Способ получения тромболитических ферментов специфичных к фибрину
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советскик
Социалистические
Ресттубпкк
С 12 N 9/68 РтоударсткнныИ комнтет СССР II0 делам нзобретеннй н отнрмтнй Опубликовано 15,11,82. Бюллетень № 42 Дата опубликования описания 15 11 82 (53) "ДК 663.15 (088.8) (72) Авторы изобретения Н. С. Егоров, Н. С. Ландау и И. И.. Милованова J Московскии ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции.,.и,ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) Заявитель {54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ФИБРИНУ Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в медицине, микробиологической промышленности, гематологии и биохимии микроорганизмов. Известен способ получения протеаз фибрино5 литического, казеинолитического и тромболитического действия путем совместного культивирования двух микроорганизмов одного рода, но разных видов: Aspergi11us kanagawaensis — продуцента протеаз и Aspergi11us wentii — неак- Ið тивного в отношении образования секретируемых протеаз организма, которые вносят в равных количествах в питательную среду: А.kana— gawaensis — в виде посевного материала, а А. wentii — в виде вегетативного материала, инкубируют, отделяют клетки и из культуральной жидкости выделяют целевой продукт (11. Недостатками способа являются необходимость получения для Asperg i11us went i i не только двухсуточного посевного материала, gp иа трехсуточного вегетативного, что значительно (иа 3 сут) удлиняет лроцесс получения целевого продукта (7 — 8 сут). кроме того, невысокий выход пелевого продукта и сниже2 ние у целевого продукта специфичности к фибрину. Известен способ получения протеолитических ферментов казеинолитического и фибринолитического действия, предусматривающий совмето ное культивирование при 28 — 30 С микроорганизма — продуцента и микроорганизма — стимулятора, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высаливание целевого продукта сернокислым аммонием при насыщении 0,6 — 08, в котором в качестве продуцента используют Actinomyces rimosus, в качестве микроорганизма — стимулятора Actinomyces vio1aceus, а посевной материал обоих штаммов вносят в среду в соотношении 0,25:1 соответственно (2) . Недостатками способа (прототипа) являются длительность способа (6 сут), многокомпонентность состава среды и наличие в ней дефицитных и дорогостоящих реактивов, невысокий выход целевого продукта (фибринолитическая активность 1901 ед/мл, казеинолитическая активность (56 ед/мл), а также низкая специфичность к фибрину у целевого продукта (33,9). 4 ем на 28,8, фибринолитическим действием на 80% и тромболитическим действием íà 50% больше, чем в чистой культуре Nocardia spe— cies штамм 1. Увеличение ферментативной активности сопровождается возрастанием специфичности ферментов к фибрину (в 7 раз по сравнению с прототипом) . Пример 2. В известную синтетическую среду СР— 1 (состав среды приведен) после стерилизации вносят 5% по объему жидкого двухсуточного посевного материала Nocardia species штамм 1 и 1,25% по объему жидкого двухсуточного посевного материала Arthro— bacter citreus штамм  — 654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы. Культивирование смешанной культуры осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках (280 об/мин) при 30 С в течение 70 ч. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 3280 усл. ед/мл фибринолитической активности, 14,1 каз. ед/мл казеинолитической активности и растворяет тромбы за 1,6 ч. Для вьщеления фермента клетки отделяют от культуральной лсидкости центрифугированием и проводят высаливание ферментов сернокислым аммонием при насыщении 0,8 в течение 48 ч при 4 С. Выпавший осадок растворяют в воде, диализуют 24 ч при 4 С против 0,002 М ацетата кальция и лиофильно высушивают. Полученный препарат обладает специфичной активностью в 16450 ед/мг белка. В таблице представлена сравнительная характеристика ферментных препаратов, получен; способу. Поскольку в совместной культуре казеинолиз возрастает всего на 28,8%, фибринолиз на 80%,то резко (2 — 7 раз) увеличивается специфичность получаемых протеаз к фибрину. Наличие у целевого продукта высокой специфичности к фибрину имеет большое практическое значение, так как именно это свойство обеспечивает при. действии фермента in vivo возможность растворять тромбы крови ков крови, т, е. без гемофилии, которая представляет такую же опасность для жизни человека как и тормбоз. Таким образом, реализация изобретения продуцента, увеличить фибринолитическую активность и повысить специфичность целевого продукта к фибрину, 3 973615 Цель изобретения — ускорение процесса культивирования, увеличение фибринолитической активности и повышение специфичности ферментного препарата к фибрину. