Способ получения сорбента на основе целлюлозы

 

(71) Заявитель институт эпидемиологии и микробиологии им. Н;Ф.=-1=амалеи (")4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА НА ОСНОВЕ .ЦЕЛЛОЛОЗЫ

Изобретение относится к биотехно логии, а именно к способу получения сорбента для специфического связывания антител и антигенов.

Известен способ получения иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы, полученной переосаждением из медно-аммиачного раствора. Эти иммуносорбенты благодаря большой общей поверхности частиц обладают высокой емкостью, т.е. способны присоединять . большие количества антител (300900 мг йа 1 r сорбента )(1), Однако их существенным недостатком является невозможность использования в колонках, так как через слой таких иммуносорбентов водные растворы почти не протекают. Целью изобретения является получение высокоемкого препарата, способного пропускать ток жидкости.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента на основе целлюлозы, включающему переосаждение целлюлозы из ее медноаммиачного раствора с последующими активацией и коньюгацией с белком, 0,5-6,03-ный раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороформа при их соотношении 1:2,5 в присутствии 0,1-0,4б полиэтиленсорбитанмоноолеата переосаждают введением в 4-83ный раствор серной кислоты в ацетоне.

После присоединения белка к таким пористым целлюлозным шарикам был получен иммуносорбент,обладающий и высокой емкостью,и способностью пропускать ток растворителя.

На чертеже схематично изображено устройство, реализующее предлагаемый способ.

Пример 1. Приготовление шариков. 4,88 r свежеприготовленной

Cu(0H)< растворяют в 50 мл 15/-ной

ЙН ОН и добавляют 6,0 г целлюлозного порошка полученного из хлопчатника

3 968039 (СП=200). Раствор осветляют центрифугированием в течение 10 мин при

3000 o6/мин и используют для приготовления шариков двумя способами:

1. Получение шариков эмульгированием. 75 мл медноаимиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А, емкостью 0,5 л, куда налито 150 мл смеси хлороформ-бензол (1:2,5),содержащей

0 15 мл поверхностно-активного .ве- 1о щества (полиоксиэтиленсорбитанмонолеат-Твин-80). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируат 5 мин при

440 об/мин, После окончания эмульгирования смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий раствор (400 мл ацетона и 3? мл концентрированной серной кислоты.), налитый в сосуд Б (см. чертеж). Через 10 мин жидкость 2р сливают, а образовавшиеся шарики отмы.вают 10 объемами воды. Продукт Фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие частицы размером 100-280 мк.

25 .

2. Получение шариков распылением.

75 мл 61-ного медно-аммиачного раствора целлюлозы, в который добавлено

0,075 мл поверхностно-активного вещества (полиэтиленсорбитанмоноолеат-Твин-80 ).распыляют через пульверизатор при избыточном давлении 0,25 атмосферы в 200 мл ацетона, содержащего 10 мл концентрированной серной кислоты и помещенного в 0,5 л колбу с низким горлом. Затем жидкость сливают, а частицы промывают 10 объема-ми воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции размером 150-420 мк.

Активирование носителя. К 1 г отмытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 М NaJ04. Реакционнуа смесь слегка перемешивают

30 мин при комнатной температуре в

45 темноте. Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 мес.

Сочетание с белком. I г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл

0,1 И карбс>нат-бикарбонатного буфера (рН 9,0) и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или 400 мг белка раст-. воренного в 10 и этого же буфера. Для сочетания использовали иммуноглобулин

G кролика (3g Q, ), который может являться как антигеном, так и антителом. Смесь оставляют на 16-18 ч при

4 С. После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнера и препарат промывают 1 объемом

0,853-ного раствора НаСЕ. Затем к осадку для восстановления добавляют

100 ил 0,2 М НаВН4 в 0,853-ном растворе NaC E. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмывают 4500 мл 0,853-ного раствора

NaCl ИО мл 0,01 н. НС!> содержащей

0,853-ной МаС2 и 200 мл 0,<>53-ной

NaC1. Полученный иммуносорбент хранят в 0,8Я-ном растворе МаС! при

4ОС ° При необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.

