Производные дезокситионуклеотидов как мономеры для синтеза политиодезоксинуклеотидов и способ их получения

 

О П И С А Н И Е 1„,с12щр)

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АЗТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

{61) Дополнительное к авт.свид-ву (22)Заявлено 20.08.76 (21) 2405856/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 07 03 82, Бюллетень № 9

Дата опубликования описания l 0. 03. 82 (5 2 ) М. Кл.

С 07 Н 19/04

211аудеретвеиивй коиитет

СССР ио аеиаи изобретений и открытиЯ (53) УДК 547.

963.07 (088.8) 1

В.П. Кумарев, В.Б. Богачев, В.Ф. Кобзев В Jl.Â.- Баранова; з

1: .

Институт цитологии и генетики Сибирского" отде ления

АН СССР (22) Авторы изобретения (71) Заявитель

-(54) ПРОИЗВОДНЫЕ ДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ КАК МОНОМЕРЫ

ДЛЯ СИНТЕЗА ПОЛИТИОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ

И СПОСОБ MX ПОЛУЧЕНИЯ

8-С,Н,1 1 о ок+ Щ

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к производным дезокситионуклеотидов общей формулы где 8 - остаток тимина, N -- анизоилЧ цитозина Мь-бензоиладенина, или М -изобутирилгуанина;.

К - ион МН,, Ма, 11., 15 и к способу их получения.

Указанные соединения, их.свойства и способ получения в литературе не описаны.

Производные дезокситионуклеотидов формулы используются 8 качестве мономеров для ступенчатого синтеза политионуклеотидов.

Известен ряд производных дезокси" тионуклеотидов, используемых для олиготионуклеотидного синтеза: 5 -О -ToS (толуолсульфонильные) производные тимидин-3 -0-2-цианэтилфосфотиоата, М -бензоилдезоксиаденозин-3 -0-21

-цианэтилфосфотиоата и М -бензоилдезоксицитидин-3 -О-2-цианэтилфосфотиоата, 5 -Br- и 5 -СВ -производные тимидин-3 "О-2-цианэтилфосфо тиоата 313, 5 -О-ToS-производные тимидин-3 -S"2-цианэтилфосфотиоата и

N В-бензоилдезоксиаденозин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоата 21 .

Наиболее пригодными из них являются производные (2). Наличие электрофильной 5 -О-ToS и нуклеофильной 3 -S-2-цианэтилтиофосфатной групп позволяет использовать такие соединения для ступенчатого наращивания оли" гонуклеотидной цепи.

Недостатком таких производных является их низкая реакционноспособ1 ность, что приводит к значительному ф где В имеет приведенные значения, конденсируют с 2-5-кратным избытком

S"2-карбомоилэтилтиофосфата в смеси гексаметилтрифосфамида (80-903) и пиридина (10-20В) при помощи 6"

15-кратного избытка дициклогексилкарбодиимида.

Указанные производные дезокситионуклеотидов реагируют с дезоксинуклеозид-3 -фосфотиоатами на два порядка

1 быстрее, чем соответствующие тозиль" ные производные. Это трудно было предвидеть, так как для более простых производных наблюдается обратная зависимость: алкилирующая способность алкилтозилатов в два раза выше алкилиодидов.

Пример 1. 5 -Иодтимидин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоат.

Смесь пиридиниевой соли (1,28 r, 4 ммоль) пропусканием через катионо« обменную смолу Дауэкс-50 в пиридиниевой форме и 5 -йодтимидина. (0,35 г, 1 ммоль) высушивают упариванием с сухим пиридином(2 4 мл) на ротационном испарителе. Затем добавляют гексаметилтрифосфамид (4 мл), упаривание с пиридином повторяют дважды и добавляют дициклогексилкарбодиимид (2,0 г, 10 ммоль), Смесь встряхивают в темноте при комнатной температуре в течение 20 ч. Осадок отфильтровывают, Фильтрат концентрируют до объе" ма 5 мл, обрабатывают водой (10 мл) и эфиром (5 мл). Эфирный слой отделяют, экстракцию повторяют дважды.

Водный слой фильтруют и продукт выделяют ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте 0-0,1 И бикарбоната аммония.

После концентрирования и удале" ния бикарбоната аммония продукт осаждают из метанола в эфир, сушат в вакууме. Выход аммонийной соли

0,43 г (813) .

Вещество гемогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе метанол-хлороформ-1 И аце.тат аммония (10:10:1Ч/Ч), Уф-максимум в воде при 267 .нм (K.9600).

