5. Используя методику примера 1, но вместо L-лейцина применяя метиловый сложный эфир лейцина

Й-метиламид лейцина, бС -кетоизокапроновую кислоту или гидрохлорид лейцина, получают тот же результат, а именно получают специфически требуемый P-4.

Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик С- 15003 P-4.

Способ получения антибиотика С-15003 Р-4 о т л и ч а ю щ и и с я тем, что штамм Nocatdia ap

NC-15003 (АТСС-31281, JFQ 13726) выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота с добавлением лейцина или его производных.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Предложенный антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 Способ получения антибиотика с-15003 р-4 

 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к рекомбинантному микроорганизму Lactobacillus sp., продуцирующему D-молочную кислоту, способу его получения и способу получения D-молочной кислоты с использованием указанного микроорганизма. Рекомбинантный микроорганизм Lactobacillus sp. получают инактивированием L-лактатдегидрогеназы (L-LDH) и усилением активности D-лактатдегидрогеназы (D-LDH) в микроорганизме Lactobacillus sp., продуцирующем больше L-молочной кислоты, чем D-молочной кислоты. При этом указанный микроорганизм Lactobacillus sp. выбран из группы, состоящей из Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus. Способ получения D-молочной кислоты включает культивирование указанного рекомбинантного микроорганизма Lactobacillus sp. с получением культурального бульона и извлечение D-молочной кислоты из культурального бульона. Группа изобретений обеспечивает высокий выход D-молочной кислоты. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к аналогам фактора комплемента B, и может быть использовано в медицине для лечения заболевания, опосредованного активацией альтернативного пути комплемента. Получают полипептид, состоящий из hfB3-292S (аминокислоты 1-764 или 26-764 в SEQ ID NO: 2), hfB3-292SN480 (аминокислоты 1-480 или 26-480 в SEQ ID NO: 2) или hfB3-292S-Fc (аминокислоты 1-990 или 26-990 в SEQ ID NO: 22). Изобретение позволяет эффективно ингибировать активность альтернативного пути комплемента при использовании полученного полипептида, кодирующей его нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл., 19 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ повышения экспрессии гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, включающий: приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 10 до 30 нуклеотидов, который специфично гибридизуется с комплементарным участком природного антисмыслового полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и повышает, за счет этого, экспрессию указанного гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro. Также представлен антисмысловой олигонуклеотид длиной приблизительно 10-30 нуклеотидов, содержащий по меньшей мере одну модификацию, где указанная по меньшей мере одна модификация выбрана из: по меньшей мере одного модифицированного фрагмента сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций; причем указанный антисмысловой олигонуклеотид гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1), имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, и повышает, за счет этого, экспрессию гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) in vivo или in vitro по сравнению с контролем, и при этом: указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку длиной 10-30 нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 2, или указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную участку из 10-30 нуклеотидов в последовательности SEQ ID NO: 1. Кроме того, описаны композиция, содержащая представленный антисмысловой олигонуклеотид, и способ предотвращения или лечения заболевания, связанного с геном сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) и/или кодируемым указанным геном MBTPS1 продуктом, включающий использование представленного антисмыслового олигонуклеотида. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен генетически модифицированный микроорганизм для получения бутадиена, представляющий собой бактерию, дрожжи, нитевидные грибы, простейшие или водоросли и содержащий один или более полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, катализирующие превращение ферментируемого источника углерода в кротонил-КоА, и один или более полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, катализирующие превращение кротонил-КоА в бутадиен, где указанными ферментами являются или кротонил-КоА-редуктаза (бифункциональная) (Е.С.1.1.1) и дегидратаза кротонилового спирта (Е.С.4.2.1, 4.2.1.127), или дегидрогеназа кротонилового альдегида (Е.С.1.2.1), дегидрогеназа кротонилового спирта (Е.С.1.1.1, 1.1.1.1) и дегидратаза кротонилового спирта (Е.С.4.2.1, 4.2.1.127). Представлен способ получения бутадиена из ферментируемого источника углерода путем его контактирования с указанным микроорганизмом. Группа изобретений позволяет осуществлять более экономичное анаэробное ферментативное получение бутадиена. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 14 табл., 2 пр.
Наверх