Способ выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов

 

Союз Советских

Социалистических республик к лвтовскомь свидивльствю (61) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 04 07 80 (21) 2952230/23-04 с нрисоединением заявки М(28) Приоритет (51)M. Кл.

С 07 F 9/10

ВкударотоснныИ «онитот

СССР оо долаи изобретений и открытий

Опубликовано 15.08 82 Бюллетень М30

Дата опубликования описания 15.08.82 (5З) а ДК 547.26> 118.07 (088.8) Э. Я. Костецкий и Н. И. Герасименко (72) Авторы изобретения

Дальневосточный государственный университет (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОИНОЗИТИДА ИЗ COEBblX

ФОСФАТИДОВ

Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к способу выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, который находит широкое применение в изучении структуры и функции мембран, его роли в нервной ткани, в медицине и фар- макологии.

Известен способ получения фосфоинозитида, заключающийся в экстракции говяжьего мозга последовательно ацетоном,. метанолом, петролеиным эфиром, с многократным переосажде10 вием в эфире-ацетоне для получении кефалиновой фракции, которую смешивают с дистиллированной водой и подвергают диализу 4сут, далее из нее получают фосфоинозитидную

15 фракцию хлороформ-метанольным методом с последующим многократным переосаждением фракции из хлороформ-метанольной смеси, диализом, лиофилизацией, переводом в Na-соль зтилендиаминотетрауксусной кислотой и пропусканием- через колонку с Chehx — 100

+ (Na-форма) и последуюшим получением фосфоинозитида на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой и дополнительной доочисткой его от фосфатидилсерина. Из 850 г мозга получают 217 мг смеси фосфоинознтида с фосфатидилсерином, что составляет около 0,03% от исходного субстрата (Ц.

Однако способ требует длительной (около

7 — 9 рабочих дней) и сложной (многократное переосаждение, диалю, лиофилизация, очистка на ионообменной: смоле переведенной в

Na-форму фракции) процедуры получения фосфоинозитидной фракции и дополнительной процедуры для отделения фосфоинозитида от фосфатидилсерина.

Известен способ выделения фракций фосфоинозитидов ю ткани головного мозга, заключающийся в получении липидного экстракта петролейным эфиром ю мозга, обезвоженного ацетоном, хлороформ-метанолом (1:9), этанолом, растворении липидов в хлороформ-метанольной системе с добавкой соляной кислоты, перемешиванни, центрифутировании и получении фракции кислых фосфолипндов, освобождением липидного экстракта от ионов двухвалентных металлов и фосфолипидов, имеющих основные группы, на Дауэкс — 50 (H.форма), с последуюз 950730 щим делением фракции на ДЕАЕ-целлюлозе для удаления полифосфоинозитидов и получении фракции, содержащей монофосфоинозитид, с последующим переводом ее в Na+ форму на колонке с Дауэкс — 50 (Н-форма) и дальнейшим разделением на А Оз для получения монофосфоиноэитида в Na-форме. Монофосфон нозитид дочищают от возможных примесей петролейным эфиром или изопропиJIoBbIM cIIHpToM. Из 1 KI TKRHH головного мозга получают 1 г фосфоинозитида, т.е. около 0,1% от исходного субстрата (21.

Недостатками этого способа являются его трудоемкость и многостадийность при получении фосфоинозитидной фракции для последующего хроматографического разделения— экстракция ацетоном, хлороформ-метанолом, этанолом, петролейным эфиром, получение фракции кислых фосфолипидов на Дауэкс — 50, частичная очистка их на ДЕАЕ-целлюлозной колонке, перевод в Na-форму на колонКе

30 с Дауэкс — 50 и дополнительная доочистка продукта от возможных примесей. Выход конечного продукта относительно невысок.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому

25 является способ выделения фосфонозитида из соевых фосфатидов путем последовательной экстракции фосфолипидов хлороформом и метанолом с последующей хроматографической очисткой на силикагеле. Из 5 г фосфолипидов З0 этим способом получают 200 мг целевого продукта (3).

Недостатком этого способа является невысокий выход целевого продукта.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, соевые фосфатццы подвергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, отмывают экстракт водой, смешивают его с окисью алюминия в весовом соотношении 1:8 и подвергают очистке на колонке с сухим смешанным сорбентом — смесью силикагеля с диэтиламино- 4s этилцеллюлозой, взятых в весовом соотношении

1:1.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта до 80% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фос- о фатидах или 2,6% от исходного количества субстрата.

Пример 1. Получение фосфоинозитида из коммерческих соевых фосфатидов.

Получение экстракта.

