Способ количественного определения саркоплазматического ретикулума в мышечной ткани

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИЯЕТЮЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистическик рес убл (t t) 934375 (Sl ) Дополнительное к авт. свиа-ву— (22) Заявлено 21 . 04. 80 (21) 29124 14/30-15 с присоединением заявки М— (23) Приоритет—

Опубликовано 07.06.82; Бюллетень М 21

Дата опубликования описания 07 (5l)NL. Кл.

Гбвудэрстккннык квннтвт

CCCP вв делан мэю4ретеннй и открытий

G 01 N 33/48 (53) УДК612. 014 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Д.О.Левицкий, Д.С.Беневоленский и Т.С.Левченко

Всесоюзный кардиологический научный цейтр АМН:60(, P:I (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ

Изобретение относится к биохимии.

Существующие электронно-микроскопические методы позволяют оценить только объем, занимаемый саркоплазматический ретикулум (СР), но не дают информации о количественном содержании функционирующих мембран (1).

Наиболее близким к предлагаемому является биохимический метод, примененный Soloro, Bricks. Ткань левого желудочка сердца собаки гомогенизировали в течение 40 с при скорости порядка 15000 об/мин в 4 объемах 0,3 М сахарозы и 10 мМ имидазола (рН 7,0). Из части гомогената выделяли микросомы путем дифференциального центрифугирования с последующей отмывкой полученного препарата от актомиозина в 0,6 M КС1 и определяли способность выделенных микросом и гомогената к АТФ зависимому поглощению кальция в присутствии оксалата(2).

Согласно полученным результатам ! сердце собаки содержит в среднем

6,8 х Р мг СР в 1 г ткани, где P фактор очистки (меньше единицы), который остался неизвестным, так как

5 исследователи не могли установить степень чистоты полученного ими препарата CP. Таким образом, в данной работе не было определено действитель3D ное содержание CP.

Цель изобретения - повышение точности определения.

Указанная цель достигается тем, что получают суммарную фракцию дроб15 ным выделением, а изолированную фракцию очищают путем осаждения в градиенте плотности сахарозы, причем перед ее очисткой в последнюю добавляют оксалат кальция, а в качестве специфического маркера использую фосфорилированный интермедиат Са зависимой аденозинтрифосфатазы .

Суммарную фракцию получают путем проведения 12- 15 циклов дробного вы.

93"375 деления, каждый из которых включает гомо ге низацию и дифференциал ь ное цент рифугирование.

Оксалат кальция в изолированную фракцию добавляют в количестве

5-154, от количества, необходимого до насыщения им изолированной фракции.

Пример. А. Полное извлечение

СР из мышцы, Образец мышцы, например, сердце, промывают физиологическим раствором„ освобождают от жира и крупных сосудов и после взвешивания и разделения ткани на 2 равныЪ навески, одну из них измельчают в гомогенизаторе при скорости 3000 7000 об/мин в течение 3-5 с в среде выделения, предложенной Harigaya, Schwartz и содержа цей 10 мИ NaHCO> (рН-7,0) . На всех этапах выделения поддерживают температуру 0-4. Гомогенат центрифугуют

"о

20 мин при 8000 хд.

Осадок суспендируют в новой порции среды выделения и вновь подвергают гомогенизации в прежнем режиме и центрифугированию. Из супернатанта, разбавленного в два раза 1,2 И раствором КС1 осаждают CP - содержащую фракцию при 105.000 хд в тече.ние 40 мин. Всего проводят 12-15 таких циклов. Полученные осадки микросом представляют собой суммарную фракцию, которая помимо CP содержит примеси других мембранных элементов клетки. Суммарную фракцию суспендируют в небольшом объеме 0,05 И КС1

20 мМ трис-малеатного буфера (рН 6,8) .

Б. Выделение изолированной фракц CP.

Для выделения изолированной фракции CP применяют частичное насыщение везикул CP оксалатом кальция в среде, содержащей АТФ, с последующим отделением активных утяжеленных оксалатом кальция везикул центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, что позволяет полностью . исключить примеси других мембранных элементов клетки.

Вторую нввеску гомогенизируют три раза по 5 с с 20 секундными интервалами при скорости 30007000 об/мин.фракцию микросом выделяют, как описано выше, в результате одного цикла гомогенизации и дифференциального центрифугирования. Определяют максимальную кальций-оксалатную емкость препарата микросом с помощью рН-метрии в среде, содержащей 20 мИ АТФ, 30 мИ MgC12, 10 мИ

NaNO, 0,16 М КС1, 25 мМ оксалата калия, 60 мИ трис-НС1 (pH 6,65).