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тромболитических ферментов специфичных к фибрину, предусматривающему совместное культивирование при 28— 30 С микроорганизма — продуцента и микроорганизма — стимулятора, не синтезирующего t0 протеаз, последующее отделение клеток и высаливание целевого продукта сернокислым аммонием при насыщении 0,6 — 0,8, в качестве продуцента используют Nocardia species, штамм 1, в качестве микроорганизма — стимулятора Arthro-I5 bacter citreus, штамм  — 654, посевной материал обоих штаммов вносят в питательную среду в соотношении 1:0,5 — 1;0,25 соответственно, а культивирование осуществляют в течение 70— 72 ч. 20 Штамм  — 654 Arthrobacter citreus хранится, под этим номером во всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР (Институт физиоло. гии и биохимии микроорганизмов АН СССР). Пример 1. В известную синтетическую15 среду СР— 1 (глюкоза 2%, КЙОэ 0,1%, К НР04 0,005%, MgS04005%,NBCi 0,05%, СаСОз 0,1%, FeSOq 0,001%)после стерилизации вносят 5% по объему жидкогодвухсуточного посевного материала Nocardia species штамм 1 и 2,5% по 3Q объему жидкого двухсуточного посевного, материала Arthrobacter citreus штамм  — 654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы. Культивирование смешанной культуры осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл ных по способу прототипу и предлагаемому о со 100 мл среды на качалках (220 об/мин) при 28 С в течение 72 ч. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 3456 усл. ед/мл фибринолитической активности, 14,3 каз. ед/мл казеинолитической активйости 40, и растворяет тромбы за 1,5 ч. Для выделения фермента клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием и проводят высаливание ферментов сернокислым аммонием при насыщении 0,6 в течение 48 ч при 4 С. Выпавший осадок растворяют в воде, циализу- без гидролиза других жизненно важных белют 24 ч при 4" С против 0,002 М ацетата кальция и лиофильно высушивают. Выделенный препарат обладает специфичной активностью в 16500 ед/мг белка. Полученные результаты свидетельствуют о позволяет сократить время культивирования том, что в смешанной культуре микроорганизмов по предлагаемому способу происходит образование протеаз с казеинолитическим действи973615 Фибринолитическая активность, Ф КазеннолнтиТромболнтнческая активность Специфичность к фибриону Ф/К Вариант опыта ческая активность, К усл.ед. % каэ.ед. % время полного мл лизиса, ч Прототип Act. rimosus Act. чюйсеиа 1901 100 56 100 33,9 Предлагаемый способ Контроль Nocardia species/ 1920 100 11,1 100 3 100 172 9. Опыт Nocardia species/ Arthrobacter citreus В 654 3456 . 180 14,3 128,8 1,5 50 241,7 Составитель И. Привалова Техред Е.Харитончик Редактор И. Митровка КорректоР У. Пономаренко Подписное Заказ 8617/29 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения Способ получения тромболитических фермен- ЗО тов, специфичных к фибрину, предусматривающий совместное культивирование при 28 — 30 С микроорганизма продуцента и микроорганиэма— стимулятора, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высапивание целевого продукт» сернокнслым аммонием при насыщении 0,6-08, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения процесса культивирования, увеличения фибринолитической активности и повышения специфичности фер- ап ментного препарата к фибрину, в качестве продуцента используют Nocardia species, штамм 1, в качестве микроорганизма — стимулятора Arthrobacter citreus, штамм  — 654, посевной . материал обоих штаммов вносят в питательную среду в соотношении 1:0,5 — 1:0,25, соответственно, а культивирование осуществляют в течение 70 — 72 ч. Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР У 605826, кл. С 12 N 9/68, 1978. 2. Авторское свидетельство СССР У 436086, кл. С 12 N 9/48, 1972 (прототип).
