Способ получения сорбента для очистки белков

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, включающий активирование неорганического кремнесодержащего материала --аминопропилтриэтоксисиланом , модифицирование полученного производного активированным водорастворимым декстраном с последугацей промывкой носителя и присоединение активного красителя, отличающийся тем, что,, с целью повышения сорбционной емкости сорбента и снижения неспецифической сорбции, активированный водорастворимый декстран перед модифицированием обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации 0,6-1,2 М в щелочной среде в течение 2,0-2,5 ч при 29-31°С, а модифицирование неорганичес1 ого носителя активированным декстраном проводят при соотношении 1 г носителя на 350-500 мг декстрана в течение i 3,0-3,5 ч при 78-80°С с последующей термической обработкой носите (Л ля в течение 15-20 ч при 90-95с. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при активации используют декстин с молекулярными массшли 20000 или 80000 или 500000 дальтон.

„„SU„„1061828 А

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

3(Я) В 01 Р 15 08 С 12 д

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ . =:з

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3401897/28-13 (22) 01.03.82 (46) 23,12.83. Бюл. (72) .В.A. Кадушявичюс, О.Ф, Суджювене и И.-Г.И. Песлякас (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной 3EI3EIмологии (53) 577.15(088 ° 8) (56) 1. Туркова Я. Аффинная хроматография. И., "Иир", 1980, с. 300.

2. Anderson P.À.,,>е>ч1ь

"Affinity purification of maIate

dehydrogenase and lactate dehydrogenas-e from pish nuscIe on microsph".гical рorо.>s сегamiс аdsorЬепьs," Biochem, Soc. Trans (1977 ), 55, р. 728-734. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, включающий активирование неорганического кремнесодержащего материала > -аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного пропзводного активированиым водорастворимым декстраном с последующей промывкой носителя и присоединение активного красителя, отличающийся те>л, что,,с целью повышения сорбционной е лкости сорбента и снижения неспецифической сорбции, активированный водорастворимый декстран перед модифицированием обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации

0,6-1,2 М в щелочной среде в течение 2,0-2,5 ч при 29-31ОC а модифицирование неорганического носителя активированным декстраном проводят при соотношении 1 г носителя на 350-500 мг декстрана в течение

3,0-3,5 ч при 78-80 С с последующей термической обработкой носителя в течение 15-20 ч при 90-95ОC.

2. Способ по п. 1, о т л ич а ю шийся тем, что при активации используют декстин с молекулярными массами 20000 или 80000 или 500000 дальтон.

1061828

Изобретение относится к области энэимологии и родственным ей областям и предназначается для создания способа получения сорбента, пригодного для очистки кофермент-зависимых ферментов и белков.

Известен способ получения сорбента для очистки кофермент-зависимых ферментов с использованием сефарозных матриц и активного красителя цибакрон голубого ФЗГЛ (1 ). 10

Однако возможность препаративного применения сорбентов ограничена недостатками используемой агарозной матрицы — ее дороговизной, низкой химической, механической и мик-. 15 мибиологической стабильностью.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения сорбента для очистки белков, включающий активирование неорганического кремнесодержащего материала — аминопропилтриэтоксисиланом, модифицирование полученного производного активированным водораст- 25 воримым декстраном с последующим промыванием носителя и присоединение активного красителя. По этому способу осуществляют раздельное активирование водорастворимого декстра на Т40 с BrCN в среде бикарбоната натрия при рН 9,0 в соотношении

50 мг BrCN на 200 мг декстрана, загрузку суспензии активированного неорганического носителя в колонку и его модифицирование BrCN активированным декстраном при рН 9,0 в соотношении 200 мг декстрана на

1,0 r носителя путем рециркуляции активированного декстрана через колонку в течение 24 ч с последующей промывкой модифицированного носителя 1 N NaCI, водой и присоединением активного красителя цибакрОн голубого ФЗГА и отмывки полученного сорбента водой (2 ).

Известный способ получения сорбента обладает рядом существенных недостатков.

Во-первых, способ получения сорбента обеспечивает возможность введения в сорбент 5-10 мкмоль красителя на 1 г сорбента, что не является достаточным при использовании сорбента для выделения и очистки ферментов, обладающих низким сродством к красителю. 1<роме тоro, данная максимально возможная концентрация красителя ограничивает возможность повышения сорбционной емкости сорбента по отношению выделяемых с с-"го помощью белков или ферментов. с последующей термической обработкой носителя в течение 15-20 ч при

90-95 С, а также тем, что при активации используют декстраны с молекулярными массами 20000 или 80000 или

500000 дальтон.

