Способ получения изомальтулозы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

: WUIWHRN

РЕСПУБЛИК

09 (И) щ) С 12 P,19/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ 1 g. (Ц) 3210740/28-13 (22) 25.11. 80 (46) 07.04.83. Бюл. II 13 (72) КристоФер Бак и Питер Самуэл

Джеймс Читем (Великобритания), "(71) Тейт энд Лайл Пейтент Холдингс Лимитед (Бермудские острова} (53) 663 ° 15,. (088.8) (56). 1. Патент Великобритании

lI 1429334, кл. С 2 С, опублик. 1976.

2, Европейское патентное ot исание Ф 0001099,кл. С 12 9 13/02.П, Огаблик. 1979. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОИАЛЬТУЛОЗЫ путем Ферментативного превращения растворов сахароэы с использованием изомальтулозуобразующих микроорганизмов и последуащего вы" деления и кристаллизации иэомальтуло-. зы, отличающийся . тем, что, с целью повышения стабильнрстии продуктивности.изомальтулозуобра зующих микроорганизмов, последйие фиксируют путем включения в гель и используют для получения изомальту" лозы из растворов, содержащих 40"

553 (вес/об.) сахароэы.

1011

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве изо,мальтульэуобразующего микрооргвнизма используют Erwinia rhapontici штаммы

NCPPB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 29284.

Способ no n. 1, о т л и ч а юшийся тем, что изомальтулозу" образующий микроорганизм Фиксируют в виде целых клеток.

056

4. Способ по п. 1, о т л и ч à юшийся тем, что для фиксации ис" пользуют растворимый экстракт целых, или дробленых клеток изомальтулозу— образующего микроорганизма, 5, Способ по и. 1, о Т л ич а ю 1ц и и с я тем, что в качестве геля используют альгинатный гель. поЬочных процессов при аэробной ферментации микроорганизмов, которые приводят к образованию веществ, загрязняющих изомальтулозу, Цель изобретения - повышение стабильности и продуктивности изомальтулозуобразующих микроорганизмов.

Поставленная цель достигается согласно способу получения иэомальтулозы путем Ферментативного преьращения растворов сахарозы с использованием изомальтулозуобразующих микро,организмов и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы, изомальтулоэуобразующие микроорганизмы фиксируют путем включения в гель и используют для получения изомальтулозы из растворов, содержащих 40-553 вес/

/об. сахарозы..Для фиксации используют растворимый экстракт целых или дробленых клеток изомальтулозуобразующего микроорганизма.

В качестве геля используют альгинатный гель.

B предлагаемом способе используют иммобилизацию для закрепления фермента или ферментов, образующих ферментативную систему, участвующую в превращении сахарозы в изомальтулозу.

Можно испольэовать ферментативную систему, экстрагированную,из изомальтулозуобраэующего микроорганизма, наб

Недостатками указанных способов являются необходимость использования растворов сахарозы с концентрацией ниже 401 (предпочтительно около 253), недостаточно высокая продуктивность изомальтулозуобразующих мик" 4® роорганизмов, а также протекание !

Изобретение. относится к микробиологическому синтезу веществ и может быть использовано для Фермвнтативного получения изомальтулозы из сахарозы, которая может найти применение в пищевой промышленности.

Известен способ получения изомальтулозы из сахарозы микробиологическим способом при ферментации раство,ра, содержащего от 15 до 404 вес./ 10

/вес. сахароэы. Образующуюся изо" мальтулоэу выделяют Фильтрованием и кристаллизуют f1 ).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо; iS му эффекту является способ получения изомальтулозы путем фермента" тинного превращения растворов сахаро;, зы с использованием изомальтулозу-: . обрвэующих микроорганизмов, например щ

Protominobacter rubrum или Serratia

plymuthica и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы. Для ферментации используют раствор с содержанием сухого вещества от 5 до у

304, предпочтительно от 20 до 273, причем сахароза составляет от 90 до 984 сухих веществ. Кроме Protomi-, nobacter rubrum u Serratia plymuthica могут быть использованы Serratfa

marscescens Frwinia carotovora или

Leuconostoc mesentегоides в качестве иэомальтулозуобраэующего микроорганизма g2).

Кроме того, в качестве изомальтулозуобраэующего микроорганизма используют Erwinia rhapontici штамма

NCPPB 1578в NCPPB 139э NCPPB 1739 или АТСС 29284.

Изомальтулозуобразующий микрооргат низм Фиксируют в виде целых клеток.

6 4 ю

3 101105 пример целые или дробленые клетки микроорганизма, при этом клетки служат носителем для ферментативной системы.