Затем добавляют порциями по 10-20 мкл

1 М раствор СаС1д, непрерывно регистрируя изменение рН, пока не наступает 5- 153-ное насыщение пузырьков CP оксалатом кальция, для

10 чего предварительно определяют изменение рН при 1004 насыщении везикул оксалатом кальция. Реакцию о проводят при 20 С. Суспензию микросом, частично насыщенных оксалатом калью сия, быстро охлаждают до 0-2 С, до бавляют раствор 3 M КС 1 до конечной концентрации 0,6 И и 13 мл суспензии наслаивают на линейный градиент сахарозы (0,72-1,75 M), cogp держащей 0,6 M KCl, 4 мМ АТФ, 6 мИ ИАЭС!, 6, 5 мИ оксалата калия, 5 мИ NaNO, 1О мИ имидазола рН 6,65 .

Центрифугирование проводят в бакетроторе при 73000 хд в течение 2-3 ч.

Полученный осадок содержит очищенные активные везикулы CP.

В. Внесение маркера 32 р в образцы суммарной и изолированной фракции. Ф, t

Фосфорилирование Са, Mg зависимой АТфазы осуществляют при О С в

0,5 мл среды, содержащей 0,1 И КС1, 10 MM СаС1, 20 мкКм (1-32р-АТФ, 20 мИ тряс-НС1, рН 7,1) .

Реакцию инициируют добавлением

0,1-0,2 мл белка микросом. Через

15 с реакцию останавливают равным объемом раствора, содержащего 203 трихлоруксусной кислоты, 1 мИ АТФ, 4О

2 MM H PO4 . О 5 мл аликвоты суспензии денатурированного белка фильтруют под вакуумом. Фильтр промывают

6 раз 3 мл 64-ной трихлоруксусной кислоты..В контрольные пробы -32р-АТФ вносят после остановки

45 реакции раствором,,содержащим трихлоруксусную кислоту. Включение радиоактивной метки измеряют в сцинтилляционном спектрометре.

Концентрацию белка определяют по

Lowryetal (J.Biol. Chem. 193, 265, 1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

В таблице приведены результаты определения содержания CP в сердце морской свинки.

Иэ приведенных в таблице результатов следует, что все активные везифракция CP Содержание АТФ-зависимое свябелка, мг/г зывание Са, .нмоль ткани СА/г/с

Количество фосфобелка, нмоль Pi/ã ткани

О 35

8,7

0,69

4,2

О 31

0,39

0,84

0,69

13 1

0,6

8,4

0,69

9,7

0,57

0,75

0,6

6,3

О 5

0,46

0,78

5,2

1,06

o,66

6,4

0,28

3,8

0,79

0у 39

0,81

3,7

0,76

0,21

2,3

0,19

0,69

0,6

0,13

0,51 °

0,6

0,11

0,9

0,5

0,5

75,6

5,79

10, 12

Всего лума в мышечной ткани, включающий определение соотношения количества специфического маркера в суммарной фракции и изолированной фракции, Формула изобретения

1. Способ количественного определения саркоплазматического ретику5 934375 6 кулы CP были экстрагированы из мышцы, плотности сахарозы получен осадок очитак как выход CP в последних цик- щенных везикул CP 10 мг белка). Фрак" лах выделения незначителен.,ция чистого СР способна включать

Количество фосфорилированного бел- 2,5 нмоль неорганического фосфата кового интермедиата в суммарной s на 1 мг белка. фракции микросом составляет 5,8 нмоль

Pi/r сырого веса ткани. Отношение суммарного количества

При выделении изолированной фрак- фосфобелка, содержащегося в СР, лолции микросом максимальная кальций-ок- ностью извлеченном из 1 г сердечной салатная емкость составляет 1О мышцы (5, 8) к количеству фосфата, 3, 6 мкмоль Са +мг белка. После насы- включенного в 1 мг (по белкуj чистой щения везикул CP оксалатом каль-,фракции СР (2,5) дает содержание СР ция до 154 от максимальной величи- в 1 г сырого;веса мышцы сердца:ны и центрифугирования в градиенте 2,3 мг/г.

Составитель Т.Чечеватова

Техред А. Ач Корректор О.Билак

Редактор В,Пилипенко!

Заказ 3927/40 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 934375 8 выделенной путем гомогенизации и диф- получают путем проведения 12-15 цикференциального центрифугирования, о т. лов дробного выделения, каждый из л и ч а ю шийся тем, что, с це- которых включает гомогениэацию и лью повышения. точности определения, дифференциальное центрифугирование. получают суммарную фракцию дробным . 3. Способ по п.1, о т л и ч а ювыделением, а изолированную фракцию щ и и с R тем, что хлористый кальочищают путем осаждения в градиенте ций в изолированную фракцию добавляплотности сахарозы, причем перед ют в количестве 5- l5i от количества, ее очисткой в последнюю добавляют необходимого до насыщения им везикул хлористый кальций в присутствии АТФ lo саркоплазматического ретикулума. и оксалата, а в качестве специфи- И сточни ки информации, ческого маркера используют фосфори- принятые во внимание при экспертизе лированный интермедиат Са - эави" 1. American Journal Cardiology симой аденозинтрифосфатаэы. 1973, 31, р.172- 181.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю- >s 2.. Circulation Research, 1974, шийся тем, что суммарную фракцию 34, р. 531-550.