ИК-спектр содержит полосу поглощения нитрильной группы при 22002300 см-". Реакция (1) с тимидин-3-фосфотиоатом протекает íà 1003 в

5 диметилформамиде при 25ОС. Отношение констант скоростей К /Кт в реакций первого порядка (I,Ê ) и 5 -то) зилт имидин-3 -S-2-цианэтилтиофосфаО В

ОН

3 910650 увеличению времени синтеза, образованию побочных продуктов и к низкому выходу олигонуклеотидов.

Известный способ получения 5 -O-ToS-производных, содержащих 3 -S-2-цианэтилтиофосфатную группу, за" ключается в конденсации 5 -О-ToS-дезоксинуклеозидов с S-2-цианэтилтиофосфатом в пиридине в присутствии триизопропилбензосульфонилхлорида (2) . 1в

Известен также способ конденсации 51 -ацильных производных дезокСи" нуклеозидов с S-2-карбомоилэтилтиофосфатом в смеси гексаметилтрифосфамид-пиридин (1:1) в присутствии дициклогексилкарбодиимида (3."1 °

Способ f 3j наиболее пригоден для синтеза соединений с высокореакционноспособными 5 -электрофильными группами, так как содержание в реакционной среде пиридина (504), реагирующего с такими группами, по такому способу меньше, чем по способу 523

Для конденсации используют двукратный избыток Ь-2-карбомоилэтилтиофосфата и четырехкратнь1й избытоК дициклоге1 силКарбодиимида. Реакцищ проводят в течение 4 су ок при встряхивании, так как пиридиниевая соль S"2-карбомоилэтилтиофосфата плохо растворима в пиридине.

Недостатками этого способа является сравнительно высокое содержание пиридина в реакционной среде, что не позволяет получать высокоактивные 5-йодпроизводные с высоким выходом и необходимость использования для ускорения реакции большого избытка S-2-карбомоилэтилтиофосфата.

Целью изобретения является получение высокореакционноспособных производных дезокситионуклеотидов, которые могут быть использованы в качестве мономеров для ступенчатого синтеза политионуклеотидов. 45

Предлагаются производные дезокситионуклеотидов формулы I.как мономе-. ры для синтеза политиодезоксинуклеотидов.

Предлагается также способ получения соединений формулы I„ который заключается B том, что 2 5 -дидезокси1

-5 -йоднуклеозиды общей формулы

5 910 та (K 0 ) с тимидин-3 -фосфотиоатом равняется 100. Гидролиз цианэтильной защиты в 0,5 н. Е1ОН при 20 С протекает наполовину за 4 мин.

Пример 2. 5 -йод-N4-анизо- 5 илдезоксицитидин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоат.

Конденсация 5 -йод-114-анизоилдезоксицитидина (0,47 r, 1 ммоль) с пиридиниевой солвю S-2-цианэтилтиофосфата (4 ммоль) в условиях, приведенных в примере 1, дает 0,48 г (77ь) аммонийной соли.

Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в указанной выше системе. Уф-максимум в воде 302 нм (Е 25000). ИК-спектр содержит полосу поглощения нитрильной группы 2200-2300 см " . Отношение

К /Кт0 для (2) равно 100, гидролиз 20 цианэтильной защиты в 0,5 н. 1.1ОН при 20 С протекает наполовину за мин.

П р и м, е р 3. 5 -йод-N -бензоилдезоксиаденозин-3 †.5-2-цианэтилфосфо- >5 тиоат.

Конденсация 5 -йод-й -бензоилдез1 Ь оксиаденозина (0,46 г, 1 ммоль) с

5-2-цианэтилтиофосфатом (4 ммоль) в условиях, приведенных в примере 1, зо дает 0,45 г (724) аммонийной соли.

Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе, указанной выше. УФ-максимум в воде 280 нм (Е 20700). В ИК-спект- 35 ре присутствует полоса нитрильной группы при 2200-2300 см " . К /Кт„,, для (3) равно 10, гидролиз цианэтильной защиты протекает наполовину за

4 мин в 0,5 н, LiQH при.20оС.

П р и q е р . 4. 5-йод-N -изобу1 тирилдезоксигуанозин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоат.

Конденсация 5 -йод-й -изобутирилдезоксигуанозина (0,45 г, 1 ммоль)

45 с S"2-цианэтилтиофосфатом (4 ммоль) в условиях примера 1 дает 0,45 г(733) аммонийной соли.

Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в ука-50 занной выше системе. Уф-максимум в воде 280 нм (6 11900) плечо 255260 нм (Е 16200). ИК-спектр содержит полосу нитрильной группы при 22002300 см ". К /Кт для (4) равно 10, полупериод гидролиза цианэтильной защиты в 0 5 í. LiOH при 20 С равен

4 мин.