Некоторое деление целых клеток может происходить после иммобилизации, но желательно, чтобы способ иммобилизации и другие параметры процесса были выбраны таким образом, чтобы деление отсутствовало или было минималь- io ным.

Для иммобилизации ферментной системы могут быть использованы различные способы, но наиболее удобным является задержание в геле, поскольку этот способ пригоден для иммобилизации ферментативно-активного экстракта клеток, а также целых или дробленых клеток. Подходящие материалы для геля включают альгинат полиакрил >О амид, агар, смесь ксантановой смолы ( смолы лжеакации, каппа-частицы карагенана или смесь каппа-.частиц караге. нана), смолы лжеакации, коллаген или ацетатцеллюлозу. Из этих материалов альгинатный гель, в частности гель альгината кальция, дает наилучшие результаты. Иожно использовать другие альгинатные гели, например те, которые образуются с другими металлами 1 1 группы.

Гель альгината кальция характеризуется высокой скоростью проникающей диффузии сахаровы и низкой скоростью утечки наружу целых клеток и белка.. ,Дополнительным преимуществом является исключительная стабильность изомальтулозуобразующей активности у фиксированных целых клеток.-Полупериод активности клеток, задержанных в геле альгината кальция, достигает

4О

10000 ч, причем.8500 ч является типичной величиной, в то время как самый длительный полупериод в сравнимых yc" ловиях при других способах иммобилизации составляет ниже 1000 ч., .4э

Кроме того, иммобилизация в альгантном геле не приводит к существенной потере активности.

Для иммобилизации ферментативной системы (самой по себе, либо в целых или в дробленых клетках) в альгантном геле смешивают ферментативную систему с водным раствором растворимого альгината, например альгината натрия. Оптимальной процедурой является суспендирование целых клеток с растворимым альгинатом. Концентрация клеток составляет .1-903 влажного веса к объему, более оптимально 10-40, еще лучше 20 .

Наиболее приемлемые концентрации растворимого альгината для использования с целыми клетками ияи с дру" гиии видами ферментативной системы составляют 1-103 (вес./об.), более предпочтительно 53С вес./об).

Полученную, альгинатную смесь дозируют в раствор соли металла,- с которой растворимый альгинат образует гель..Если гелем является альгинат кальция, то подходящие соли включают хлористый кальций концентрацией 0,01"

1,0 И, предпочтительно 0,05-0,5 М или 0,1 M. Температура раствора соли металла при дозировании 15-40 С, предпочтительно около 30 С,. раствор перемешивают. Стабильность фиксиро" ванной ферментативной системы увеличивается, если раствор соли металла содержит также некоторое количество растворенной сахарозы, например

5-403 (вес./об.) сахарозы, предпочтительно 203.

При дозировании суспензии или другой альгинатной смеси в виде отдельных капель можно .получить сферические гранулы геля, удерживающего ферментативную систему. Размер гранул может изменяться, но для легкости обращения и для обеспечения высокой эффективности переноса массы при использовании, желательно использовать гранулы диаметром 3-5 им. Однако размер и форма имеют мало значения. Можно фиксировать ферментативную систему в блоке геля (который для использования навивают на форму или нарезают на части), либо в микроволокнистых частицах (при использовании условий высокого градиента при дозировании альгинатной смеси).

Используют и другие гели.

Каппа-карагенан или смесь каппакарагенана смолы лжеакации используют в таком же способе, который использовали для альгината, за тем исключением, что раствор, в который экструдировали клеточную суспензию; представляет собой смесь 1И СаС1 < и 1 M КС1 при 20ОС.

Агар получают путем кипячения 3Æ (вес./об.) агара в деионизованной воде, охлаждают полученный гель до

50"С добавляют суспензию клеток и экструдируют полученную суспензию по каплям в ледяную воду.

011056 4 кулярным весом ° Можно использовать мутанты бактерий природного происхождения.

Иэ штаммов, принадлежащих роду

Erwinia, желательны штаммы Е,phapontici, которые хранятся в Британской Национальной коллекции растительных патогенных бактерий по ре1гистрационным номерам Ф CPB 1578, 50

S 1

Смесь ксантана/смолы лжеакации получают с помощью методики, что и для агара, но смолу нагревают до

80 С, а гель перед добавлением клеток охлаждают до 60 С.

Используют полиакриламид по способу 4ибаты (Chibate et al, (Methods

in Enzymology, 44, 1976, р. 739).

Для иммобилизации целых или дробленых клеток изомальтулозупродуцирующего микроорганизма можно использовать другие способы иммобилизации.