40 Для получения сорбента и его применения для очистки белков используют следующие основные материалы: макропористые силохро лы со средним радиусом пор 300-800 Л (производства Горьковского БНИИ НП), силанизированные силохромы С-80 и СХ 2,5 с содержанием первичных ill -групп

40-400 мк11/г, ïðoèýâoäñòâà НОО "Биозимреактив" ), краситель красно-ко50 ричневый 21<Т 1РТУ 6-14-198-69

g альбумин человеческой сыворотки (Реанал, БНР), гемоглобин (Мерк, ФРГ), цитохром с (Серва, ФРГ), голубой декстран 2000 (Фармация

Файн 1<эмикэлэ, швеция), декстран

55 4000 ("полиглюкин"), производства

Во-вторых, способ основан на использовании для активирования декст-, рана бромциана, что увеличивает опасность процесса из-за крайней ядовитости, В-третьих, при модифицировании носителя декстраHQM активированным

BrCN, образующаяся связь между носи- телем и декстраном является химически малостабильной, что ведет к потере присоединенного через декстран красителя при длительном использовании сорбента, снижению сорбционной емкости сорбента и увеличению неспецифической сорбции.

Целью изобретения является повышение сорбционной емкости сорбента и снижение неспецифической сорбции.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для очистки белков, включающему активирование неорганического кремнесодержащего материала

) -аминогропилтриэтоксисиланом, моднфицирование полученного производного активированным водорастворимым декстраном с последующей промывкой носителя и присоединения активного красителя, активированный водорастворимый декстран перед модифицированием обрабатывают эпихлоргидрином в концентрации 0,6-1,2 14 в щелочной среде в течение 2,0 — 2,5 ч при

29-31 С, а модифицироьание неорганического носителя активированным декстраном проводят при соотношении 1 г носителя на 350-500 мг дек, с. рана в течение 3-3,5 ч при 78-80 С

14инского з-да медпрепаратов), декстраны — 20000 (Ферак, Берлин), 80000 (ПНР), 500000 — (Лоба Хеми, Австрия).

Пример 1. Получение сорбента.

Г ктивирование неорганического носителя у - аминопропилтриэтоксисиланом.

1061828

T а б л и ц cl 1. 1олек улярная масса декст5р рана

39 0 345,0

45,9

20000

23,5

62,3

58,1

40000 бО

80000

77,1

92,1

81,5

50,0

500000

10 г неорганического носителя силохрома CX-2,5 заливают 10 r абсолютного ацетона, вводят 10 r г-аминопропилтриэтоксисилана и реакционную смесь перемешивают в течение

24 ч при температуре кипения смеси.

Продукт реакции отфильтровывают, промывают 4-5 раз ацетоном (по

50 мл) и высушивают. Получают

9,6 г аминопроизводного силохрома

CX-2,5 с содержанием аминогрупп 10

345 мкмоль/г носителя. Сокращением вре>лени реакции активирования получают аминопропильные производные неорганического носителя с содер>канием аминогрупп до 40 мкмоль/г. !

1одифицирование аминопропильного производного неорганического носителя активированными эпихлоргидрином декстранами .

В 5 мл 10%-ного раствора декстрана с молекулярной массой 80000 в 0,5 N HaOH вводят 0,24 мл эпихлоргидрина (конечная концентрация в реакционной смеси 0,6 М) и раствор перемешивают 2 ч при 29 С., Затем вводят 1,0 г аминопропилсилохрома

CX-2,5 (содержание аминогрупп

345 мкмоль/г), температуру реакционной смеси поднимают до 78 С и пес ремешива1от в течение 3 ч. Ilo завершении реакции носитель отфильтровывают, промывают 10 мл дистиллированной воды и выдерживают в течение

15 мин при 95 С. Носитель промывают водой 0 1 И НСР, водой, 0,1 I4

Ha.OH, водой и высушивают. Количество присоединенного декстрана состав-. ляет 92,1 мг/г носителя.

Присоединение активного красителя красно-коричневого 2КТ к декстраном модифицированно>лу силохрому 40

СХ-2,5.

