Способ количественного определения @ -экзотоксина в инсектицидном препарате

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (1)962811 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву(22) Заявлено 12Р2ЯО (21) 3247273/30-15 с присоединением заявки Мо— (23) Приоритет

Опубликовано 30Р9Я2 Бюллетень N9 36

Дата опубликования описания 3009Я2 (51) М. Nn.з

G 01 N 31/08

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 543. 89. 062:

:543.544.632. .951.2(088.8) 5

С. Н. Бубенщикова, В. К. Каграманова, Л.A. Баратов, Э. Б.Данилова и Е. Б. Кругляк

С

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Р>--ЭКЗОТОКСИНА В ИНСЕКТИЦИДНОМ ПРЕПАРАТЕ

Изобретение относится к способам анализа инсектицидных препаратов и может быть использовано в сельском хозяйстве, ветеринарии, .микробиологической и медицинской промышленнос- ти, пои производстве и поименении инсектицидных птзепаватон, содержащих ф -экзотоксин, а также для санитарно-гигиенического контроля внешней среды.

Известен способ количественного опредепения ф-экзотоксина в инсекти ,идных препаратах путем биоиспытаний на тест-насекомых (1 ). Однако указанный способ требует дополнительного оснащения в виде инсектария или пункта, снабжающего исследователя тест-насекомыми. Промежуток времени, необходимый для получения ответной реакции живого объекта, исчисляется 1-2 нед.Погрешность определения 25%. Все это значительно ограничивает поименение метода как в практической, так и в исследовательной работе.

Известен также способ количественного опоеделения Ъ -экзотоксина путем хроматографирования препарата на анионообменной смоле с последующей эмоцией р -экзотоксина и УФ-спектроФотометрирования элюата(2).

Существенным недостатком извест5 ного метода является суммарное спектрофотометрическое определение мног.;х компонентов, сопутствующих р -экзотоксину и имеющих максимум поглощения, близкий к максимуму поглощения

Р -экзотоксина. В результате этого при спектрофотометрировании определяют поглощение смеси этих компонентов (продуктов деструкции р-экзотоксинов и др.) с р -экзотоксином, которое принимают за поглощение р -экзотоксина. Количество веществ, сопутствукицих .р -экзотоксину,.зависит от степени его очистки и от методов выделения. Вторым недостатком метода является длительная подготовка исследуемого образца к непосредственному количественному анализу.

Цель изобретения — чвеличение точности и чувствительности анализа

25 с Одновременным его ускорением.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения р, -экзотоксина используют смолу с размером частиц 7-15 мкм, а элюцию проводят пр:

962811

4 скорости 15-60 щт/ч. температуре

20-50 С и пои форме градиента кривой элюции У = Х ..

При работе со смолой, диаметр частиц которой меньше 7 мкм, пля -. достижения скорости элюции 15-60 мп/ч 5 .требуется значительное увеличение рабочего давления в .колонке, что приводит к быстрой потере проницаемости колонки и сокращает срок ее эксплуатации. Уменьшение же скорости элюции нежелательно, поскольку увеличивается продолжительность анализа.

Использование в качестве стационар.ной фазы частиц диаметром более

15 MKM значительно ухудшает качест-. во раздепени..:.

Наиболее оптимальной формой градиентной кривой является У =Х, при использовании которой удается достигнуть полного разрешения всех компонентов анализируемых смесей при минимальном уширении зон сорбции.

Применение линейной формы градиента У=Х с различным наклоном гоадиентной прямой обеспечивает хорошее отделение пика Д -экзотоксина

25 от слабо сорбируемых на колонке соединений, однако приводит к значительному размыванию зон сорбции веществ, имеющих величину времени

/ удерживания более 20 мин, что в 510 раз снижает чувствительность анализа.

Использование градиентной кривой У=Х+ не позволяет достигнуть хо рошего разрешения пиков, имеющих не- 33 большое различие времен .удерживания.