Например, клетки можно физически адсорбировать на инертном носителе;.: ковалентно связать их с инертным носителем; агрегировать с помощью по" перечно-сшивающего реагента, при этих способах, однако, сохранение активности и стабильность активности ниже. Вместе с тем эти способы иммобилизации обладают другими преимуществами. Так, при адсорбции клеток на целлюлозе жидкость, полученная после превращения, кристально прозрачная, что свидетельствует о том, что все примеси адсорбированы ДЕАЕцеллюлозой.

Иммобилизация дробленых клеток или растворенных экстрактов фермен" тативной системы позволяет полностью избежать клеточного деления, про" исходящего во время их использования, благодаря чему устраняется рас" трескивание гранул и блокировка пор, что иногда происходит при делении фиксированных целых клеток внутри гранул геля альгината кальция. Более того, при фиксировании дроб" леных клеток или растворенных экстрактов начальная активность являет" ся более высокой, что показывает отсутствие неповрежденных мембран стенок клетки, которые могут действовать как барьер, препятствующий диффузии сахарозы или иэомальтулозы. Дробление можно осуществить с помощью шаровой мельницы или другой обработкой целых клеток.

Источником ферментативной системы, используемой для иммобилизации, является изомальтулозупродуцирующий микроорганизм рода Erwinia. Можно использовать бактерии других родов - Servatià plymuth1са или Protaminobacter rubrum, но первый иэ названных возможно является патогенным для человека, а последний склонен продуцировать нежелательный красный пигмент с малым моле10

1S

23

3S

N CPPB 139 и N CPPB 1739. ШтаммаСРРВ

1578 хранится в Американской коллекции типов культур под регистрационными номерами АТСС 29283.

Йтаммы И СРРВ 1578, 139 и 1739 являются наиболее перспективными, поскольку обладают более высокой специфичностью продуцирования, большеи первоначальной активностью и стабильностью по сравнению с другими штаммами Erwinia или с другими штаммами других родов.

Способ проводят как непрерывный процесс путем загрузки зафиксированной ферментативной системы в колонну и пропускания субстрата сахарозы в виде раствора через колонку или несколько колонок, установленных параллельно, например, на карусели. Размер колонки больше 20 мл. При обычном превращении сахарозы в изомальтулозу образуется некоторое количество двуокиси углерода. При использовании зафиксированных целых клеток легче выводить этот углекислый гаэ, если жидкость пропускают через колонку вверх.

Пропускание жидкости вверх способствует ожижению слоя зафиксированной ферментативной системы и позволяет из" бежать уплотнения, которое возможно при пропускании жидкости вниз.

В качестве субстрата используют раствор сахарозы, содержащий не менее 30 3 предпочтительно не менее 40 и лучше всего неменее 503 вес.об. сахаровы.

Стабильность (измеряемая временем полупериода жизни ферментативной системы синтеза изомальтулозы в зафиксированннх клеткахувеличивается сувеличением концентрации сахарозы, аналогично увеличивается концентрация изомальтулозы в конвертированной жидкости.

На фиг. 1 изображен график зависимости стабильности зафиксированных клеток от концентрации раствора саха розы; на фиг. 2 - влияние концентрации сахарозы на продуктивность зафиксированных клеток.

Данные полученыпри использовании гранул альгината кальция с зафиксированным штаммоя E.rhapontici N СРРВ 1739.

56 8

7 1 0110

При увеличении концентрации сахарозы выше 30-404 стабильность и продуктивHocTь существенно возрастают, что обусловлено главным образом свойством зафиксированной изомальтулозуобразующей ферментативной системы, а не особенностями способа фиксирования.

Способ иммобилизации с использованием альгината кальция в этом случае дает лучшую стабильность. 1О

Кроме того, высокая концентрация сахарозы способствует йнгибированию деления зафиксированных клеток и предотвращает микробное заражение, облегчает выделение продукта и умень- % шает объем обрабатываемой жидкости.

Верхний предел вязкости раствора

-заключен.от 100 до 1000 сП, как правило около 500 сП.

Для способа с использованием кле- щ ток, зафиксированных в гранулах геля альгината кальция, концентрация сахарозы в исходном материале составляет около 554 (вес./o6.) .

Субстрат не обязательно должен быть раствором чистой сахарозы, вместо последней можно включить в раствор до 15 (об./об.) мелассы или использовать материал, получаемый на, сахарном заводе, или "родственный зо сироп", причем эт два типа примесей получают при обычном рафинировании сахара.

Превращение сахарозы в изомальтулозу проводят при 15"40ОС, более ,предпочтительно при 20-35 С, особено но приемлема температура около 30 С; рН раствора сахарозы 5-9, наиболее предпочтительно около 7. Превращение в изомальтулозу обычно приводит к закислению среды, но на. практике обычно нет необходимости включать стадии для поддержания значения рН в пределах от 5 до 9. 8 любом случае образование кислоты обычно уменьшается при увеличении концентрации субстра« .м та.