50 r коммерческих соевых фосфатидов отмывают от нейтральных липидов ацетоном

5 раз (фосфатиды-растворитель 1:5), остаток

4 экстрагируют 1 раз хлороформ-метанолом (1:1) (фосфатиды-растворитель 1:10) . Хлороформ-метанольный экстракт отмывают дистиллированной водой (1/5 часть от объема экстракта). Водный слой отбрасывают. Нижний хлороформ-метанольный слой используют для выделения фосфоинозитидной фракции. Из

50 r коммерческих фосфатидов получают 24 г общих липидов, из них фосфолипиды составляют 59%, В состав фосфолипидов входят,%: фосфоинозитид 12; фосфатидилэтаноламин

29,5; фосфатидилхолин 36,7; фосфатидная кислота 8,8; фосфатидилглицерин 2,3; полиглицерофосфатиды 2,2; дифосфатидилглицерин 2,2; дифосфоинозитид 1,7; лизофосфатидилхолин 2,1%.

Выделение фосфоинозитидной фракции.

Общий липидный экстракт доводят до концентрации 30 мг/мл хлороформ-метанолом 1:1 (24 r общих липидов растворяют в 720 мл системы), смешивают с 200 г окиси алюминия (1 40/250 й, щелочной, для хроматографии, Чехословакия; соотношение сорбент : липиды

8:1), выливают в воронку Бюхнера и элюируют.лецитиновую фракцию 3,6 л хлороформметанола (1:1), отсасывая ее вакуумным насосом в колбу Бунзена. Фракцию отбрасывают.

Фосфоинозитидную фракцию (фосфоинозитид, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, полиглицерофосфатиды, дифосфатидилглицерин, дифосфоинозитид и гликолипиды) элюируют 12 л хлороформ-метанола (1:1) с добавкой

15% от объема 1%-ного водного уксуснокислого аммония (фосфатидная кислота этой системой не элюируется). К полученной фракции добавляют 1/5 часть дистиллированной воды. После отстаивания верхнюю водную фазу отбрасывают, Нижнюю хлороформную фазу концентрируют досуха на роторном испарителе. Выход фракции 6,38 г.

Выделение фосфоинозитида.

5 г фосфоинозитидной фракции растворяют в 80 мл хлороформа, смешивают с 40 r силикагеля марки L 100/250 и (Чехословакия), высушивают на роторном испарителе до сыпучего состояния и засыпают на сухую колонку со смешанным сорбентом — ДЕАЕ-целлюлоза с силикагелем в соотношении 1 г исходной фосфоинознтидной фракции на 80 r сорбента.

Подготовка колонки, ДЕАЕ-целлюлозу (бисерный полимер, анионит, Венгрия) предварительно замачивают на

30 мин в 1 н. kCP, промывают последовательно 1 н, раствором НСР, водой и 1 н,. раствором гидроокиси натрия, трижды повторяют такую обработку, тщательно промывают один раз метиловым спиртом, помещают в ледяную уксусную кислоту на 1 сут, после чего отмывают метанолом до нейтральной рН. К гото950730 6

5 вой ДЕАЕ-целлюлозе в метаноле добавляют равное количество силикагеля марки Л 40/100/Й (Чехословакия), хорошо перемешивают и сра- . зу же выливают в воронку Бюхнера, растворитель отсасывают вакуумным насосом в кол-, бу Бунзена, после чего смешанный сорбент сушат в сушильном шкафу прн .температуре не более 70 — 100 С до сыпучего состояния.

400 r готового сорбента засыпают в колонку (отношение диаметра колонки к высоте сор-10 бента 1:1 — 1:2), слегка уплотняют, затем засыпают фосфоинозитидную фракцию, смешанную с силикагелем и сверху присыпают силикагелем марки 1 100/250 (Чехословакия) слоем

3 — 5 см, наверх кладут фильтр. 15

Для элюции используют: а) 2 колоночных объема (0,8 л) хлорофорб) 10 колоночных объемов (4,5 л) хлороформ-метанола 8:2. 20

Первые 3 колоночных объема (1,3 л) содержат гликолитпщы, нейтральные липиды и фосфатидилэтаноламин. Оставшимися семью коланочными объемами элюируют фосфатидилэтаноламин с чистотой около 97%. Выход фосфати- g5 дилэтаноламина 2 r. в) 6 колоночных объемов (2,75 л) хлороформ-метанола 2:8 используют для дочистки колонки.. г) 9,3 колоночных объемов (4 л) хлороформ-метанол — 25% аммиак 65:25:5. Первые

6 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатиды, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин и следы фосфоинозитида, отбрасывают. Оставшимися 3,3 колоночными объемами вымывают фосфоинозитид. Выход

35 продукта 1 г с чистотой 99%, что соответствует 80 o от исходного количества фосфоино» зитнда в соевых фосфатидах или 2,6% от исходного количества субстрата. .Пример 2. Получение экстракта про4Q водят как в примере 1.

