Способ определения активности малатдегидрогеназы в биологических тканях

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61} Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено20. 12.79 (21) 2873074/28-13 (31) М. Кд.з с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

6 01 N 33/48

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий ($3) УДК 557. 15.

082 (088 8) Опубликовано 2 3. 0 5 . 82Бюл лете нь ¹ 19

Дата опубликования описания 23.05. 82 (72) Авторы изобретения

В.А.Пахомова, Г.Н. Крюкова и Н. П. Козля ина j

Одесский научно-исследовательский ин титут стоматологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

Изобретение относится к медицине, а .именно к способам изучения энерге. тического обмена в тканях животных и человека.

Известен способ определения малатдегидрогеназы в биологических тканях, включающий инкубацию гомогената ис-. следуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси (lj.

Однако известный способ имеет недостаточную чувствительность и неспецифичен, вследствие того, что запуск реакции коферментом приводит к активации многих других НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения малатдегидрогеназы в биологических тканях, включающего инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и спектрофотометрию полученной смеси, кофермент вносят непосредственно в раствор гомогената, выдерживают в течение

5-60 мин в физиологическом режиме, далее добавляют субстрат.

Способ осуществляется следующим образом.

После забора ткани хранят и гомогенизируют на холоду в 0,05М трисбуфере в соотношении 1:20. Инкубационная смесь состоит, мл: 0,05М

10 трис-буфер рн=7,4 2,5; МпСс 0,03м 0,1;

НАДФ 0,1 (3 мг в мл), гомогенат

0,2.

Общий объем 3 мл.

Предварительную инкубацию проб (после встряхивания) проводят в течение 5-60 мин при 37 С. Реакцию запускают добавление О,ЗЗМ субстрата 0,25 натрия яблочнокислого. Активность определяют по разности эк20 стинкции на первой-тридцатой-шестидесятой минуте и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч.

Пример 1 ° Печень гомогенизируют на холоду в 0,05М трис-буфере в соотношении 1: 20. Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 5 мин в инкубационной смеси следующего состава, мл: 0,05M трис-буфер рн=

7,4-2,5; О,ОЗМ МпС8 О, 1; НАДФН (3 мг в мл) О, 1; гомогенат О, 2. l

930122!

Составитель Ю. Алмазов

Редактор T.Êèñåëåâà Техред И. Рейвес Корректор О. Билак

Заказ 3456/55 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, москва, E-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4

Обший-объем пробы — 3 мл.

Реакцию запускают добавлением

0,33 мп субстрата натрия яблочного0,25 мл. Активность определяют по разности экстинкций на 0-30-60 мин и выражают в наномолях на 1 г ткани за 1 ч. Подсчет активности фер« мента, проводился по следующей фор"

АЕ 3 ,муле: A=, гце а Е - разность экстенкций, 3 - объем кюветы, ккоэффициент молярной экстинции НАДФН, п ». разведение ткани.

Пример 2. Деснаи слюнные

1 железы (окопоушная и прдчелюстная) гомогениэируют на холоду в 0,05M t5 трис-буфере в соотношении 1:20 ° 3a- тем проводят преинкубацию при 37оС

s течение 30 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное аналогично прив4еру 1. Активность ма- gp лой дегидрогеназы s этих тканях50 и 25-45 нмоль/г/ч.

Пример 3. Выделенные альвеолярный отросток и ребро гомогенизируют на холоду в 0,05M трисбуфере в соотношении 1:20. Затем проводят преиикубацию при 37оС в течение 60 мин в инкубационной смеси. Состав смеси и остальное аналогично примеру 1. Активность майатдегидрогеназы» 5,5 и 55 нмоль/г/ч.

Предлагаемяй способ обладает высокой чувствительностью, и специфичностью, что позволяет применять его для определения активности малатдегидрогеназы во всех тканях.

Формула изобретения

Способ определения малатдегидро-. геназы в биологических тканях, включающий инкубацию гомогената исследуемой ткани в буферном растворе с субстратом, внесение в инкубационную смесь кофермента и. спектрофотометрию полученной смеси, о т л ич а ю ш и и с я тем, что, с целью повиаения чувствительности и специфичности способа, кофермент вносят непосредственно в раствор гомогената, выдерживают в течение 5-60 мин в физиоЛогическом режиме, далее добавляют субстрат.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Степанова Н.Г. НАДФ-ферменты в нормальной сердечной мышце и при экспериментальном миокардите.

Вопросы мед.хим., 1969. 9 15, с. 346-351.