Способ проводят так, чтобы осу ществлялось в контролируемой степени превращение сахаровы в изомальтулозу и в сопровождающие продукты.

При увеличении времени пребывания сахарозы в контакте с зафиксированной ферментативной системой увеличивается степень превращения до практического максимума от 85 до 1003 саИ харозы превращается в продукты

Однако максимальная продуктивность необязательно достигается при самой высокой степени превращения,по-. тому что большая пропускная способность и более высокая активность, полученные благодаря меньшему времени пребывания, могут компенсировать потери при работе не с максимальным превращением.

Таким образом, максимальная про-, дуктивность достигается при работе не с максимальным превращением, а обычно при превращении в продукты от 70 до 953. Для гранул альгината кальция с зафиксированными клетками Erwinia обычно наблюдается максимум продуктивности, если работают при превращении от 80 до 903.

На фиг. 3 изображен график эависимости продуктивности зафиксированных клеток от исходного процента превращения (т.е. процент превращения проэкстраполирован назад к нулевому времени ).

Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками Е.rhapon;tici N СРРВ 1739..Имеется заметный максимум продуктивности вблизи значения от 85 до 903 степени преварщения сахарозы в изомальтулозу и в сопутствующие продукты.

Степень превращения сахароэы в продукты значительно влияет на стабильность изомальтулозуобраэующей ферментативной системы зафиксированных клеток. Стабильность может экспоненциально возрастать при увеличении степени превращения концентрированного раствора сахароэы.

На фиг. 4 изображен график зависимости полупериода жизни зафиксированных клеток от исходного процента превращения (при 553-и превращении раствора сахарозы).

Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками E.rhapontici

N СРРВ 1739.

Стабильность возрастает экспоненциально.до значения примерно 8500-ч при 904-м превращении.

После получения иэомальтулоэы .ее можно закристаллизовать либо очистить другим образом.

Для пищевых и родственных продуктов можно использовать эакристаллизованную изомальтулоэу, которая не обязательно должна быть чистой, в некоторых случаях можно использовать

1105" 10! о

И

2$

Количество (г/л дистиллированной воды ).

Компонент

Сахароза

Пептон (переваренный казеин) 10

Мясной экстракт

iS

$$

9 10 незакристаллизованный продукт, содержащий примеси.

Пример 1. Клетки из культуры Erwinia rhapontici М СРР8 1578, АТСС 29283) разбавляют 10 мл фосфат" ного буфера. 0,10 мл полученной суспензии используют для посева на 200 м питательной среды в стериллизованных конических колбах с перегородками ем" костью 500 мл.

Состав среды указан в табл, 1.

Таблица 1

Колбы с посевами трясут со скоростью 120 колебаний в мин при 30 С в о течение 70 ч, затем собирают биомассу. Клетки собирают в стационарной фазе роста, но можно собирать в логарифмической фазе роста или в фазе смерти. Клетки центрифугируют при 15000ф10 мин при 30 С, получают примерно 1 г утрамбованных влажных клеток на 100 мл среды (если нужно обработать большие объемы ин" кулируемой среды, используют центрифужный ротор непрерывного действия, ° через который прокачивают среду со скоростью 100 мл/мин).

Собранные утрамбованные клетки суспендируют в растворе альгината натрия 5 (сухого вес./об.) в деиониэированной воде с тем, чтобы получить 20/ (влажн. Вес./об. суспензию клеток (вес клеток в граммах называют влажным весом (влажн.вес); приблизительно перевести в сухой вес можно путем деления на 5. Активности клеток выражены в расчете на грамм влажных клеток), Клеточную суспензию, экструдирую по каплям с высоты

10 см в перемешиваемый раствор хло- ристого кальция (0,1 t1) с температурой 30 С, содержащий 20/ (вес./об.у сахароэы, которая служит для стабилизации изомальтулозуобразующей активности клеток. Полученные гранулы перемешивают 1 ч, затем помещают в колонку (30 см высоты, 5 см в диаметре ), снабженную рубашкой охлаждения.

Затем готовят раствор сахарозы

55 (вес./o6,) в деионизованной воде и ДОВОДят рН ДО 7,0 с ПОМОщью 1р0 М

ЙаОН. Сахарный раствор прокачивают вверх через колонку при 30 С. При скорости потока сахарозы примерно

0,01 объемов пустой колонки/ч превращение сахароэы -в изомальтулоэу и другие продукты достигает равновесия. Равновесное состояние достигает" ся через 24 ч. К этому времени активность зафиксированных клеток составляет примерно 0,2 г продукта /г.влажн. клеток/ч. Стабильность клеток, выраженная как полупериод жизни, составляет примерно 1 год. Когда скорость потока сахарозы увеличивают так, что превращение снижается до 803, активность составляет примерно,0,325 г продукта/г влажн.клеток/ч.

