Способ получения тетрадекапептида
ОП ИСАНИЕ.
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Н ПАТЕНТУ
Союз. Советских
Социалистических
Республик 1п 904519
Ф г "М и, " (61) Дополнительный к патенту— (51) М. Кл.
3 (22) Заявлено 05.01,79 (21) 2607708/2705047/
/23-04 (23) Приоритет 20..04.78 (32) 21.04.77
С 07 С 103/52
Государственный комитет есср (31) 789472 (33) США
Опубликовано 07.02.82. Бюллетень № 5
Дата опубликования описания 07.02,82 ао лолам изобретений и отерытнй (53) УДК 547.964. .4.07 (088;8) (72) Автор изобретения а
Иностранец
Джеймс Эдвин Шилдс (США) Иностранная фирма
"Эли Лилли энд Компашт" (США) (71) Заявитель
1.qq ь-,c1- у, 7ч;, . (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРАДЕКАПЕт1ТИЛА
Rg
"т соединение формулы
Изобретение относится к получению нового тетрадекапептида, биологически активного соединения, которое может найти применение в биологии и медицине.
Известен способ получения пептидов путем одновременного отщепления защитных групп и полимерной смолы от пептидной смолы обработкой соответствующей пептидной смолы фтористоводородной кислотой в присутствии анизола или метилмеркаптана (11.
Цель изобретения — получение нового тетрадекапептида.
Поставленная - цель достигается тем, что согласно способу получения тетрадекапептида формулы
Н-0- Val-G ly-Cys- Lys- -Asp-Phe- Pbe- Trp- Lys- Thr- Phe- Thr-Ser-Cys-OH (I) R-0-7.а1- G ly-Ñós (R > ) - Lys (Rq) -Asp- Phe- Phe-Тгр (Яе) - Lys (R>) - Thr (R s) -Phe- (l l)
-Т1 г(нз) -$ег(В4) -Cys(Ri) Х, где R — водород или трет-бутилотссикарбонил; — водород или метоксибензил; — водород, или о-хлорбензилоксикарбонил;
R3,R< каждый, водород или бензил;
5 Х вЂ” ОСН -rbennn-смола обрабатывают фтористоводородной кислотой в присутствии анизола или метилмеркаптана.
Пример 1. й-трет-Бутилоксикарбонил-1 -цистеинил (8-л-метоксибензил) - метилиров ан- . до ная полистирольная смола.
К 500 мл и й-диметилформамида, содержащего цезиевую соль N -трет-бутилоксикарбонип- (S-n- метоксибензил) -цистеина, полученную из 9,06 г (26,5 моль) свободной кислоты, 1а добавляют 51,0 г хлорметилированной полистирольной смолы (0,75 ммоль/г).. Смесь перемешивают при комнатной температуре 6 дн. Смолу отфильтровывают, последовательно промьтвают 3 раза смесью 90% диметилформамида оО и 10% воды, 3 раза 95%-ным этанолом и 3 база диметилформамидом. К смоле, суспендированной в 500 мл диметилформамида, добавляют раствор 10,5 г ацетата цезия. Смесь перемешивают 6 ди при комнатной температуре. Смо25 ллу у ооттффииллььттррооввьытввааюютт, промывают последователь
3 904 но 1 раз водным диметилформамидом 3 раза смесью 90% диметилформамида и 10% воды, 3 раза,95%-ным этанолом 3 раза хлористым метиленом, 3 раза 95 »ным этанолом и 3 раза хлороформом. Малую часть смолы удаляют 4-кратным суспендированием в хлороформе, декантируя каждый раз жидкость. Затем смолу высушива- ют в вакууме при 40 С в течение ночи, получают 44,8 г тетрадекапептида. Анализ показывает содержание 0,25 ммоль цистеина на 1 г смолы. Пистеин определяют в виде цистеиновой кислоты, полученной при кислотном гидролизе смесью диоксана и концентрированной хлористоводородной кислоты 1:1, к которой добавляют небольшое количество диметилсульфоксида.
Пример 2. К-грег-Бутилоксикарбонил-0-валил-глицил-L- (S-n-метоксибензил) -цистеинил-1-(N -о-хлорбензилокси-карбонил)-лизилЯ . - L-аспарагинил- L-фенилаланил- L-фенилаланил-1 ° (формил) триптофил-1- (N -о-хлорбензилокси1 карбонил) -лизил- L (о-бензил) -треонил- L-фенилаланил-1-(о-бензил)-треопил- L-(o-бензил)-серил-1-(S-n-метоксибензил)-цистеинил-метилированная полистирольная смола.