Пример 2. Приготовление шариков. 4,88 г свеиеприготовленной

Cv(0H)1 растворяют в 50 мл 153-ной

NH40H и добавляют 1,5 г целлюлозного порошка, полученного из линта хлопчатника. Раствор осветляют центри- . фугированием в течение 10 мин при

3000 об/мин и используют для приготовления шариков двумя способами:

1. Получение шариков эмульгированием. 75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А,емкостью 0,5 л, куда налито 150 мл смеси хлоро<>орм-бензол (1:2.,5 ), содержа- щей 0,6 мл поверхностно-активного вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат - Твин-80 ). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируют 3 мин при 190 об/мин. После. окончания эмульгирования смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий,раствор (400 ил ацетона и 16 мл концентрированной серной кислоты ), налитый в сосуд Б. Через 10 мин жидкость сливают, и образовавшиеся шарики отмывают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содер><ащие частицы размером

100-280 мк.

2. Получение шариков распылением.

75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы, в который добавлено 0,3 мл поверхностно-активного вещества(полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат-Твин-80 ), распыляют через пульверизатор при избыточном давлении 0,25 атмос<»еры в

200 мл ацетона, содержацего 8 мл кон.цен рированной серной кислоты и поме5 9680 щенного в колбу на 0,5 л с низким горлом. Затем жидкость над частицами сливают и их промывают 10 объемами воды, Продукт фракционируют путеи оседания в цилиндре и отделяют фракции % размером 160-420 мк.

Активирование носителя. К 1 r отмытых целлюлоэных пористых шариков добавляют 100 ил 0,2 И éàÝ04 . Реакционную смесь легко переиешивают 30 мин 1© при комнатной температуре в темноте.

Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 ил воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по 15 крайней мере в течение 6 мес.

Сочетание с белком. 1 r активиро. ванных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл

0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера 20 рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или 400 мг белка,растворенного в 10 мл этого же буФера.

Для сочетания использовали иммуногло-.

-Таблица 1 форма носителя

Извлечено Ат мг на 1 r сухого, препарата

Концентрация целлюлозы Количество белка

Добавле- Фиксироно, мгlг валось, мгlг

В растворе, В -части4 . цах, 4

152

0 7

Суспензия 1,0 целлюлозы

434

100

936

400

175.193

6,0

2 9

Пористые целлюлозные шарики

100

288

100

1,7

3,0

292

100

25

0,7

1150

100

Количество целлюлозы в !00 мл свободно осевших частиц. осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 o6/иин. Полученный 1Ф-ный раствор целлюлозы используют. для приготовления шариков.

Пример 3. Приготовление ша5$ ри ков 1, 20 г свеже при готовл еннои

CU(AH)g растворяют в 150 мл 153-ной

МН4ОН, добавляют 2 г медицинской хлопковой воды (гигроскопичной ). Раствор

39 6 булин кролика (3< 5, который может

RBJlHTbcR как антигеном, так и антителом. Смесь оставляют на 16-18 ч при

40С. После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнера препарат промывают 1 обьеиои, 85 -ного раствора NaCE. Затем к осадку для восстановления добавляют

100 мл 0,2 М МаВН4 в 0,853-ном растворе NaCE. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной теипературе. Препарат последовательно отмыва:,ют 500 ил 0,853-ного раствора HaC t, 100 мл 0,01 í, HCE,cîäåðæaùåé 0,853,ной НаС7 и 200 ил 0,853-ной НаС7. Полученный иммуносорбент хранят в

0,853-ном растворе NaCE при 4 С. При необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.

Сравнение иммуносорбентов на основе известной суспензии и пористых шариков представлено в табл. 1.

В табл. 2 и 3 приведена характерис тика иммуносорбентов на основе целлюлозных пористых тел.

7 96803

Получение. шариков эмульгированием.