Собирают элюат колонки, выпаривают примерно до 70> (вес./об.!, при 60 С, затем дают остыть, либо принудительно охлаждают при перемешивании, получая при этом маленькие белые кристаллы. Кристаллы можно выделить -быстрее путем затравки охлажденного раствора небольшим количеством сухой изомальтулозы. Кристаллы собирают Фильтрованием или центрифугированием и высушивают при 40 С и 700 мм рт.ст. в вакуумной печи. Продукт подвергают анализу, а затем испытывают. Кристаллы содержат 94,53 изомальтулозы, при этом одна молекула кристаллиэационной воды приходится на молекулу иэомальтулозы, остальное составляют другие сахара. Трехкратная перекристаллизация дает чистую изомальтулозу.

Если субстрат на 804 превращают в изомальтулозу и сопутствующие продукты, получают 88 г кристаллического продукта на 100 г сахарозного субстрата, а продуктивность колонки составляет 0,30 т сухого кристаллического продукта/объем колонки/

ГОД.

Во время рабочего использования количество жизнеспособных клеток иэ зафиксированных клеток быстро уменьшается: количество жизнеспособных клеток достигает нуля примерно через 500 ч рабочего использования.

После этого периода не остается жизнеспособных клеток и не видно инволюционных Форм клеток, Несмотря на

11 ioiio сравнительно быструю потерю жизнеспособности, изомальтулозуобразующая активность зафиксированных клеток спадает независимо и намного медленнее с временем полураспада 354 дня.

Это показывает, что жизнеспособные клетки не нужны для образования иаомальтулозы, и, что возможно имеется единственный стабильный фермент, который превращает сахарозу в >О иэомальтулозу, для которого не требуется рециркулирование кофакторов или непрерывная регенерация источников энергии. Это подтверждается опытом, когда в качестве субстрата ис- 1% . пользуют в 55Ж-ной (вес./объем) сахарозе О,1 г/л хлорамфеникола, которий ингибирует синтез белка. Активность синтеза изомальтулозы не изменяется, но деление клеток прекра- 2О щается, даже при добавлении питательных веществ.

Можно вызвать новый рост клеток

Erwinia на месте посредством подачи питательных веществ в виде свежей р стерильной среды даже при использовании их в колонке непрерывно в течение долгого времени; изомальтулозуобразующая активность падает qo небольшой доли от ее первоначального значения. 8 этих опытах среду прокачивают вверх через колонку со скоростью

0,01 объемов пустой колонки/ч. Значительные количества СО выделяются при эfoM клетками, запиксированными в гранулах, значение рН отработанной з среды, вымываемой иэ колонки, падает до 4,4, наблюдается увеличение числа жизнеспособных клеток, как в гранулах, так и в отработанной среде, причем

40 анализ азота, как отработанной среды, так и гранул клеток, показал, что происходит рост клеток, После возврата назад к 553-ной сахарозе в качестI ве субстрата изомальтулозуобразующая активность гранул возрастает в некоторых случаях до уровней, превышающих первоначальную активность . Нет доказательств образования фермента в исходных клетках, но есть факт, что регенерация вызвана исключительно ростом клеток. Степейь восстановления активности гранул пропорциональна числу жизнеспособных клеток, оставшихся непосредственно перед добавлением питательных веществ, и никакоИ го восстановления активности не наблюдают в гранулах, которые использовали в течение столь длительных пе56 12 риодов времени, что все зафиксированные клетки сделались жизнеспособными (500 ч).

После рабочего использования регенерированных клеток в течение последующего периода активность колонки можно активировать аналогичным способом не менее 3-х раз. Воэможность регенерации колонок с зафиксированными клетками обеспечивает теоретически бесконечную стабильность колонки и говорит о том, что возраст зафиксированных клеток не зависит от пропускной способности субстрата.

Вместо подачи питательных веществ непосредственно после использования гранул в течение некоторого периода времени питательную среду можно подать в колонку непосредственно после фик" сирования. В этих опытах медленный рост клеток Erwinia происходит на месте. Когда фиксируют 13 (влажн. вес./об.) клеточный материал гранул, наблюдают 30-кратное увеличение числа жизнеспособных клеток, причем рост клеток происходит с временем удвоения 64 ч до окончания опыта, обус;. ловленного сильным ослаблением струк- туры альгинатного геля. Когда клетки используют таким образом, при частом восстановлении активности посредством

-обеспечения условий для роста клеток, внутренняя стабильность ферментативной системы меньшая, чем в том случае, когда не происходит рост клеток. Таким образом, фермент является намного стабильнее, когда клетка находится в псевдопокое или в состоянии сохранения, чем когда ей дают возможность делиться.