Выделение фосфоинозитидной фракции про-: водят, как в примере 1. Соотношение липщтного экстракта и окиси алюминия (L 40/250 > 45 щелочной, Чехословакия) 1:3 (r/r). 24 r общего липидного экстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 72 г окиси алюминия. Выход фосфоинозитидной фракции 1,92 г (в 3,3 раза меньше, чем в 50 примере 1). В состав фосфоинозитидной фракции входят фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфатиднлглицерин, полиглицеро«. фосфатиды, фосфоинозитнд и фосфатиддая кислота. 55

Выделение фосфоннозитида.

Полученную фосфоинозитидную фракцию (1,92 г) растворяют в 20 мл хлороформа, смешивают с 15 r силикагеля (L 100/250 ь

1 (Чехословакия), высушивают на роторном испарителе до сыпучего состояния и засыпают на колонку (как в примере 1) со 100 г смешанного сорбента — ДЕАŠ— целлюлоза с силикагелем в соотношении 1:1, приготовленного как в примере 1. Соотношение фосфоинозитидной фракции и сорбента 1:55 (r/ã).

Для элюции используют. а) 5 колоночных объема (0,7 л) хлороформа. б) 20 колоночных объемов (2,8 л) хлороl форм-метанола 8:2.

Первые 7 колоночных объемов (1 л) содержат глнколипцц, нейтральные липиды и фосфатидилэтаиоламин. Оставшимися объемами элюируют 600 мг фосфатидилэтаноламина с чистотой 92%. в) 8 колоночными объемами (1,15 л) хлороформ-метанола 2:8 домывают колонку. г) 17 колоночных объема (2,4 л) хлороформ-метанол — 25% аммиак 65:25:5. Первые 8 колоночных объемов, содержащие полигли церофосфатид, фосфатидилглицерин, фосфоинозитид, фосфатидную кислоту, отбрасывают.

Оставшимися 9 колоночнымн объемами вымывают фосфоннозитид с примесью фосфатидной кислоты. Выход 130 мг с чистотой 70%.

Выход составляет около 8% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах.

Пример 3. Экстракт получают, как в примере 1.

Выделение фосфоинозитидной фракции.

Процедуру выделения выполняют, как в примере 1.

24. r общего липидного экстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 150 г окиси алюминия. Соотношение общего липидного экстракта и окиси алюминия 1:6 (г/r)

Выход фосфоинозитидной фракции 2,88 г (в 2,2 раза (45%) ниже, чем в примере Ц.

Состав фосфоинозитидной фракции, как в примере 2.

Вьщеление фосфоинозитида проводят по процедуре примера 1.

Соотношение фосфоинозитидной фракции и сорбента 1:40 (r/ã). 2,88 r фосфоинозитидной фракции отделяют на колонке с 120 г сорбента.

Для элюции используют: а) 2 колоночных объема (0,36 л) хлороформа. б) 5 колоночных объемов (0,9 л) хлороформ-метанола 8:2.

Первые 2 колоночных объема отбрасывают, Оставшимися объемами элюируют фосфатидилэтаноламин с фосфоинозитидом. Выход фосфатиднлэтаноламина 1 г, чистота 90%. в) 6 колоночными объемами (1,1 л) хлороформ-метанола 2:8 домывают колонку.

50730

7 9 г) 16 колоночных объема (2,8 л) хлороформ-метанол — 25% аммиак 65:25:5, Первые

8 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатиды, дифосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, фосфоинозитид, фосфатидную кислоту, отбрасывают. Оставшимися объемами вымывают фосфоиноэитид с примесью фосфатидной кислоты. Выход 200 мг

I с чистотой 90%, что составляет 12% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах, -Пример 4. Экстракт получают, как в примере 1.

Вьщеление фосфоинозитидной фракции.

24 r общего липидного экстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с

480 г окиси алюминия. Соотношение общего липидного экстракта и окиси алюминия 1:20 (г/г). Далее процедуру выполняют, как в .примере 1. Выход фосфоинозитидной фракции 6,24 г, Состав фосфоиноэитидной фракции, как в примере 1.

Выделение фосфоинозитида проводят, как в примере 1.

Выход 1 г с чистотой 99%, что соответствует 80% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах.

Пример 5. Экстракт получают, как в примере 1.