Продукт, полученный в примере 1 (7,0 r), загружают в реакционный сосуд прибора
Бекмана 990 для автоматического синтеза пептидов и двенадцать из остальных тринадцати аминокислот добавляют в этот автоматический прибор. Получен ею защищенную тридекапептидную смолу разделяют на две равные порции и концевой остаток вводят в одну из этих порций. Применявшиеся аминокислоты, а также последовательность их применения, следующие
N- грет- Бутилоксикарбонил- (о- бензил)- 1-- серии;
N-грег-бутилоксикарбонил- (o-бензил)-1-треонин;
N- грет- бутилоксикарбонил-1 -фенилаланин; й- трет-бутилоксикарбонил- (о-бензил)-1 - треонин;
N- трет- бутилоксикарбонил- и -о-хлорбензилоксикарбонил-1 -лизин;
N -трет-бутилоксикарбонил- (й-формил)-1-триптофан; й-трет-бутилоксикарбонил-1=феннлаланин;
N-трет- бутилоксикарбонил-L-аспарагин и-нитрофениловый эфир;
N- грет-бутилоксикарбонил- Й -о- хлорбензил-ок сикарбонил-1 -лизин;
N- тРет- бутилоксикарбонил- (p-n- метоксибензин)-1-цистеин; й-трет- бутилоксикарбонил-глицин; й-грег-бутилоксикарбонил-О-валин.
Последовательность отщепления защитных грутпт, нейтрализации, сочетания и нового сочетания для введения каждой аминокислоты в пептид следующая.
519 4
1. Три промывки хлороформом (10 мл/г смолы), по 3 мин каждая;
2. Удаление бутилоксикарбоновой группы двукратной обработкой, каждая 20 мин, смесью 29% трифторуксусной кислоты, 48% хлороФорма, 6% триэтилсилана и 17% хлористото метила (10 мл/г смолы);
3. Три промывки, по 3 мин каждая, хлороформом (10 мл/г смолы);
1п 4. Одна промывка 3 мин хлористым метиленом (10 мл/г смолы); . 5. Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% трет-бутилового спирта и 10% трет-амилового спирта (10 мл/г смолы);
7, Нейтрализация тремя обработками, по 3 мин каждая, 3%-ным триэтиламином в хлористом метилене:, 8. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
9, Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% трет-бутилового спирта и 10% трет-амилового спирта (10 мл/г смолы);
10. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
11. Добавление 1,0 ммоль/г смолы, защищешюй аминокислоты и 1,0 ммоль/г смолы
N> N-дициклогексилкарбомида в 10 мл/г смолы хлористого метилена с последующим перемешиванием в течение 120 мин;
12. Трехкратная промывка 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
13. Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% бутилового спирта и 10% трег-амилового спирта (10 мл/г смолы);
14. Три промывки, по 3 мин каждая„ хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
15. Нейтрализация тремя обработками, по 3 мин каждая, З о-ным триэтиламином в хлористом метилене (10 мл/г смолы);
16. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
17. Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% трет-бутилового спирта и 10% грет-амилового спирта (10 мл/г смолы);
18. Три промьвки, по 3 мин каждая, 4 хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
19. Три промывки, по 3 мин каждая, диметилформамидом;
20. Добавление 1,0 ммоль/г смолы, защищенной аминокислоты и 1,0 ммоль смолы. П N> N-дициклогексилкарбодиимида в 10 мл/г смолы смеси диметилформамида и хлористого метилена 1:1 с последующим перемешиванием в течение 120 мин;
21. Три промывки, по 3 мин каждая, диметилформамидом (10 мл/г смолы);
22. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
5 90451
23. Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% трет-бутилового спирта и 10% трет-амилового спирта;
24. Три промывки, по 3 мин хлористым метиленом (10 мл/г смолы);
25. Нейтрализация тремя обработками, по 3 мин, 3%-ным триэтиламином в хлористом метилене (10 мл/г смолы);
26. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г. смолы);
27. Три промывки, по 3 мин каждая, смесью 90% трет-бчтилового спирта и 10% трет-амилового спирта;
28. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы).
Приведенную последовательность обработок применяют при добавлении каждой из аминокислот, эа исключением глицинового и аспарагинового остатков. При добавлении глицинового остатка применяют только стадии 1 — 18.