Пример 2. Используют основную методику примера 1 с дополнительной стадией, в которой собранные клетки дробят шаровой мельницей в течение 90 мин при 8 С перед фиксирова.нием. Исходная активность гранул такая же, как и при использовании целых клеток в примере 1, но полупериод жизни составляет примерно 170 дней.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, используя .другие штаммы изомальтулозуобраэующих микроорганизмов, в частности Erwinia rhapontici (й CPPB 1578, 139 и 1739 и

АТСС 29284), Erwinia caratovora var

atroseptica И CPPB 139, Erwinià dissolvens (М CPPB 1862 и 2209), Prota,minobacter rubrum (CSS 574, 77), Servatia masscescens (М С1В 8285)и

Пригод-. ность

Итамм

Е.rhapontici NCPPB 1578

13 1011

Serrat ia plymuthica (АТСС 15928) .

Измеряют специфичность, активность и стабильность зафиксированных штаммов. Затем, принимая во внимание патогенность микроорганизмов и тенденцию йродуцировать полимер или пигмент, исследуемые штаммы оценивают на пригодность их использования в способе по примеру 1.

В табл. 2 приведена пригодность 14 штаммов для получения изомальтулозы.

Табли ца 2

056

14

Продолжение табл. 3

1,18 415

1,17 650

0,82 4000

0,31 1935

60

Концентрация сахарозы, Ф, вес.об.

Активность г продукта/влаж вес кле ток/ч олуерид жини, ч

E.rhapontici NCPPB 139

Е.rhapqntici NCPPB 1739

+++++

+++++

Е.rhapontlci АТСС 29284 ++++

E.carotovora var atroseptica NCPPB 139

E.dissolvens NCPPB 1862

Е.dissolvens NCPPB 2209

Ser ra t i a p l ymu thi ca

АТСС 15928

Serratia marscescens

ЙС!В 8285

Protami nobac ter rubrum

CBS 574.77 +

Концентрация сахарозы, 4, вес.об.

Активность r ,продукта/

/влажн, вес кле ток/ч

Полупе" риод жизни, ч

12 5

0,4

0 7

47

200

Пример 4 ° Осуществляют способ по примеру 1, используя концент рацию сахарозы от 12,5 до 60ь(вес./

/об.). Активности и полупериоды жизни были измерены при исходном проценте превращения, равном 43.

В табл. 3":приведено влияние концентрации сахарозы на образований иэомальтулозы.

Таблица 3

2В Изменение концентрации сахарозы влияет на производительность фиксирующих колонок. Концентрация сахароэы влияет на активность зафиксированных клеток, причем концентрации

2$ свыше примерно 404 (вес./об.) оказывает ингибирующее действие. Стабильность (т.е. полупериод жизни) зафиксированных клеток существенно возрастает при увеличении концентраЗв ции сахарозы выше тех значений концентрации, кОторые использовали в предыдущих работах. Увеличение стабильности зафиксированных клеток прН увеличении концентрации сахаро3S зы перевешивает уменьшение активности, поэтому продуктивность колонки возрастает с увеличением концентрации сахарозы.

Ка равновесное отношение продуктов к сахарозе сильно влияет концент40 рация сахарозы s субстрате, причем наибольшее равновесное значение было получено при использовании 553-ой (вес./об. ) сахарозы. Таким образом, при использовании 553-ой сахароэы равновесное отношение продуктов к сахароэе составляет 13,2: l, что соответствует 933 превращения в продукты.

Пример 5. Способ осущест$Е вляют по примеру 1, используя клетки Еги1nia rhapontici N CPPR 1578, зафиксированные другими способами иммобилизации.

В табл. 4 показано влияние способа фиксирования активности изомальтулозуобразующих микроорганизмов на активность и полупериод жизни.