К 20,0 г силохрома СХ-2,5, модифицированного декстраном 80000, 1прибавляют 50 мл воды, температуру смеси поднимают до 60 С и при пере- 45 мешивании прибавляют раствор 1,65 г красителя, например, красно-коричневого 2КТ в 140 мл воды. Перемешивание продолжают в течение 0,5 ч, после чего прибавляют 20,8 г хлористого натрия и реакционную смесь перемешивают при 60 С в течение 1 ч.

Температуру смеси поднимают до 80оC прибавляют 1,8 r натрия углекислого и перемешивают при 80 С в течение о

2,5-3 ч. Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой до прек11ащения вымывания красителя. Концентрация красителя в сорбенте составляет 23 мкглоль/г.

Содержание красителя в сорбенте определяют из разницы между взятым

его количеством по навеске и найденным в промывных водах измерением

I оптической плотности растворов при максимуме поглощения красителя

530 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 13500 И > см-".

Пример 2.. Получение сорбента проводят, как описано в примере 1 за исключением стадии модифицирования носителя активированными эпихлоргидрином декстранами, которую осуществляют следующим образом.

В 5 .мл 10Ъ-ного раствора декстрана с молекулярной массой 20000 в

0,5 Л1 ИоОН вводят 0„48 мл эпихлоргидрина (конечная концентрация

1,2 И) и раствор перемешивают 2,5 ч при 31 С. Затем вводят 1;О г аминоо пропилсилохрома СХ-2, 5 (содержание аминогрупп 345 мкмоль/г)„тем-. пературу реакционной смеси поднимают до 80 С и перемешивают 3,5 ч.

По завершении реакции носитель отфильтровывают, промывают 10 мл дистиллированной воды и выдерживают в течение 20 ч при 90 С. Носитель промывают водой, 0,1 К NHOI, водой, 0,1 М аОН, водой и высушивают. Количество присоединенного декстрана — 45,9 мг/r носителя.

Дальнейшие процедуры проводят по примеру 1. Концентрация красителя в сорбенте 22 мкмоль/г.

Пример 3. Получение сорбента проводят по примеру 1, но используют декстран с молекулярной массой 500.000 в концентрации

7 o-... .На 5 мл раствора декстрана берут 1 носителя. Соотношение

350 мг декстрана на 1 г носителя, Коли че ство дек ст рана, пр и соединенного по предлагаемому способу к аминопропилсилохрому СХ-2,5 в зависимости от содержания i,"-,2-групп в носителе и молекулярной массы декстрана представлено в табл. 1.

Количество декстрана, мг/г носителя

Содержание аминогрупп в исходном .носителе, мкмоль/г

1061828

Выход десорбции, Ъ

Количество декстрана, присоединенного к носителю, мг/г

Количество сорбированного белка, мг/г

Неспецифическая сорбция, В

Коли» чество белка десорбироааННОго 2И наСт, мг/г

Носитель.

Белок

Исходный амино пропилсилохром

СХ-2,5 (345 мкМ

NIt -групп/г) Гемоглобин, рН 8,0

1З,5

17,0

2,3

100

Цитохром с, рН 8,0

4,0 0,1

3,0

100 Силохром СХ-2,5 декстран 20000

45,9

Гемоглобин, рН 8,0 4,6

58,8

2,7

16,9

Цитохром с, рН 8,0

Гемоглобин рН 8,0

Силохром СХ"2,5декстран 40000

2,7

45,8

28,6

62,3

5,9 цитохром с

Силохром СХ-2,5декстран 80000

Гемоглобин рН 8,0

3,5

92,1

2,3

10,7

65,6

Цитохром с, рН 8,0

Силохром СХ-2,5декстран 500000

Гемоглобин рн 8,0

3,8

57,5

2,2

14,3

81,5

Цитохром с

Неспецифическая сорбция рассчитана, принимая за 100В-е количество гемоглобина или цитохрома с, недесорбируемого 214 NaCI с исходного немодифициоованного аминопропилсилохрома.