Выделение фосфоинозитидной фракции проводят по процедуре примера 1, Выделение фосфоиноэитида.

5 г Фосфоиноэитидной фракции смешивают с силикагелем tL 100/250/и, (Чехословакия), как в примере 1.

Подготовка колонки.

ДЕАЕ-целлюлозу готовят, как в примере 1, К готовой целлюлозе в метаноле цобавляют

2 части (от количества ДЕАЕ-целлюлозы) силикагеля марки 40/100 и. (Чехословакия), далее как в примере 1, 400 г готового сорбента засыпают в колонку, слегка уплотняют, засыпают фосфоинозитидную фракцию, смешанную с силикагелем. Соотношение сорбента и фосфоинозитидной фракции 80:1.

Для элюции используют схему по примеру1.

Выход фосфоинозитида 1 г, чистота 99%.

Пример 6. Экстракт получают, как в примере 1.

Выделенйе фосфоинозитидной фракции про. водят, как в примере 1.

Выделение фосфоинозитида.

5 г фосфоиноэитидной фракции смешивают с силикагелем L 100/250 ц. (Чехословакия), --Аак в примере 1.

Подготовку ко.ньчки проводят, как в примере 1. К готовой /1ЕАГ-целлюлозе в метано|ле добавляют 4 части (от количества ДЕАЕцеллюлозы) силикагеля 40/100 (Чехословакия) и далее процедуру выполняют, как в примере 1. Соотношение фосфоиноэитидной фракции и сорбента 1:80 (пример 1).

Для элюции используют: а) 2 колоночных объема (0,8 л) хлороформа. б) 10 колоночных объемов (4,5 л) хлоро10 форм-метанола 8:2. Фосфоиноэитид элюируется совместно с гликолипидами, нейтральными липидами, фосфатидилэтаноламином.

Для получения чистого фосфоинозитида колонка не годится.

Л р и м е р 7. Экстракт получают, как в примере

Выделение фосфоинозитидной фракции проводят, как в примере 4.

Выделение юосфоинозитида

20 5 г фосфоинозитиднойфракциисмешиваютс силикагелем, как в примере 1.

Подготовку колонки проводят, как в примере 1. К 5 частям готовой ДЕАЕ-целлюлозы добавляют 1 часть силикагеля L 40/100 и.

25 (Чехословакия), далее пооцедуру проводят как в примере 1. При этом колонка имеет рыхлую упаковку сорбента и происходит проскок вещества уже с хлороформа.

Для элюции используют:

a) 2 колоночных объема (0,8 л) хлороформа: наблюдают проскок фосфоинозитида уже в хлороформе. б) хлороформ-метанол 8;2, Фосфоинозитид элюируется с фосфатидилэтаноламином, нейтральными липидами, гликолипидами.

Для получения фосфоинозитида колонка не годится.

Пример 8. Предварительные процедуры, как в предыдущих примерах.

Выделение фосфоинозитида как в приме1, Соотношение ДЕАЕ-целлюлозы и силикагеля 10:1 (г/г). При элюции с колонки наблюдается проскок фосфолипидов уже в хлороформе и далее разделения не происходит. Поэтому для вьщеления фосфоинозитида такая колонка не годится.

Формула изобретения

Способ выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, включающий экстракцию фосфолипидов хлороформом и метанолом и очистку фосфоинозитида силикагелем, о т л и ч а55 ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, соевые фосфатиды подвергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, полученный экстракт отмывают водой, смешивают его с

Составитель М. Красновская

Техред М. Надь Корректор С. Шекмар

Редактор Н. Киштулинец

Тираж 388

ВНИИПИ. Государственного комитета СССР по делам. изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5892/27

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 950730 10 окисью алюминия в весовом соотношении gradient salt elution in à mixed solvent system.

1:8 и подвергают очистке на колонке с су- А of 8iol Chem, 1964, 239, 1369 — 1373. хим смешанным сорбентом — смесью силика- . 2. Киселев Г. В. Препаративный метод полугеля с диэтиламиноэтилцеллюлозой, взятых в чения фракций фосфоиноэитидов из ткани говесовом соотношении 1:1. ловного мозга. — "Биохимия", 1977, 42 (12), Источники информации, с. 2202-2205. принятые во внимание при экспертизе

1. Hendrickson Н. S. and 8at@u С. Е. Jon 3. G. Colacicco, m. Rapport,,1. Zihid Res.

exchange chromatography of intact brain phos — А simplified preparation of phosphatidyl

poinositides on diethylaminoethyl cellulose by — 1О inositog.1967, 8, (5), 513 — 515 (прототип).