101 ц а 4

Табли

Ю Ю

Активность, г продукта/г влажных клеток/ч

Способ фиксирования

Полупериод жизни, 4

Альгинат кальция

8500

Ор325

400

570

Каппа-каррагенан/смола лжеакации

0,263

37,5

0,01

Костный уголь

0,34

Агар

Ксантан/смола лжеакации

0,10

Таблица 5

Штамм Е.rhapontici

Исходное превращение, 3

Активность, г продукта/

/r клеток/ч

Полупериод жизни, ч

Продуктивность, кг продукта/л объема колонки/1000 ч

59, 52

52,4

0,441

11 СРРВ 1578

11 СРРВ 139

11 CPPB 1739

0,389

54,4

1877

52,53

56,6

0,354

1840

47,77

ЕАЕ-целлюлоза 0,583

Полиакриламид 0,13

Клетки, агрегированные глутаровым альдегидом- Ое153

Пример 6. Н-метил-й -нитро-N-нитрозогуанидин (100 мг/мл) растворяют в 25 мл 0,10.И цитратного буфера при рН 6,0 при инкубировании в водяной бане при 37 С в течение

20 мин. Этот раствор затем добавляют к 50 мл профильтрованного питательного бульона, содержащего примерно 1 г свежесобранных клеток Е. rhapontici и СРРВ 1578. Затем клетки инкубируют

1056 16

30 мин при 37 С в водяной бане, потом их собирают и суспендируют в 43 сахароэной среде (табл. 1) в,течение о ночи при 4 С. Аликвоты (0,1 мл) поS мещают на 1,.54 (вес.o6.) агаровые чашки, содержащие сахароэу 43 (вес./

/об.), триптон 0,44 (вес./об.) и пептон 13 (вес./об.), значение рн кото-, рых было доведено до 7,0, инкубиро В ванне проводят 48 ч при 30 С. Отдельные колонии затеи пересаживают в колбы для встряхивания и проводят культивирование в течение 48 ч при

30 С при встряхивании при 120 об/мин, о

iS затем клетки собирают, подвергают испытанию и анализу. Иутантные штаммы . менее специфичны, чем первоначальные клетки., несмотря на то, что они продуцируют изомальтулозу.

20 Пример 7 Способ осуществляют по примеру 1, используя альгинатный гель, содержащий зафиксированные клетки СРРВ 1578, который либо превращают в гель в блоке и нареу зают на фрагменты, либо превращают в гель в виде непрерывного шнура и используют в намотанном на стержень виде или в виде нарезаных сегментов.

При использовании в колонке эти зафиксированные клетки не проявляют заметного различия в активности или стабильности по сравнению с клетками, зафиксированными в сферических гранулах.

Пример 8. Пример 3 йоказыЗ вает,.что наиболее пригодными явля1 ются штаммы Е.rhapontici. Последующее сравнение проводят в стандартизированных условиях, используя каждый иэ трех штаммов Е.rhapontici, зафик . сированных в альгинате кальция.

В табл. 5 приведена продуктивность разных штаммов E.rhapontici.

10110

Концен Удельная трация активбелка нэсть,г в экст-изомальрактах тулозы/ мг/мл мг белка/ч

Активность поверхностного слоя

Активность исходных клеток, г изомальтулозы/гвлажн веса/вес

Активность клеточных осколков,г. к

Способы разрушения изомальту" г изомаль г изомаль а а 1 лозы/гвлажн тулозыу г тулозы/ веса исход- влаж.веса мл экст

° а ных клеток/v исхбдных ракта/и (клеток/и (Встряхивание по

Микле

0»567

0,63

Осмотический

0е70

0,63

0,038

0,042

0,465

0,514 шок

Ультразвук

Обработка Тритоном Х"100

0,048 0,92

0,16

Пример 9. Ферментативную систему, ответственную эа превращение сахарозы в иэомальтулозу, экстрагируют растворителем из клеток

Erwinia rhapontici N CPPB 1578, % используя четыре разлиных способа, в частности встряхивание по Иикле (Mick1e), осмотический шок, ультразвуковую обработку или обработку детергентом. 10

Для встряхивания по Иикле 2 r навески свежесобранных клеток встряхивают с 2 r сухого песка и с 2 мл дистиллированной воды 20 мин при комнатной температуре, используя ус- 1S тановку для встряхивания Иикле.

Для способа осмотического шока

1,5 г навески клеток суспендируют в 10 мл деионизованной воды 30 мин при 1О С.

Для ультразвуковой обработки 2 г навески клеток суспендируют в 15 мл деионизованной воды.и обрабатывают

Иэ результатов, приведенных в табл. 6, видно, что при встряхивании, з

rio Микле в поверхностный слой попадает примерно 53 активности клеток, а остальная активность связана с клеточными осколками. Растворимый фер .ментный экстракт, т.е. поверхностный слой, обладает активностью 0,094 r продукта/мл/ч, удельной активностью

0,0027 г. продуктов/мг белка/ч и показывают двенадцать различных белковых полос при анализе с помощью полиакриламидного гелевого электрофореза.