Подобранные условия активирования декстрана эпихлоргидриномконцентрация эпихлоргидрина 0,61,2 М, время инкубации 2,0-2,5 ч, температура 29-31 С, - являются о единственно возможными для осуществления способа, так как их изменение в сторону снижения не позволяет эффективно провести активирование и, как результат, к носителю присоединяется недостаточное количество декстрана. Изменение параметров в сторону увеличения приводит к поперечной сшивке декстранов, увеличению молекулярной массы и, как следствие, к невозможности их проникновения в поры носителя. Условия модифицирования неорганического материала активированным декстраном, ! а именно, концентрация декстрана в среде модифицирования, температура реакции и продолжительность с последуюцей термической обработкой

S являются также определяюцими для достижения максимального выхода модифицирования. При этом для достижения конечного результата получения модифицированного носителя важней10 шую роль оказывает именно сочетание ,условий активирования декстрана и условий модифицирования им неорганического носителя.

З табл. 2 представлены данные о неспецифической сорбции белков на исходном и модифицированном декстранами силохроме.

Таблица 2

1061828

При изменении молекулярной массы декстрана неспецифическая сорбция гемоглобина снижается от 28,6Ъ при использовании декстрана Т40 до 10,7Ъ при использовании декстрана Т80, а неспецифическая сорбция по основному белку цитохрому с полнос- тью исключается. Оптимальными являются предлагаемые декстраны:Т 20,Т80 и Т500.

Таблица 3

Количество сорбирован ного

Сорбированный белок, Ъ

Выход десорбции, Концентрация красителя в сорбенте, мкмоль/г, Количество декстрана, присоединенного к носителю, мг/r

Сорбент. Белок! белка,,мг/г

Альбумин 24,3

172Ъ 98,0

Лминопропилсилохром

СХ-2,5-декстран 80000красно-коричневый 2КТ

Гемоглобин

200Ъ 51,0

12,6

Цитохром с 11,0

23,0

62,3

89,0

24Ъ

Ами ноп роп илсилохром С- 80декстран

4000-краснокоричневый 2КТ

100Ъ

Альбумин 14,1

95,7

Гемо глобин

6,0 100Ъ

55,5

11,4

55,1

Цитохром с

100Ъ

79,8

8,9

40 вплоть до ее двукратного повышения по сравнению с известным способом.

Повышение концентрации красителя в сорбенте от 5-10 мкмоль/г до

22-23 мкмоль/г обеспечивает повышение сорбционной емкости сорбента

45 по отношению к белкам на 24-100-..

9.

Сорбент, получаемый по предлагаемому способу, обладает высокой эффективностью по,отношению коферментзависимых ферментов и обеспечивает во эможность по выше ни я удель ной активности гексокиназы за один хроматографический цикл в среднем

60 в 3-4 раза с выходом активности на

85-100Ъ. Емкость сорбента по отношению фермента составляет 86- .

150 ед./мл.

Совокупность перечисленных пре . му 5 щЮств определяет эффективность исДля определения пригодности сорбентов, полученных предлагаемым способом для очистки кофермент-зависимых ферментов и белков используют базовый препарат дрожжевой гексокиназы, полученный после автолиза пекарских дрожжей, кислотного фракционирования, двукратного фракционирования сернокислым аммонием, диализа и либфильной сушки.

Удельная активность очищенной на предложенных сорбентах гексокинаэы за одну стадию в аффинной хроматографии возрастает 3,2-4 раза. Выход фермента 85-100Ъ. Емкость сорбента

86-150 ед. фермента на мл сорбента.

Предлагаемый метод модифициро.вания неорганических материалов эпи ,хлоргидрином, активированными водорастворимыми декстранами обеспечивает воэможность введения в носитель 45-92 мг декстрана/г, что соз-. дает возможность варьированием соотношения модифицированный носитель — активный краситель изменять в широком интервале концентрацию вводимого в сорбент красителя

В табл. 3 приведены данные о сорбционной емкости сорбента в отношении белков при концентрации красителя соответствующих носителям, приготовленным известным и предложен5 ным способами, Данные свидетельствуют, что сорбционная емкость увеличивается на 24100Ъ.

Полученные сорбенты обладают .сниженной (до 10,7-16,9Ъ от исходной по отношению к гемоглобину) или нулевой неспецифической сорбцией (по отношению к цитохрому с) .

1061828

И

Составитель B. Муронец

Редактор H. Пушненкова Техред E,Kàñòåëåâè÷ Корректор И. Муска

Заказ 10097/6 Тираж. 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, москва, . Х-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 поль з овани я предла га емого способ а получения сорбента для его промышленного производства и использования в технологии получения высокоочищенных кофермент-зависимых ферментов и белков °