В частности, в.этих условиях происходит частичное перекрывание пиков соответствующих р -экзотоксиav и/ его лактону., 4О

Проведение элюции пои комнатной температуре (20оС) поиводит к размыванию зон сорбции, увеличению времени удерживания веществ на колонке, плохомч разрешению пиков. Проведение элюции при темпЕратуре выше 50ОC не желательно вследствие лабильности fb -экзотоксина при температуре выше 50ОС.

Проведение элюции при скорости потока 15 мл/ч нежелательно, так как увеличивается .время анализа и происходит размывание эон сорбции.

Элюирование при скорости потока

60 мл/ч значительно сокращает время анализа, но ухудшает разрешение пиков, имеющих небольшое различие времен удерживания.

Компоненты препарата идентифицируют по их поглощению при 260 нм. 6О

Количество р --экзотоксина определяют по величине поглощения в пике с определенным временем удерживания, определяемым по калибровочной кривой. 65

Для построения калибровочной кривой аликвоты стандартного раствора р -экзотоксина хроматографирун т и. определяют площади пиков по формуле

S=H N1i2.1 где Н вЂ” высота пика, И - ширина пика на половине высоты.

Величину калибровочного коэффициента определяют по формуле

К

S где К, — калибровочный коэффициент, С вЂ” количество i3-экзотоксина ! рассчитанное), внесенного в колонку, S — йлощадь пика.

Вычисление процента содержания

Р -экзотоксина проводят по формуле

S I(100

С.„= где U — объем нанесенного образца, мкл

A — концентрация растворенного . образца, мкг/мкл (мг/мл) .

Пример 1. Навеску 500 мг инсектицида с неизвестным содержанием -экзотоксина растворяют в

5 мл деионизованной воды, осадок отфильтровывают, а раствор в объе-. ме 10 мкл наносят на колонку (1,6 х х 150 мм ), термостатированную при

50 С с анионообменной смолой, диаметр частиц которой 7 мкм, в С1 -фооме и разделение осуществляют пои скорости потока .15 мп/ч в усло-, виях градиентной элюции при форме градиентной кривой У=Х двумя раст-. ворами, содержащими НС1 и NaCI в концентрации 0,0025 í. НС1 и

0.005 И NaCI (1), 0,01 н. НС1 и

0.2 М NaCI (2).

Детектиоование осуществляют в проточной кювете с объемом 8 мкл при длине волны 260 .нм. Время удеоживания р -экзотоксина 31 мин. Ошибка измерения + 34.

П о и м е о 2. Раствор образца в объеме 10 мкл, приготовленный аналогично описанному в поиметь 1, наносят на колонку (1.6 х 150 мм ) с анионообменной смолой с размером частиц 15 мкм в Ci — форме и разделение осуществляют в условиях, укаэанных в примере 1, при скорости элюции 60 мл/ч. Время удерживания р-экзотоксина 7 мин. Ошибка измерения f ЗЪ.

II р и м е р 3. Навеску (500 мг) инсектицида с неизвестным содержанием . ф "экзотоксина растворяют в 5 мл деионизованной воды, осадок отфильтровывают, а раствоо в объе ме 10 мкл наносят на колонку (1;6 х х 150 мм), тервюстатированную пби . ф C. с анионообменной сферической

962811

° .Таблица 1

Содержание ф-экзотоксина, %

Источник р -экзотоксина

Серия

Предлагаемый способ Спектрофотометрический способ

1,9

0,3

0,4

2,3

Культуральные жидкости

3,2

1,7. 2,.2

1,3

16,4

15,0

2,8

4,4

4,6

3,8

Инсектицид турингин

13,8

26,3

2,0

4,1

Ф смолой Фирмы "Hitachi" типа 2632

-с размеоом частиц 10 мкм в С1=форме и разделение осуществляют при1скорости потока 18 мп/ч в условиях градиентной элюции (форма градиент ной кривой У=Х ) двумя растворами содержащими НС1 и NaCE .в концентрации 0,0025 í. HCi и 0,005 M

МаС1 (1), 0,01 í. ВС1 и 0,2 М

NaCI (2).