75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А емкостью

0,5 л,куда налито 150 мл смеси хлороформ-бензол (1:2,5), содержащей

0,15 мл поверхностно-активно о вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеатТвин-80 J. В сосуд опускают мешалку и смесь эиульгируют 5 мин при 440 об/

/мин. После окончания эмуль гирования 10 смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенери" рующий раствор (400 мл ацетона и 24 мл концентрированной серной кислоты ), на-. литый в сосуд Б. Через 10 мин жид- 15 кость сливают, а образовавшиеся шарики отмывают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие частицы размером 100"280 мк., 20

Активирование -носителя. К 1 г от" мытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 М Na30y. Реакционную смесь слегка перемешивают 30 мин прй комнатной температуре в темноте. уь

Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней иере в течение 6 мес. в

9 8

Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл

0,1 t1 карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или 400 мг белка, раст,воренного в 10 мл этого же буфера. пя соивтания использовали иимуногло булин у кролика.. Смесь оставляют на

16-18 ч при 4оС. После окончания сочетания избыток жидкости удаляют на воронке Бюхнера и препарат промывают

1 объемом 0,85 -ного раствора HaCt.

Затеи к осадку для восстановления добавляют 100 мл О,? М МаВНд в

0,853-ном растворе 14àÑE. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмывают 500 мл 0,853-ного раствора NaCE-, 100 мл 0,01 í. НСР, содержащей 0,853-ной 11аС и 200 мл

0,85" -ной МаГE. Полученный иммуносорбент хранят в 0,85Ж-ном растворе ,МаСУ при 4 С. При необходимости длио тельного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.

l

1 !

I.

1 !

I! ц I

1!!

О !

l

lQ

Э

I1

C IQ

lo IQ о.

1 о х

0 и!

О

IIи!

О Е

> о с

1

Ш о х

v с

Э

1X

IZ !

О о

Э

У

QI !

X м

L о ! о х

OO о

l2

9 о

I Х

1 о

1л

Iv о а о

<Э

X х

Э

CO с

lQ а

X а.

X

1и о

Y а

% !

О

Z о !

l

l

1 о л

1

1

1

I

X с

lQ о

6)

D с

X

X

Э

Р

1О

1 а о и о

Z л!

1Х о с и

tQ а о

1 !

1 ! !

l .I

Cl о и о х

1

X и (D

lQ

IZ

1 I о с и Э

X \C а

Х

<О И

L

X о

L о х с о !

О

Iи

Э г

Е

1 о

IX; и о

Э

=3

Z

X а

1

lQ

С !О

Э Ia IQ с а

lQ

lQ

X

1 лСО

-а.

СЧ

Э

Z

Э с

C и

lQ

1 о

1 о а

Й

Я Э с х

\ Z!

Г) !О о

Y а (Ц з и о с 1

) !

I

1 !

1 с

Э

S (Q а

Э

O. о (О

l(П

J)

6) о

IZ

Э о

Х Z и о

Х с и

Q !О с о.

1Л м о л

llQ

Cl

lQ

C (D а

1::

l,!

1О

lQ !

I — 1

I .

lQ х

l о

l

1 с о

1V д.4 о и ! и о !ч w гмбх а о э с

l8 IQ

1 m

Э о и ! ооо о

moe

vzн

968039 !

C) о LA

Я) 1

CV сч о л

-4 1Г\ м

° — - СЧ о л м о о о а в с !

1, о

Э

Я ! а

lE . I л с .А

1 ! Э

1 Ш

I Iи

I Э г

1 !О

1

1 П:!

I Э

I !

1

1 IQ

1 з

1 Э

I

I

1 !

l

-Г

1 ф ° в м л о о о LA м

868039.1,m 1, !

m 1

=Т 1

1 с

I! о 1

mal 1

t4 л

СЧ

3С

Z о

1 о,1 I

1

1 !

1 !

1

I

I

°

1 1

l

1 !

1

1

1

I о

Х

Ф у !!!

Е о м О м

О л

ОС

О

О л л ъо

О

CO

СО

I

I

I

1 l

1

1

CD 0

С4

CD л

00,о l2 о

Ф с о

ЬС!

1

I !

1

CD л С!

1Л л

CV л

CD л

М л

О л

CD!

CD л. л

1

I

I !

М\

LA

О

О л

1 m с

1 Q а!

1 t»

О О E

Х

1 II! С X

1 V Э

I Э I- Z

gXO !

