Способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале

 

(72) Авторы изобретения

Г.А.Анненков и Е.Е.Сафронова

Институт медицинской генетики Академии медицинских . наук СССР (7I ) Заявитель (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЛ АК ИВНОС И

ФЕНИЛАЛАНИНГИДРОКСИЛАЗЫ

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к медицине и может найти применение s клинической биохимии для диагностики фенил- -.. кетонуриии и для выявления гетерозиготных носителей гена фенилкетонурии.

Известен способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биоптате печени. Способ заключается в том, что биоптат гомогенизируют в растворе, содержащем 0,01 И трис1О гидрохлорида, 0,15 И. хлористого калия, 0,01 И бета-меркаптоэтанола, рН 7,4; гомогенат центрифугируют, полученный супернатант смешивают с

0,17 щМ раствором птеридинового ко"

1$ фактора и 1 mW раствором фенилаланина (соотношение белок : кофактор субстрат 1-6:0,1:0,661, инкубируют смесь при 25 С в течение 15 мин, затем спектрофотометрически определяют количество окисленного птеридинового кофактора. Количество последнего эквивалентно содержанию новообразо2 ( ванного тирозина и, следовательно, активности фенилаланингидроксилазы (11.

Недостатком известного способа является его низкая чувствительность и поэтому он применяется только для определения активности фенилаланингидроксилазы в тканях с высокой активностью этого фермента.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа, Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале путем его гомогенизации в растворе, содержащем трис-гидрохлорид, хлористый калий, бета-меркаптоэтанол, центрифугирования, инкубации супернатанта с раствором птеридинового кофактора и фенилаланина и последующей спектрофотометрии, отличительной особенностью является то, что гомогенизацию проводят в приотсчитывают соответствующие величины экстинкции Е„ и Е (размерность в оптических единицах указана на сетке на бумаге), Тогда в данном примере — 0,45 мЕ/мг или 0,45 нИ тирозина эа минуту на

1 мг белка гомогената, П р и и е р 2, Гомогенат печени мыши. Скорость движения бумаги

6 см/мин, поэтому на оси абсцисс отсчитывают по 6 см (отрезки Ь„ и Ь } (Онцентрация белка в гомогенате30,0 мг/мл. Производят расчет Е и

Е, и вычисляют А

Ч,5,,5 3

= 2,16 мЕ/мг или 2,16 нИ/мин мг белка.

Способ по изобретению позволяет повысить чувствительность определения до 0,01 НИ тирозина/мин мг белка, что позволяет определять активность фенилаланингидроксилазы в лейкоцитах человека, составляющую в среднем 1 нИ тирозина/мин мг белка, тогда как с помощью известного способа активность вообще не определяется, Таким образом, на этом биологическом объекте способ оказывается чувствительнее известного способа не менее чем в 100 раз, Предлагаемый способ может быть использован для определения фенилаланингидроксилаэы в биологических материалах с низким содержанием этого фермента.

3 g 32400 сутствии детергента тритон-X-100, инкубирование осуществляют при соотношении белок : кофактор ". субстрат как 1-6:0,8:3,3 и спектрофотсметрируют на этапе постоянной скорости Ферментативной реакции.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. В одну из кювет автоматического анализатора скорос" 16 тей ферментативных реакций LKB-8600 помещают 50 мкл гомогената лейкоциТоВ, содержащего 15,,2 мг/мл белка (егО кОнцентрацию Определяют прямОИ спектрофотометрией экстинкции водо- 15 родными связями белка при 210 нм}, 1 мл 0,1 И раствора трис-гидрохло- . рида, рН 7„4, содержащего 5 mM Фенйлаланина. В контрольную кювету вносят

1 мл 0,1 М раствора трис-гидрохлори- ц да. После помещения кювет в прибор с помощью автоматического дозатора в них добавляется по 50 мкл 0,85 И раствора кофактора (6,7-диметил-2-амино-4-гидрокси-5,6,,8-тетрагидро- 25 птеридин} и измеряют оптическую плотность анализируемой пробы .сравнительно с холостой пробой (без субстрата) в течение первых двух минут реакции при скорости протяжки бума- зЕ ги в регистрирующем устройстве

6 см/мин. Затем проводят расчет с помощью полученной кинетической кривой, где используется ее прямолинейный участок, характеризующий постоян- 3> ную скорость изучаемой реакции. Рассчитывают величину оптической плотнОсти эа единицу времени и прОизводят расчет величины удельнОЙ активнОсти фермента по формуле 46 ЬЕ. V

Л где hE - величина прироста экстинкции эа 1 мин, 7 - общий объем реакционной смеси — 1,1 мл, ъ - обьем добавленного гомогената - 0,05 мл;

F " молярный коэффициент экстинкции для окисленной формы птеридинового кофактора - 6,45;

С - концентрация белка в гомогенате в мг/мл.

По оси абсцисс выбирают интервалы Ь и Ь2, соответствующие 1-й мин (т.е. длиной в 3 см}, по оси ординат

Формула изобретения

Способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале путем его гомогениза,ции в растворе, содержащем трис гидрохлорид, хлористый калий, бетамеркаптоэтанол, центрифугирования, инкубации супернатанта с растворами птеридинового кофактора и фенилала,нина и последующей спектрофотометрии отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, гомогенизацию проводят в присутствии детергента тритона

Я-100, инкубирование осуществляют при соотношении белок : кофактор субстрат как 1-6:0,8:3,3 и спект5 932400 роФотометрируют на этапе постоянной -: скорости Ферментативной реакции.

Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе б

l. Ayling J., Pirsan R., et all.

A specific kinetik assay for pheпу1а1айзпе 1iydroxylase. - "Analyt.

Biochem", 1973, ч. 51, р. 80-90.

3awaa 3774/64 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, N-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель P.Kàòîñîâà

Редактор В.Пилипенко Техред Т.Маточка Корректор О.Билак