Способ получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих

 

Союз Советсиин

Социалистичесиик

Республик

К ASVOPCXOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву

{22)Заявлено 25.07.80(21) 2961075/28-13 с присоединением заявки М (23) П риоритет

Опубликовано 23-05. 82. бюллетень М 19 (St)N. Кл. (; O1 К 33/48 Ъвударствекы6 каинтат

СССР аа делам наееретений н аткрытнй (5З) ДК616" 07 (088. 8) Дата опубликования описания 25.05.82

» У ; ф. Н. Гильмиярова, Н. Н. Постник а и :Я;. - -йУ @4Ьх вна

9 Ф

1., t. ъ с,.

Куйбышевский медицинский инстит т им."ф. :И ;% ъА (72) Авторы изобретения (7I ) Заявитель (541 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЦЕРАЛЬДЕФИДфОСфАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

ИЗ СКЕЛЕТНОЙ ИЬИИЦЫ ИЛЕКОПИТА10ЩИХ

Изобретение относится к медицийе ,и может быть использовано для полу-. чения глицеральдегидфосфатдепидроге-. назы из скелетной мышцы млекопитающих.

Известен способ получения глицеб ральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих путем ее гомогенизации с последующей экстракцией белков раствором фосфатнокисло10 го калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделения балластных белков (1 .

Однако известный способ не позволяет получить фермент в высокоочищенном виде.

Цель изобретения - повышение чист тоты фермента и выделение его в крис" таллическом виде.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы мпекопиющих путем ее гомогенизации с последующей

2 экстракцией белков раствором фосфорнокислого калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделения балластных белков, насыщение экстракта доводят до

0,68 и выдерживают его при комнатной температре до получения кристаллов фермента.

Способ осуществляется следующим образом.

Иышечную ткань при посмертной биопсии рсвобождают от жировой, сое" динительной ткани, гомогенизируют, взвешивают, добавляют 0,03 Н раствор

К2НРб, .в соотношении 1:2, экстрагируат на холод в течение 60 мин при периодическом перемешивании, затем отжимают, плотный остаток мышщ отбрасывают.

К экстракту добавляют мелкодис персный порошок сульфата аммония из расчета 39,6 r на 100 мл экстракта.

Сульфат .аммония добавляют небольшими порциями при тщательном перемеши-, 930124

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Гулый. M. Ф., Дворникова П. Д..

Коламийченко М. А. и Попадюк Е. Я.

Метод фракционирования и кристаллизациии мышечных белков.-"Вопросы биохимии мышц", Киев, 1954, с. 244-276.

Филиал fltlll "Патент", r.

3 ,вании. Оставляют на 15 мин, затем фильтруют. Осадок отбрасывают.

Фильтрат насыщают от 0,55 до 0,68 путем добавления сульфата аммония из расчета 9,36 г на 100 мл фильтрата.

Образовавшийся осадок отбрасывают фильтрованием при комнатной температуре.

Ь

Кристаллизация начинается через

12 ч, в фильтрате образуются единич- 10 ные кристаллы глицеральдегидфрсфатдет. гидрогеназы в виде длинных тонких палочек, располагающихся отдельно.

При дальнейшей кристаллизации палочки собираются с образованием "снопов".

Кристаллизация заканчивается на 23 сут.

Перекристаллизацию проводят через 3-4 сут, позже возможно появление кристаллов миоглобина. Кристаллы отделяют путем центрифугирования при

12000-15000 об/мин в рефрижераторной центрифуге в течение 15 мин. Осадок растворяют в минимальном количестве охлажденной бидистилированной воды (2-3 мл}. Раствор фильтруют (через ватный фильтр), затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония с рН 5,7-5,8. Кристаллизуют при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Кристаллы хранят при

0-4о

Пример. Протокол выделения глицерал ьдегидфосфатдегидрогеназы (К.Ф.1.2.12) из скелетной мышцы чеИсследуемый К. 1958 года рождения.

Время смерти:17декабря 1979 r,22 ч.

Время взятия мышечной ткани: 18 де кабря 1979 г, 12,00 ч.

Причина смерти: смерть наступила щ ,от оскольчатого перелома костей свода и основания черепа °

1-й этап.

Получают 193 г мышечного гомогената, добавляют 386 мл 0,03 И раствора 4 из расчета К НРО+ 1:2). Экстрагируют 60 мин.

Отжимают 240 мл экстакта, добавляют 95,04 r и фильтруют через складча-,, тый фильтр на ночь.

К 215 мл фильтрата добавляют

20,124 г сульфата аммония осадок вновь отделяют фильтрованием. Фильтрат оставляют при комнатной температуре для кристаллизации фермента.

ВНИИПИ Заказ 3457/56

Кристаллизация началась через 3 ч.

Кристаллы в виде длинных, тонких палочек, располагаются беспорядочно, но встречаются пучки - скопления. Закончилась кристаллизация через 3 сут.

2-й этап.,Спустя 2 сут, первичные кристаллы отделяют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Осадок растворяют в небольшом количестве охлажденной бидистиллированной воды, затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония.. Оставляют при комнатной температуре. Кристаллизация закончилась через 3 сут.

Активность глицеральдегифосфатдегидрогеназы определялась спектрофотометрически в реакционной среде следующего состава: трис-солянокислый буфер 4,4 10 И рН 8,62; смесь фосфотриоз, получаемая нами ферментативным путем по методу О. Иейергофа (1938)

1,0 М НАД 1,2 10 " И; арсенал натрия

5 10 .М.

Пересчет ведут на белок, количест-. во которого определяют биуретовым методом и спектрофотометрически.

Практическая ценность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет выделить фермент не только в высокоочищенном, но и в кристаллическом виде с сохраненной функциональной активностью.

Формула изобретения

Способ получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих путем ее гомогенизации с последующей экстракцией белков раствором фосфорнокислого калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделе ния балластных белков, о т л ич а ю шийся.тем, что., с целью повышения чистоты фермента и выделения его в кристаллическом виде, насыщение экстркта доводят до 0,68 и выдерживают его при комнатной темпе ратуре до получения кристаллов фермента.

Тираж 883 Подписное

Ужгород, ул. Проектная, 4