- с

mzo

I x m

1 m 1

Y S о ао

I I- С !!!

1 X S

1 I- I- S

V.O Z

Ооm о сс

1 ыхm

ОМСК

1 1а Х о

xom

О

1 V Х Х

1 Ф >aÝ а Х!0 о

1 Е 1

1!! О 1zxm !

I u m

C 1

1 ф 1 а 1 с с! сц 1! ш»

1 О !!

1 а Х! х ч

О .а!

ЬС О!

X. O! ! е с.-!

I 1 1

1 ф 4

С 1 и 1 1

I m EI ,д ч

l OOl

С Х!

I 1 1

1 X 1

О М!

m ч!

С Х!

I ml

I CCI é

Л) I

I- 1 1

Z 21 1- ое

cII ml о ч

=г o! m э! х с! аа!

О Я! О!

С! 1:С! 0l!

I,I

1 I

1 1

1 1

1

1 1

l 1 ф4 1

X о

m x !

О У I с

O y I о

1 о о ! о cv

ХМ I

О о л ъС! сМ

+- С 4

1

I

l

I

1

1 !

1

1

1

1

1

1

1.

l !

l

1 !

1

I !

l

1 о л

LA 1

-;ф I С! 1

1 !

I

1

LA 1 л м 1 л

1

1

О I м

c4 I

I

1

1 (Ч 1

О 1

I

1

l !

LA

О 1

1

l

1 ) 1

I

13 ) 680

Характеристика синтезированных иммуносорбентов, В табл. 1 приведены сравнительные данные свойств иммуносорбентов в виде известной суспензии и предлагаемых иммуносорбентов на ос- s нове пористых целлюлозных шариков.

Ре аул ь т аты коло ночных опыто в с иммуносорбентами на основе пористых целлюлозных шариков приведены в табл.2.

Как . видно, из приведенных данных, 10 синтезированные иммуносорбенты по емкости не уступают иммуносорбенту на основе суспензии целлюлозы и способы присоединять от 250 до 1000 мг антител на 1 r сcоoр б енHтTа . . О0д нHа кKоo, в отли- М чие от известного, иммуносорбент на основе пористых целлюлозных шариков способен хорошо пропускать ток жидкости, что делает его пригодным для использования в хроматограйических 20 . колонках.

Использование предлагаемого способа получения иммуносорбента на основе пористых целлюлозных шариков имеет следующие преимущества: 25 основа для приготовления иммуносорбента готовится из дешевого сырья (, целлюлозы ); основа для иммуносорбента может выпускаться в акти виро ванном состоя - 34 нии и хранится многими месяцами; приготовление иммуносорбента на основе хранящихся целлюлозных шариков очень облегчено, т.е. потребителю достаточно добавить необходимый белок

39 14 (антиген или антитела ) и восстановить препарат; препараты иммуносорбентов обладают большой емкостью и не уступают в этом отношении известному, они могут хорошо пропускать ток жидкости, благодаря чему их можно использовать

Ip хроматографических колонках.

Предлагаемый иммуносорбент может найти широкое применение в,биомедицинской технологии. формула изобретения

Способ получения сорбента на основе целлюлозы, включающий переосаждение целлюлозы из ее медно-аммиачного раствора с последующими активацией и коньюгацией с.белком, а т л и ч а юшийся тем, что, с целью получения высокоемкого препарата, способного пропускать ток жидкости, 0,5-6,0 ьный раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороформа при их соотношении 1:2;5 в присутствии 0,1-0,4 полиэтиленсорбитанмоноолеата, переосаждают введением в

4-83-ный раствор серной кислоты в ацетоне.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Гурвич А.E. и др. Биохимия, M., 1961, с. т. 26, с. f34 (прототип), 968039

Составитель Т. Мартинская

Реаактоо Г, Волкова Техоед М. Коштура Корректор С. шекмар

«ЪЮ«» «P е «э «» » у» «»

Заказ 8026/36 Тираж 51Ч .. Подйисноее«

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

ll3035 Москва Ж-35 Раушская наб. д. 4/5

3 3 «у . сь 5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. проектная, 4