650 6

Пример 5. Натриевая соль 5 "йод™мидии 3-S 2-цианэтилфосфотиоата.

Раствор аммонийной соли 5 -йодтимидин-3-S-2-цианэтилфосфотиоата (0,53 r, 1 ммоль) в 1 мл воды наносят на колонку (4х1 см) с катионообменной смолой Дауэкс-50 в натриевой форме. Вещество элюируют водой, элюат упаривают на ротационном испарителе, осадок сущат в вакууму. Затем растворяют в метаноле (1 мл) и выливают в 50 мл сухого эфира. Осадок отфильтровывают, сушат в вакууме. Выход натриевой соли.0,51 г (953).

Использование полученных производных дезокситионуклеотидов для ступенчатого синтеза политионуклеотидов показало их высокую эффективность в такого рода реакциях. Это позволило сократить время, затрачиваемое на одну стадию синтеза, до нескольких часов при выходе олигонуклеотида 951003 и существенно упростить проце" дуру его выделения и очистки.

Предлагаемый способ синтеза таких производных позволяет получить их с выходом 73-81Ф и с более легкоснимаемой цианэтильной защитой.

Пример 6. 2 -Дезокси(й -изобутирилгуанилил(3 5 )-5 -дезокси-5 тиотимидин|-3 -S-2-цианэтилфосфотиоат, Ф-Изобутирилдезоксигуанозин-3 -фосфотиоат, дилитиевую соль, дигидрат (0,048 г, 0,1 ммоль) и 5 -йодтимидин-3 -S"2-цианэтилфосфотиоат, литиевую соль (0,055 г, 0,105 ммоль) смешивают в 1 мл диметилформамида и смесь выдерживают 1 ч. Конец реакции определяют по исчезновению тиофосфатных групп методом йодометрического титрования и хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте хлористого натрия. после щелочного гидролиза цианэтильной защиты. По окончании реакции к реакционной смеI си добавляют ацетон (5 мл), осадо центрифугируют, промывают ацетоном (3 4 мл), сушат в вакууме. Выход целевого продукта в виде дилитиевой соли 0,081 г, 95 .

Вещество может быть дополнительно очищено гель-хроматографией на сефадексе G-25 в 0,25 И бикарбонате аммония в 20/-ном этаноле. УФ-максимум (a воде) 258 нм (E. 20800), Кя при гель-хроматографии -0,47. Полупериод гидролиза цианэтильной защиты в о

0,5 M гидроокиси лития при 20 С

7 910650 8

4 мин. При этом образуется М -изо- .что 2 5 -дидезокси-5 -иоднуклеозиды бутирил-2 -дезоксигуанилил-(3 5 )- общей формулы

-2,5 -дидезокси-5 -,тиотимидин-3 фосфотиоат с содержанием концевых _#_H, в тиофосфатных групп близким к 1:1.

Аналогичным образом могут быть использованы для синтеза олиготиодезоксинуклеотидов и другие предлагае,мые соединения.

ОН

Формула изобретения

Составитель Г. Коннова

Редактор 3. Бородкина Техред Л.. Пекарь Корректор В. Бутяга

Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1021/26

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Производные дезокситионуклеотидов общей формулы 15

О... Я 28.4 " . р

О О где В " остаток тимина, Й4 -аниз6илцитозина,,й -бензоиладенина, М -изобутирилгуанина;

К - ион NH+, йа, Li+, как мономеры для синтеза политиодез" оксинуклеотидов.

2. Способ получения соединений .по отличающийся тем, 1 где В имеет приведенные значения, конденсируют с 2-5-кратным избытком

S-2-карбомоилэтилтиофосфата в смеси гексаметилтрифосфамида (80-903) и пиридина (10-204) при помощи 615-кратного избытка дициклогексилкарбодиимида.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, S, Chladek, А. Nagyvary. Nucl eophi l! ñ Reac t ion of Some Nuc leos i de

Phosphorothioates -ck. Am. Chem. Soc., 94, 2079, 1972.

2. JL. Kresse, К.L. Nagpa 1, ф. Мадучагу. The use of S-2-cyanocthyt

phosphorothioate in the preparation

of S"-deoxy-S -thiothythycuidylates"

"Nucleic Acid. Res, 2y 1, 1975.

3. А.F. Cook, Nucleoside 5-alkyl

Phosphorothioates - Д,. Am. Chem.

Soc., 92, 190, 1970.