Ферментативную систему можно более эффективно экстрагировать с по56 18 ультразвуком 30 мин, используя генератор диаметром насадки 2,5 см.

Для обработки детергентом исполь-. зуют 10 мл водного раствора Тритона

Х-100 (0,154 об./об.), чтобы обработать 0,5 г клеток.

После каждой соответствующей обработки полученные суспенэии подвергают центрифугированию при 17000 9. в течение 30 мин при 30ОС..

Клетки или клеточные осколки и поверхностный слой жидкости затем по отдельности Фиксируют на гранулах альгината кальция, используя общий метод примера 1.

Затем гранулы подвергают испытанию по отношению к 554 (вес./об.) сахарове для определения активности синтеза изомальтулозы. В табл. 6 приведена активность изомальтулозуобразующих микроорганизмов при разных способах разрушения клеток.

Таблица 60,094 0,094 32,6 0 0029.

0,253 3 0 0,0844

0,0056 1,99 0,0028 мощью осмотического шока клеток. С помощью этого способа экстрагируют примерно 93 клеточной активности, причем экстракт имеет активность

0,253 r продуктов/мл/ч и удельную активность 0,0844 г продукта/мг белка/ч. Более того, электрофорез в полиакриламидном геле показывает

ToJlbKo десять белковых полос. Сравнительно высокая чистота такого ферментативного экстракта вероятно обусловлена тем, что клетки не разрываются под действием осмотического шока.

Ферментативная система связана с мембраной и/или заключена в клет19 1011056 ке, причем более вероятным местом темы ниже, чем для свободных клеток расположения является периплазми- (554) или для зафиксированных клеческое пространство, особенно в си- ток, по-видимому, отражает изменение лу того, что осмотический шок явля- - внутренних свойств Ферментативной ется самым лучшим способом экстрак- g системы, зависящей от локализации. ции, а также потому, что такие связан" Когда ферментативную систему, экстные с периплазмическим пространстйом рагированную встряхиванием по Иикле, Ферменты, как кислая фосфотаза, так- используют íà 55K-ой(вес./об.) саже были экстрагированы при обработ- харозе, зафиксированный Фермент обке осмотическим шоком. >в ладает исходной активностью 0,0067 r

Из данных табл. 6 следует, что продукта/г гранул/ч и имеет полуйедробленые клетки обладают наиболь- риод жизни 620 ч, обеспечивая первошей активностью. Это, вероятно, вы- начальную степень превращения 81,53. звано устранением препятствия для Таким образом, использование преддиффузионного переноса субстрата, 1у лагаемого изобретения позволяет резко создаваемого стенками и мембраной не увеличить стабильность и продуктив- . поврежденной клетки. Однако нет су- ность изомальтулозуобразующей систещественного различия активностей, мы, как за счет ее иммобилизации в клеток, подвергнутых осмотическому геле, так и благодаря использованию шоку, нежизнеспособных клеток и све- в новых штаммов микроорганизмов рода жих жизнеспособных клеток, что на-, Erwinia, применению более концент" глядно показывает, что здесь не дей- рированных растворов сахарозы и боствует активная транспортная систе . лее полному превращению сахарозы в ма для притока сахарозы внутрь клет- целевой продукт. ки, поскольку такая система была бы зависима от интегрального метаболиз- Так, иммобилизация в геле альгима целой клетки и она могла бы быть, ната кальция позволяет увеличить врепо-видимому, утрачена при осмотичес- мя полужизни клеток от нескольких до ком шоке клеток. 8500 ч, а использование 45 и 553-х . Дальнейшее исследование свободно- растворов сахарозы приводит к 1,530

ro от клеток Ферментного экстракта, - 10-кратному увеличению стабильности полученного осмотииеским шоком, по- клеток по сравнению с опытами, в казало, что он имеет оптимальное зна- которых применяют 353,-".ые растворы, чение рН,.равное 7,0, оптимальную без существенного изменения активтемпературу 30 С и обладает макси- ности системы. Кроме того, изобре.мальной активностью для 353 вес./o6.) тение позволяет: использовать изомальраствора сахарозы. Тот факт, что тулозуобразующую систему микрооргаоптимальная концентрация субстрата низмов без культивирования и размнодля растворимой Ферментативной сис- жения самих микроорганизмов.

10 I1056

1011056

% р

® 7

Ъ

Р

Х

4Ó N М ЫУ и .гМе юрам мю лргУрщжвм

4 49 Ю У ЯУ Ф/

Az4

Составитель В. Иуронец

Редактор С. Вско Техред А.Бабинец Корректо А. эятко

Заказ 2516/55 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11)ОЯ Иосквад Ж-Я Раушская наб. g, 4Д

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.. Проектная, 4