Детектирование осуществляют в проточной кювете с. объемом 8 мкл при длине волны 260 нм. Время удерживания ф-экзотоксина 28 мин. Ощиб,ка измерения +5%.

Предлагаемий способ количественного анализа -экзотоксина отли- чается от известного спектрофотожтРического способа более высо-кой точностью, поскольку в результате хроматографии .инсектицидных препаратов в указанных выае усло. виях происходит полное разделение

УФ-поглощающих компонентов, содержащихся в анализируемой смеси, и отделение от них pi -экзотоксина. содержание которого далее рассчитывается путем построения соответ- ствующей калибровочной кривой зази1симости концентрации ф -экзотоксина от величины площади его пика на хроматограмме. При этом величина стандартной сцаибки определения не .превыщает 2,5-3,0%. В случае.анализа инсектицидных препаратов известным спектрофотометрическим способом для очистки препаратов и вы3,деления в-экзотоксина используют сорбцию на активированном угле и .неэффективную хроматографию на колонке с сорбентом ДОыех-1, что не позволяет получить Ь "экзотоксин в индивидуальном состоянии. Исследуемый спектрофотометрическнм способом элюат содержит, наряду с

Р -экзотоксином, значительное количество других УФ-поглощающих веществ, 10 образовавшихся в процессе биосинтеза инсектицида. В результате этого по суммарному поглощению растворов нельзя с достаточной точностью судить о содержании в них самого

15 р -экзотоксина.

В табл.1 приведены данные, полученные.предлагаеыям и спектрофотометрическим способами анализа серии кчльтуральиых килкостей выделен;р ных в тюиессе биосинтеза -экзотоксина а также препаратов инсектицида .турингина, действующим началом которого является р -экзотоксии.

В табл.2 в качестве .тжмеоа даны оезультаты, полученные пои анализе культуральной жидкости серии 3;

Чувствительность поедлагаемого способа анализа ф -экзотоксина позволяет.с указанной величиной стандартной омибки количественно опоеделять его пои содержании 0.1 мкг и более

° в анализируевюм образце. Спектрофотовютрический способ дает возмож.— .ность количественно -анализировать оастворы содетиканне не менее 100 мгк р -экзотоксина в анализиоуемой пробе

962811

Таблица 2

Относительная стандартная ошибка (К %

Величина стандартного отклонения (х/$) Количество р -э кзотоксина в пробе, мкг

Величина среднего арифметического (х) 6,52

6,85

0,12

6,50

1,84

6,27

6,19

6,70

Составитель Л.Рубинова

Техпед N. Надь Корректор Е. Рошко

Редактор С.Юско

Заказ 7498/62

Тираж 887 I1одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений .и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПЧП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная. 4

Способ количественного определения -экзотоксина в инсектицидном препарате путем хооматогоаФирования поепаоата на анионообменной смоле с последуюшей элюцией Р -экзотоксина и УФ-спектоойотометоиоования элюата„о т л и ч а ю щ и йс я тем. что, с целью увеличения точности и чувствительности анализа с одновоеменным его ускооением, используют смолу с оазмеоом частиц 7-15 мкм, а элюцию пооводят пои скооости элюции 15-60 мл/ч. темпеоатуое 20-50ОС и пои Фооме гоадиента ксивой элюции У=Х

Источники инФормации, принятые во внимание пои экспеотизе

1. Тонконоженко A.rI., Кац М.Б., Труды ВНИИВС, т. 63, с. 9-13, 1979.

2. RosenUerg G., CarIberg (., Су11епЬегу M.G.,1 AppI. Bacterioi, 34 2 ), 417. 1971.