Аспарагиновый остаток вводят через его активный и-нитрофениловый эфир. При этом стадия 2 была изменена на три следующие последовательные стадии: а) три промывки, по 3 мин каждая, диметилформамидом (10 мл/г смолы); б) добавление 1,0 ммоль/г смолы и-нитрофенилового эфира N- трет-бутилоксикаобонил-1-аспарагина в 10 мл/г смеси днметилформамида и хлористого метилена (1:3) с последующим перемешиванием в те30 чение 720 мин, в) трн промывки по 3 мин каждая, диметилформамидом (10 мл/г смолы).
Также изменена стадия (20) и использован и-нитрофениловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-1-аспарагина в смеси диметилформамида и хлористого метилена (1:3) с последующим перемешиванием в течение 720 мин.
Готовую пептидную смолу сушат в вакууме. Порцию продукта гидролизуют кипячением с обратным холодильником в течение
72 ч со смесью диоксана и хлористоводородной кислоты. Анализ содержания аминокислот в получившемся продукте дает следующие результаты (в качестве стандарта применялся лизин): Asp 1,04; Thr 2,68; Ser 1,08;
Val 1,12; Gly 1,04; Phe 3,87; Lys 2,00;
Trp 0,75.
Триптофан определяют после 21-часового гидролиза образца продукта в присутствии диметилсульфоксида и тиогликолевой кислоты.
Цистеин не определен, так как он разрушается при этом методе анализа.
Пример 3. D-Валил-глицил-1-цистеинил-1-лизил-1-аспарагинил- L-фенилаланил- L-фенилалаиил-1-триптофил-1 -лизил-1 -треонил-1-фенилаланил- L-треонил-1- серил-1-цистеин. где R — водород или трет-бутилоксикарбонил;
R1 — водород или метоксибеизил; — водород или о-xJIop66H3HJIoKGH
S0 карбонил;
R3Я4 — каждый, водород или беизил;
Rs — водород или формил;
Х вЂ” OCk -фенил-смола обрабатывают фтористоводородной кислотой
Я ,в присутствии анизола или метилмеркаптаиа.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Шредер Э., Любке1 . Пептиды. Ч.
М., "Мир", 1967, с. 88.
К смеси 5 мл анизола и 5 мл этилмеркаптана добавляют 2,828 г защищенной тетрадекапептид-смолы (уровень замещения з
9 6
0,150 ммоль/г) примера 2. Смесь охлаждают в жидком азоте и добавляют дистилляцией
56 мл фтористого водорода. Получившуюся о смесь нагревают до 0 и перемешивают 2 ч.
Затем фтористый водород отгоняют и к оставшейся смеси добавляют эфир. Смесь охлажо дают до 0 и получившееся твердое вещество отфильтровывают и промывают эфиром. Продукт сушат и незащищенный тетрадекапептид экстрагируют из смеси смолы 1 М уксусной кислоты. Затем уксуснокислый раствор подвергают лиофилиэации досуха в темноте. По1 лучившееся белое твердое вещество суспеидируют в смеси 10 мл дегазированной 0,2 М уксусной кислоты и 4 мл ледяной уксусной кислоты.. Получившуюся суспензию нагревают, но твердое вещество при этом не растворяется полностью. Нерастворившуюся часть отфильтровывают и мутный бесцветный фильтрат загру- ., жают в колонку с сефадексом С-25 F. Условия хроматографирования: растворитель — дегазированная 0,2 М уксусная кислота; размеры колонки — 7,5 х 150 см; температура — 26 С; скорость пропускания — 629 мл/ч; объем фракции — 22,0 мл.
Мера поглощения света при 280 мкм каждой фракции, нанесенная в зависимости от номера фракции, показывает большой пик с последующим уступом, Ультрафиолетовая спектроскопия обнаруживает, что главный пик дает целевой продукт. Фракции объединяют. Объем фракции 224 — 240 — 4906 — 5280 мл, пик — 5054 ми.
Собранные фракции не включают последующего уступа. Ультрафиолетовая спектроскопия показывает, что присутствует 175 г продукта (выход 24,8%). Титрование аликвоты по Эллману показывает содержание свободного сульфогидрила в количестве 93,6% от теоретического.
Формула изобретения
Способ получения тетрадекапептида формулы l Н-0-Val-61у-Cys-Lys-Asp-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, о т л и ч а юшийся тем, что соединение формулы П
В-О- Val-G ly-Cys (R1) - Lys (Rz) -Asp-Phe-Phe- Trp(В )- Lys(Rq)-ТЬr (Вэ)-Phe- Thr (Яз)-Ser (R4}-Cys(RI) Х,
